昆虫学报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&’’(，)（* +）：&,-.&)/ 0112’,),3-&4- %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%% 家蚕高密度连锁图谱的构建 !"#$ 张烈*，&，钱敏&，代方银&，赵爱春&，鲁成&，! （*M西华师范大学生命科学学院，珍稀动植物研究所，四川南充 -+/’’4； &M西南大学生物技术学院，农业部蚕学重点实验室，重庆 ,’’/*-）摘要：为了进行家蚕 -’(./0(’1+数量性状的NOP定位研究，以白色茧系品种5*’（’ "）和近交系大造（Q)’）（#）杂交得到R*，用R（*#）与双隐性标记的5*’（’ "）回交，得到回交一代（65*），用改进的7RPQ分子标记方法，经4-组选择性扩增引物扩增，获得分离比为*S（* 2$’M’)）的*/,,个7RPQ位点。用!"H!"=">?# NOTU*（4 V?#G:B=’M&4）连锁图谱构建软件，构建了具有(*,个标记，+-个连锁群的家蚕高密度7RPQ分子标记连锁图谱。该连锁图谱覆盖的家蚕基因组长度为*+’’) $!，连锁群长度变化范围为*’4M’W*)/+M/ $!，连锁群的平均长度为+-*M&) $!，其标记间平均图距*)M4( $!，最小图距&M+$!，最大图距,/M/$!，标记间大于+’$!的>"H共有+4个。该连锁图平均每个连锁群&+个标记，最多一个连锁群有4&个标记，最少(个标记。该连锁图谱确定了与经典实验遗传图谱第*)连锁群和X染色体连锁群相对应的两个连锁群。关键词：家蚕；分子标记；7RPQ；连锁图谱中图分类号：N4-- 文献标识码：7 文章编号：’,),3-&4（- &’’(）’+3’&,-3*& ! %&’(& )*’+,-& .,/ 01 23& (*)+405.（ !"#$%& #"’(）6,(&% 0’ !"#$ .,5+&5( YZ72[ P:?*，&，N072 !:=*，\70 R"=>3]:=*，YZ7^ 7:35%D=*，P_ 5%?=>（* *M 0=GE:EDE? BF K"#? 7=:9";G "=I Q;"=EG，5B;;?>? BF P:F? 1$:?=$?G，5%:=" X?GE 2B#9"; _=:L?#G:EA，2"=$%B=>，1:$%D"=-+/’’4，5%:="；&M ‘?A 1?#:$D;ED#"; P"UB#"EB#A BF 7>#:$D;ED#"; !:=:GE#A，\?H"#E9?=E BF 1?#:$D;ED#? "=I 6:BE?$%=B;B>A，1BDE%J?GE _=:L?#G:EA，5%B=>a:=> ,’’/*-，5%:="） !6(25,72：RB# GEDIA:=>NOPBFG:;bJB#9aD"=E:E"E:L? E#":EG，E%?U"$b$#BGG%AU#:IJ"GBUE":=?IJ:E% F?9";?BF" $B99?#$:"; #"$? 5 $#BGG:=> J:E% 9";? BF E%? F:#GE F:;:"; %AU#:I BF 5 "=I \"<"BC 6"G?I B= :9H#BL?I 7RPQ *’’ *’’ 9?E%BI，* /,, 7RPQ9"#b?#G := ">#??9?=E J:E%*S* G?>#?>"E:B= #"E:B（2$’M’)）J?#? BUE":=?I ?9H;BA:=>4- H":#G H#:9?#G，"=I " I?=G? ;:=b">? 9"H $B9HBG:=> BF+- ;:=b">? >#BDHG BF(*, ;B$: J"G $B=GE#D$E?I ?9H;BA:=> E%? !"H !"=">?# NOTU*4（V?#G:B= ’M&4）GBFEJ"#?C O%? EBE"; ;?=>E% BF E%? >#BDHG J"G *+ ’’) $! "=I E%? I:GE"=$?G U?EJ??= ;B$: J?#?&M+ EB,/M/ $!C O%? "L?#">? ;?=>E% BF E%? >#BDHGJ"G+-*M&) $!"