Hyperbaric Oxygen Therapy Alleviates Carbon Monoxide Poisoning–Induced Delayed Memory ...

101 Pages·2016·4.55 MB·English

by  國立中山大學 生物科學系研究所 劉文忠

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國立中山大學 生物科學系
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Wen-Chung Liu, M.D.
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指導教授：華瑜 博士

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： Julie Y.H. Chan, Ph.D.
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忠 中華民國105年1月
104
January 2016
學
年

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國立中山大學生物科學系
博士論文
Department of Biological Sciences
National Sun Yat-sen University
Doctorate Dissertation

高壓氧治療經由維持海馬迴之腦源性神經滋養因子依賴性

神經新生以減緩一氧化碳中毒導致的遲發性記憶障礙

Hyperbaric Oxygen Therapy Alleviates Carbon Monoxide Poisoning–Induced
Delayed Memory Impairment by Preserving Brain-Derived
Neurotrophic Factor–Dependent Hippocampal Neurogenesis

研究生：劉文忠
Wen-Chung Liu, M.D.
指導教授：華瑜 博士
Julie Y.H. Chan, Ph.D.

中華民國 105 年 1 月
January 2016
國立 中山大學研 究生學位論 文審 定書
本校生物科學系博士班
:D972U1UUU4)所
研究生劉文忠 (學號 提論文
高壓氧治療經由維持海馬迴之腦源性神經滋養因子依賴性
神經新生以減緩一氧化碳 中毒導致的遲發性記憶障礙
HYperbaricUxygenTherapyAlleviatesCarbUnMUnUxide
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於 中華民國 1U5年 1月 16日 經本委 員會審查並舉行
,符
口試 合博士學位論文標準 。
學位考試委員簽章
:
刊︼了′
召集人 陳理維 戶 委 員 華 瑜

委 員 陳慶鏗 委 員 楊生

委 員 施承
國立中山大學博碩士論文公開授權書
∥∥Ⅲ∥ ∥∥Ⅲ Ⅲ
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etd-U°18116-U85252
2。16-°1-1922:51:。3
本授權書所授權之論文為授權人劉文盅在國立中山大學 牛物科學系研究所 1U4學年度第⊥學期取得博十
學位之論文 。
:
論文題目 高壓氧治療經由維持海馬迴之腦源性神經滋養因子依賴t性
神經新生以減緩一氧化碳中毒導致的遲發性記憶障礙
:華
指導教授 瑜 博士
洋煮事項
:
1.依本校1U2年1月9日 1U1學年度第1學期第1U次行政會議通過 ,研究所畢業生可於上傳電子論文時自行
選擇紙本及電子檔開放年限 。
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「專利各項申請案件處理時限表」(網址路徑 :經濟部智慧財產局→專利→專利情報通→專利處理時
6勛後再選定論文公開時間 。
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若尚有任何專利申請與著作權等相關問題 ,歡迎洽詢本校產學營運中心智財技轉組 ,分機2砭6。
3.授權書一式兩份 ,經本人及指導教授共同簽名後 ,將論文公開授權書裝訂於審定書之後 ,辦理畢業
,除 ,另
離校時 繳交一本論文至圖書館外 一本繳交至教務處註冊組 。
:
.電子檔 此項授權同意以非專屬 、無償方式授權予本校圖書館 ,不限地域 、時間與次數 ,以微縮 、光
,及
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囝市日日公開傳輸數位檔案 。
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歹 。
t6口
囝同意市即公開 。
口因特殊原因 ,欲延後公開 ,請於 年後公開陳覽 。
一
※紙本論文公開日期 :民國些 年m月塑 日。
授權人 :劉文忠
:D972U1UUU4
鳥畢 韌言
:瀏
授權人 文忠 (辭
)
劉文忠
(簽
指導教授 : 章)

中華民國 ┘┴上山巨＿┘﹂月三旦一日
※此授權書嚴禁塗改
｝若欲修改權限 ,請登入系統修改後重新列印此授權書 。
｝若論文已審核通過 ,請聯繫etd@mai︳ .nsVsu.edu.㏑或校內分機2452,修改後重新列印並簽章 。
j授權書將自動列印兩份 。請於圖書館和教務處辦理離校手續時 ,各別與紙本論文一併繳交 。
ii
致謝

