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TESIS DOCTORAL IMPLEMENTACIÓN DE TÉCNICAS DE SECUENCIACIÓN MASIVA PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS ALGORITMOS DIAGNÓSTICOS Y BIOINFORMÁTICOS EN DISTROFIAS HEREDITARIAS DE RETINA DOCTORANDA: NEREIDA INÉS BRAVO GIL DIRECTOR: GUILLERMO ANTIÑOLO GIL DEPARTAMENTO: CIRUGÍA, UNIVERSIDAD DE SEVILLA PROGRAMA DE DOCTORADO: BIOLOGÍA MOLECULAR, BIOMEDICINA E INVESTIGACIÓN CLÍNICA ÍNDICE ÍNDICE DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 1 1.1 La visión............................................................................................................................................... 3 1.1.1 El globo ocular .............................................................................................................................. 3 1.1.2 La retina .......................................................................................................................................... 4 1.1.3 Fisiología visual ........................................................................................................................... 6 1.1.3.1 Los fotorreceptores ........................................................................................................... 6 1.1.3.2 Fototransducción y ciclo visual .................................................................................... 9 1.2 Distrofias hereditarias de retina ............................................................................................ 13 1.2.1 Clasificación................................................................................................................................ 13 1.2.1.1 Formas periféricas .......................................................................................................... 14 1.2.1.2 Formas centrales ............................................................................................................. 17 1.2.1.3 Formas mixtas .................................................................................................................. 20 1.2.1.4 Formas sindrómicas ....................................................................................................... 22 1.2.2 Heterogeneidad clínica y genética .................................................................................... 24 1.2.3 Genes asociados a DHR.......................................................................................................... 26 1.2.4 Aproximaciones para la identificación de nuevos genes candidatos ................ 28 1.2.5 Terapias y tratamientos ........................................................................................................ 31 1.3 Secuenciación de Nueva Generación ................................................................................... 34 1.3.1 Principales plataformas basadas en la NGS .................................................................. 34 1.3.2 Aplicaciones de la NGS ........................................................................................................... 37 2. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................... 43 1.3.3 Desarrollo de nuevas tecnologías: Secuenciación de lecturas largas ................ 40 2.1 Hipótesis ........................................................................................................................................... 45 3. ESTUDIOS REALIZADOS ........................................................................................... 47 2.2 Objetivos .......................................................................................................................................... 46 RP1 BBS1 3.1 Artículo I: Nuevas mutaciones en y una variante recurrente en explican la coexistencia de dos distrofias de retina distintas en la misma familia. ................... 49 USH2A 3.2 Artículo II: La re‐evaluación de una familia pone en duda la patogenicidad de la mutación p.Cys759Phe de en homocigosis. ................................................................................. 65 3.3 Artículo III: Mejora en el manejo de las distrofias hereditarias de retina mediante la secuenciación dirigida de un panel de genes específico de población. .................. 77 3.4 Artículo IV: Desentrañando las bases genéticas de los casos aislados de SYNE2 retinosis pigmentaria: un estudio a gran escala. ....................................................................................... 93 3.5 Artículo V: Identificación de como un nuevo gen candidato asociado a 4. RESUMEN GLOBAL DE LOS RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................. 139 retinosis pigmentaria autosómica recesiva. ............................................................................................. 117 5. CONCLUSIONES ........................................................................................................ 151 6. BIBLIOGRAFÍA .......................................................................................................... 155 7. ANEXOS ....................................................................................................................... 173 7.1 ANEXO I ......................................................................................................................................... 175 7.2 ANEXO II ........................................................................................................................................ 183 7.3 ANEXO III ...................................................................................................................................... 187 ABREVIATURAS ABREVIATURAS Actin-binding domains ABDs , dominios de unión a actina ACHM Acromatopsia ACL Amaurosis congénita de Leber AD Autosómico dominante ADN Ácido Desoxirribonucleico ADNc ADN codificante Arrayed primer extension AFG Angiografía fluoresceínica APEX AR Autosómico recesivo ARN Ácido ribonucleico ARNm Ácido ribonucleico mensajero AVC Alteraciones en la visión de los colores A2E N-retinildeno-N-retinil-etanolamina Burrows-Wheeler Aligner A2PE N-retinilideno-N-retinil-fosfatidiletanolamina BWA chromatin immunoprecipitation sequencing Cas9 Caspasa 9 ChIP-seq CHM Coroideremia Copy number variations, CNCE Ceguera nocturna congénita estacionaria Cone photoreceptor function loss 8 CNVs Variaciones en el número de copias Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats cpfl8 , CRISPR Repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente Ciberer Spanish Variant Server interespaciadas CSVS DC Distrofia de conos DCB Distrofia de conos y bastones DHR Distrofias hereditaria de retina DM Distrofia macular DME Distrofia macular asociada a la edad (DME) dNTP Desoxinucleótidos trifosfato EPR Epitelio pigmentario de la retina Exome Variant Server ERG Electrorretinograma Exome Aggregation Consortium EVS Genome Analysis Toolkit ExAC GATK Tesis doctoral Nereida Bravo Gil GCAP Proteínas activadoras de la guanilato ciclasa GMPc Guanosín monofosfato cíclico Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton KASH Klarsicht, ANC1, Syne/NesprinHomology LINC Minor Alelle Frequency, LX Ligado al cromosoma X Mendelian Inheritance in Man MAF frecuencia del alelo menor MIM Multiplex-ligation probe amplification miRNAs Micro ARN Nesprin2 Nuclear envelope spectrin repeat protein 2 MLPA Next-generation sequencing Oxford Nanopore Technologies NGS , Secuenciación de nueva generación Open reading frame 15 ONT Pacific Biosciences ORF15 , Marco abierto de lectura 15 PacBio Polymerase Chain Reaction pb Par de bases Retinal degeneration 10 PCR , Reacción en cadena de la polimerasa RNA sequencing rd10 RNA-seq , Secuenicación de ARN RP Retinosis Pigmentaria RPe Retinosis Pigmentaria esporádica RS Retinosquisis Short hairpin RNA SBB Síndrome de Bardet Biedl Single Molecule Real Time shRNAs , Secuenciación a tiempo real de una única SMRT Single Nucleotide Variants molécula de ADN SNVs , Variantes de un solo nucleótido Syne2 Synaptic nuclear envelope protein 2 STGD Enfermedad de Stargardt University of California, Santa Cruz UCSC Whole exome sequencing USH Síndrome de Usher Whole genome sequencing WES , Secuenciación del exoma completo WGS , Secuenciación del genoma completo
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