=I E%? "L?#">? ;?=>E% U?EJ??= ;B$: J"G *)M4( $!，"=I B=;A +4 >"HG J%BG? I:GE"=$? U?EJ??= ;B$: J"G 9B#? E%"= +’ $! J?#? := E%? $B=GE#D$E?I 9"HC O%? =D9U?# BF ;B$: := E%? $B=GE#D$E?I 9"H #"=>?I F#B9( EB4& "=I E%? "L?#">? ;B$: BF E%? >#BDHG J"G &+C OJB >#BDHG BF E%? $B=GE#D$E?I 9"H $B##?GHB=I J:E% E%? *)E% "=I X $%#B9BGB9? BF E#"I:E:B="; ;:=b">? 9"HC 8&9 405%(：-’(./0 (’1+；9B;?$D;"# 9"#b?#；7RPQ；;:=b">? 9"H 遗传连锁图谱的构建是遗传学和育种研究的重图谱由于标记数量的有限，不能满足构建高密度遗要内容之一，构建高密度的遗传连锁图谱有助于加传连锁图谱的需要。&’世纪(’年代诞生的分子标快动、植物育种工作进程，特别是有助于动、植物数记技术，使构建高密度的分子标记遗传连锁图谱成量性状的改良研究。仅用形态标记构建的遗传连锁为可能，因此，利用各种分子标记技术构建分子标记基金项目：“4/+”计划项目（&’’)56*&*’’’）；四川省教育厅项目（&’’)7*’)）；西华师范大学科研启动基金项目（’)6’,’）作者简介：张烈，男，*4-,年生，四川巴中人，博士，研究方向为家蚕分子遗传与育种研究，839":;：<%"=>;:?’*@A"%BBC$B9C$= !通讯作者 7DE%B#FB#$B##?GHB=I?=$?，839":;：;D$%?=>@GJDC?IDC$= 收稿日期 K?$?:L?I：&’’/3’)3*)；接受日期 7$$?HE?I：&’’(3’*3&( P期张烈等：家蚕高密度@AB0连锁图谱的构建 5/? 遗传连锁图谱是遗传学和育种研究的重要途径之蚕的GHB定位研究。继!"#$%&’()后，构建了家蚕的一。在一些动、植物如家蚕 !"#$%& #"’（( !"#$%&’() DAB0（,)’ )* +,3，-..4）、D@0E（01"&2""+ )* +,3，-..4； *+$ ,)’，-../；01"&2""+ )* +,3，-..4；李斌等，5666；李斌等，5666）、,,D（:’*" )* +,3，5664）和 @AB0（朱玉万春玲等，566-；赵爱春等，566/）、波尔山羊（李祥芳等，566-；H*+ )* +,3，566-；赵爱春等，566/）标记龙等，566/）、中国明对虾 -)..)’"/).+)01 23(.).1(（1 王连锁图谱。这些家蚕分子连锁图谱的构建，为进一伟继等，5667）、玉米 4)+ #+%1（89+("#’#* )* +,3，步开展家蚕高密度分子连锁图谱的构建和利用研究 -..-；郝转芳等，5664）、水稻 5’%6+ 1+*(7+（:*;<’## )* 奠定了基础。这些已构建的各种家蚕分子标记遗传 +,3，-..7；熊立仲等，-..=）、大豆 8,%2(.) #+&（>9’& 图谱仅仅是一个框架图谱，都具有标记数较少，覆盖 )* +,3，-..?）、马铃薯 9",+.0# *0$)’"10#（纪颖彪和屈家蚕基因组较小等特点，因此这些图谱还不能满足冬玉，-..?）构建了标记密度不等的各种分子标记的家蚕分子辅助育种研究的要求。本研究采用实用品连锁图谱。这些分子标记连锁图谱的构建为基因的种I （白色茧）与广泛用于家蚕分子标记构图研究 -66 定位、克隆以及数量性状的遗传研究奠定了基础，对的基础品种大造（绿色茧）为材料进行杂交、回交，应其进一步的研究和利用有利于提高动、植物育种工用改进的 @AB0 分子标记方法以及 :*J :*+*K91 作效率和加快育种工作的进展。 GHL2-（. C91%’"+635.）（:*+#M )* +,3，566-）软件进行 @AB0分子标记技术是由 C"%等（-..4）在 DAB0 连锁分析，构建家蚕高密度 @AB0 分子标记遗传连技术和D@0E技术的基础上发展起来的一种高效分锁图谱，为进一步进行家蚕数量性状的 GHB分析和子标记。@AB0 分子标记技术既具有 D@0E 分子标分子标记辅助家蚕育种研究奠定基础。记技术的方便性又具有 DAB0分子标记技术的稳定与可靠性（王斌和翁曼丽，-..7），特别是在对生物遗 ! 材料和方法传背景不甚了解的情况下，利用 @AB0 分子标记技术对基因组各部分可能存在的 EF@序列变异进行 !"! 材料扫描，从而发现不同个体间的多态性。@AB0分子标作图群体：采用生态型差异较大的高交代实用记技术克服了 D@0E 分子标记技术的不稳定性和白色茧系品种 I （!）和西南大学家蚕基因库培育 -66 DAB0分子标记技术受探针来源的限制，因此，@AB0 的近交系大造（046）（）杂交得到 A ，用 A（）与 " - - " 分子标记可用于生物遗传研究分析的许多方面，如双隐性标记的 I （!）回交，得到回交代（8I ）。按 -66 - 遗传连锁图谱的构建，目的基因的定位、品种鉴别、家蚕常规饲育方法在 54N左右，给予良桑饲养，待分类和系统发育研究等多个方面。结茧化蛹后，随机取回交代（8I ）的//个个体，其中 - 家蚕 !3 #"’( 是重要的经济昆虫，作为生产已绿色茧 55 个（雌、雄各 -- 个），白色茧 55 个（雌、雄有五千多年的历史，作为遗传学研究材料，家蚕具有各--个）以及回交代的亲本同胞后代各 -6 个用于其他动物所不可替代的易于繁殖、饲养，繁殖后代数基因组EF@提取。量较多等优点。对家蚕的遗传学及其应用研究也积 !"# 主要试剂和酶累了较为丰富的经验，并保存了大量的品种资源，利 :1*!和 ;+?") 仪上进行。选择性扩增产物先用琼脂糖凝胶电泳检 #+5 @:9AB ;CDE,F -222分光光度计测定其浓度，然后测，防止扩增漏样，再用GW变性聚丙烯酰胺凝胶对用 ,$ 稀释，保证基因组 5%+ 的纯度（+ /+ ）在选择性扩增产物进行分离。分离加样前先加入G V 1G2 1=2 $ .3=左右。反应终止液，经<-U变性- :7L后，立即将其放入冰水中，待分离电泳液温度达到’2U时快速将分离样品加入到加样孔，分离电泳中电泳液温度保持恒温 ’2U。选择性扩增产物分离后，用银染法（参照 XAJ:D49 !9BI YR.-1 银染试剂盒使用说明书）显色检测变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。图. 家蚕基因组5%+电泳图 H74I . $8DEBAJCKJAD;7;C9BBDALJM;78NOJA:4DLJ:7E5%+ F：5%+分子量标准"/’()P#:9ANDA；.0=分别为样品（Q *A!）、（< *A!）、.（’ *A"）、.（G *A"）、1（G 6"）、1Q（6"）、RG（6!）和RQ （6 ）的基因组 5%+ ,KD 89LD; . BJ = ;KJODP 4DLJ:7E 5%+ JM ! ;78NOJA:（Q *A!），（< *A!），.’（*A"），.G（*A"），1G（6"），1Q （6"），R（G 6!）9LPR（Q 6!），AD;CDEB7SD8TI 图1 家蚕基因组5%+预扩增取完整基因组5%+ .22 L4加入’单位 !"#!限 H74I 1 $8DEBAJCKJAD;7;C9BBDALJMCAD9:C87M7E9B7JL 制性内切酶-QU温育1 K，再加入’单位 $%&!限制 JM;78NOJA:4DLJ:7E5%+ 性内切酶 G’U温育 1 K对基因组进行酶切，将其酶 .：没有预扩增引物5D8DB7JLJMCAD9:C87M7E9B7JLCA7:DA;；1：没有模板切产物在Q’U下保持.’ :7L，使内切酶灭活后，酶切的预扩增结果5D8DB7JLJMBD:C89BD5%+；-：5%+分子量标准5%+ 产物储于RU备用。取 ’ V酶切消化产物用 ,R 连 V9PPDA:9ANDA；R0.Q：部分预扩增结果XAD9:C87M7E9B7JL;JM;78NOJA: $ 7LP7S7PZ98;，AD;CDEB7SD8TI 接酶将双链接头连接到经酶切后的 5%+片段上，再用具有一个选择性碱基的引物对连接产物进行预扩 !"( 数据统计分析增。预扩增程序为：49";99;;9?;"?9;"9""?4@> //AB ?*：/>49"?9"9?;;?9"9;9"""?4@> CDAC -.：/>49";99;;9?;"?9;"9""94@> B*A* ?.：/>49"?9"9?;;?9"9;9""";4@> /.AB -@：/>49";99;;9?;"?9;"9"";4@> B*A* ?@：/>49"?9"9?;;?9"9;9"";"4@> /.AB -C：/>49";99;;9?;"?9;"9"?"4@> //AB ?C：/>49"?9"9?;;?9"9;9"""94@> /.AB -/：/>49";99;;9?;"?9;"9"?;4@> B*A* ?/：/>49"?9"9?;;?9"9;9""9"4@> /.AB -B：/>49";99;;9?;"?9;"9"?94@> B*A* ?B：/>49"?9"9?;;?9"9;9""9;4@> /DAE -D：/>49";99;;9?;"?9;"9"9"4@> B@A. ?D：/>49"?9"9?;;?9"9;9""9?4@> /.AB -F：/>49";99;;9?;"?9;"9";94@> BFAC ?F：/>49"?9"9?;;?9"9;9""?"4@> CDAC -E：/>49";99;;9?;"?9;"9"9;4@> BFAC ?E：/>49"?9"9?;;?9"9;9""?;4@> /.AB -*G：/>49";99;;9?;"?9;"9";"4@> B@A. ?*G：/>49"?9"9?;;?9"9;9"";?4@> /.AB -**：/>49";99;;9?;"?9;"9";?4@> B@A. ?**：/>49"?9"9?;;?9"9;9"";94@> /DAE -*.：/>49";99;;9?;"?9;"9"9?4@> B@A. ?*.：/>49"?9"9?;;?9"9;9""?94@> /.AB 根据形态标记将家蚕雌性个体（家蚕的雌性基 ,28OLH’ 91<7M5等命令进行连锁图谱构建。因型为杂合型 UV）赋予杂合型有带“!”标记，则雄性个体（家蚕的雄性基因型为纯合型 VV）赋予纯合 7 结果与分析型无带“"”标记；根据茧色形态标记将绿色茧（9 & 基因对白色茧为显性，应包含纯合子 9 W9 和杂合 75! 扩增结果 & & 子9 W: 两种基因型）赋予有带型“!”标记，则白色 75!5! 引物的扩增效果：从 *. 个 !"#!和 *. 个 & 茧（只包含隐性纯合子基因型:W:）赋予无带型“"” $%&!组合的*CC对双引物中筛选了EB对扩增效果较好的引物组合进行选择性扩增，经EB组选择性双标记。引物对所有个体进行选择性扩增，扩增效果见图 @ !5657 连锁图谱的构建：对符合*+*遗传分离比的和图C，共获得了F /..个扩增位点。每组引物平均 "),-标记采用RLM RL8LH’1 X?YZ*E（[’152<8GA.E）软扩增位点FE个，最多 *B* 个，最少 @* 个；不同组双件（RL8(\ ’# %(I，.GG*）进行连锁分析。连锁分析参引物间的扩增位点数量相差较大，引物组以-C组合数设置如下：!]GAGG*，使用其遗传连锁分析方式，的扩增带较多，平均扩增带*GB个，-*.组合扩增带选择 ^L&O&1<55 遗传模式，作图函数为 R<1HL8，RLO’ 图@ 部分选择性扩增结果 )2HI @ J’&<8KL3M(2N2&L=2<81?@A分子量标准<==>1?@AB477,/84/C,/；<：绿茧亲本大造!样品;4+,06?4D40；#：白茧亲本E<=="样品&,84+,06E<==； F：&点数大于@>位点数最大图距研究者作图群体 5678,329 (2.1; 71< 5678,3 5678,3- !+,310,71< 5678,32901<- 5678,32901<- (?,;130,-. )*+,-./01.23 4,*,31./2* /*:/+/:61;- :/-.1*=, 29;2=/ 290326< :/-.1*=, 723,.?1*%> 723,.?1*@> 71<:/-.1*=, 万春玲 A!5 B# CBD EF %GH@I@ D@J G& GFID@ @%KG @%KG @GIH 朱玉芳 LMNO" CBD EF GJJHIJ D&% GH GGIGD G%KG G%KG @EIJ 谭远德 (!5 OP CBD EF &@DG %@& %> GDI>F @&K> @&K> EFI@ 赵爱春 LM!Q!B CBD EE %&F&IF G@& %% DEI%& GGKE GGKE DDJIJ 本研究 (?/--.6:R CBD EE D%>>@ HDE %& D@IJH %JK> %JK> EFIF 已有研究表明家蚕的 A染色体具有强雌性决小也是影响构图效果的重要因素之一，关于构建分定作用，但其作用机制尚不清楚。该 !"#$ 分子标子连锁图谱的最小有效群体，尚无统一标准。已经记遗传连锁图谱，结合形态标记除确定了与家蚕经构建的 !"#$ 分子标记连锁图谱中，也有采用小样典实验遗传连锁图谱的第D@连锁群的对应关系外，本作图群体的报道，如 U,/7等（DJJF）曾采用 EG 个还确定了家蚕的雌性决定A染色体连锁群，A雌性个体的作图群体构建了大豆的高密度 !"#$连锁图决定连锁标记#$ ( SA与 #$DD(&S%和 #$D(DGS%F位谱。因此，根据实验条件本研究采用了EE个个体作 > > 点紧密相连，其图距分别为 GI% =T和 DGIG =T。在为构图群体。作图群体对构图效果的影响是群体越此之前尚无有关A染色体连锁群标记的报道，A染大，可检测的最大图距越大，可分辨的最小图距就越色体连锁群的标记将有助于家蚕性别调控机制研小。对于EE个个体的回交群体，可以检测的最大图究。同时该 !"#$ 分子标记遗传连锁图谱显示，A 距约%% =T，可以分辨的最小图距约J =T（徐云碧和染色体连锁群上 !"#$ 分子标记数较少，仅有 H 个朱立煌，DJJE）。以此构图标准判断，本研究所构建标记，明显较其他染色体上的 !"#$标记位点数少，的家蚕高密度!"#$分子标记图谱较其他已构建的这一结果有利于进一步对A染色体连锁群的研究。家蚕!"#$ 分子标记图谱更好，更具有实用性。与 9:; 作图材料 VVW、W!$P分子标记构图相比较，用 !"#$分子标记构图材料的选择是影响构图效果的重要因素之构建的家蚕遗传连锁图谱比 VVW、W!$P分子标记构一，构图材料的亲本间差异越大，分子标记的多态性建的家蚕遗传连锁图谱在标记间的平均图距上更就越丰富。因此本研究采用形态特征和生态型差异大，这一方面可能与不同分子标记类型有关，不同分较大的两个亲本杂交及其回交一代为作图群体，用子标记类型在染色体上的分布密度不同；二是可能这样的亲本杂交可获得更多的多态性标记，构建高与作图群体大小有关，如 VVW分子标记图谱的构建密度的分子标记连锁图谱，每组引物平均获得多态用DHJ 个个体，其平均图距 &I&% =T（T/12 !" #$X，性标记@E个。其二是现有的连锁遗传图谱构建软 G>>@）；W!$P分子标记图谱的构建用 D&& 个个体，件均未考虑配子形成中不发生交换对使用 " 群体其平均图距%I@EYEI>G =T（O1-6Z2=?/，DJJH）。 G 作图所产生的影响（谭远德等，G>>>），因此，本研究参考文献（<*3*/*24*1）采用回交一代为构图群体可以避免由于家蚕雌完全 C,*.2;/;1V，46/..2* B，C26+,. 5，V1/;;1*: !，5RZ1[, V，"3,R--/*,. 4，连锁所带来的"G 群体作图所不能检测其亲本中互 DJJDX ):,*./9/=1./2*291*W"#$713Z,3-./0?.;R;/*Z,:.2.?,M.;0,*,/* 斥相位点连锁关系的缺陷。 71/[,X %&!’()!*!"X，HG：%J%\%JHX 在分子标记遗传图谱的构建中，作图群体的大 B?1*0 ’，L?26 UO，DJJHX $?R;20,*R 3,=2*-.36=./2* /* .?, -.6:R 29

A dense linkage map of the silkworm ( Bombyx mori )based on AFLP markers

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