本論文之完成，首先衷心感謝恩師華瑜講座教授的悉心指導與鼓
勵。在整個博士班的求學過程中，從文獻的探討、研究方向的選擇、
觀念架構之建立、實驗設計乃至於其中問題的解決及研究成果的探討，
以迄本文之撰寫，老師不斷地予以指導與啟迪，更對初稿逐字斧正，
使得本論文得以順利完成，師恩浩蕩，永銘五內。老師不論在做學問
或者做人做事等各個方面的嚴謹和仔細，更是為我樹立了良好的典範
和身教。此外，承蒙口試老師陳慶鏗國家講座教授、楊生湳副院長、
陳理維教授及施承典教授等前輩不但對於目前的研究給予許多寶貴
的意見，更指引了我未來研究的方向，謹致以最深的謝意。
而這段奔波在醫院病房、手術室、學校及實驗室的日子中，也十
分感激實驗室裡的夥伴們不但要趕自己的實驗，還要抽空幫忙我完成
實驗。實驗室中的兩位吳博士: 芎歷學姐及志偉、趙博士詠梅等在實
驗的設計和實務上的支援與指導、現在或曾經一起工作的研究夥伴:
貞君、瓊愛、晏華、純瑛、佳樺、倪君等等，謝謝你們在這段時間，
不時充當救火隊，在實驗上給予我協助。同時也要特別感謝義大醫院
楊生湳副院長的研究團隊及楊俊華小姐，您們在動物行為的研究方面
給予我極大的協助，否則這篇論文一定無法及時完成。在此更要由衷
地感謝高雄榮民總醫院整形外科全體同仁在我到學校進修的這段時
iii
間裡，常常要抽身到學校或實驗室而無法兼顧臨床工作的時候，給予
我最大的包容和支持。當然最感謝的還是我的家人在這一段時間的全
力支持，讓我可以在沒有後顧之憂的情況下，衝刺課業及研究，終於
得以順利完成學業。
最後，向所有關心我的親人、師長和朋友們表示深深的謝意。

iv
摘要
背景:一氧化碳（CO）是因為含碳質材料的不完全燃燒產生的一種無色，無味的
氣體。它經常被忽視或誤診，臨床上治療一氧化碳中毒常常是一個極大的挑戰並
且存在許多爭議，如致病機轉, 治療方式等等，尤其是高壓氧治療。因為臨床上
對於高壓氧治療在急性中毒後產生的遲發性神經系統後遺症是否有明確的療效
仍然是有爭議的。
目的:驗證高壓氧治療是透過增加腦源性神經滋養因子而促進成年的海馬迴神經
細胞新生，並進而改善急性一氧化碳中毒引發的遲發性認知功能損害的假設。
材料與方法:成年雄性Sprague-Dawley 大鼠體重介於250〜280公克，隨機分為
五組：（1）非一氧化碳處理過的 (原生組) 對照組，（2）急性一氧化碳中毒，（3）
急性一氧化碳中毒之後連續7日的高壓氧治療，（4）一氧化碳中毒後施予連續7
日高壓氧治療並且經由側腦室輸注酪氨酸激酶受體乙蛋白（TrkB的-Fc）的嵌合
體的Fc片段，和（5）急性一氧化碳中毒接著施予側腦室輸注腦源性神經滋養因
子。急性一氧化碳中毒是由暴露大鼠於一氧化碳在2500 ppm中40分鐘，隨後一
氧化碳增加到 3000 ppm 持續 20 分鐘來進行 (共計一小時)。高壓氧治療（在
2.5 絕對大氣壓，100％氧氣治療 60 分鐘），在一氧化碳中毒後持續進行 7 天。
腦內注射組則在一氧化碳中毒後第二天起經由所植入的滲透性微型泵將重組
TrkB-Fc嵌合體或腦源性神經滋養因子持續注入側腦室達7天。一氧化碳中毒後
將溴脫氧尿苷注入腹腔用以標記海馬迴的有絲分裂細胞。利用免疫組織化學染色
v
或免疫螢光染色來標定溴脫氧尿苷和另外兩個成年神經標誌物，Ki-67 和
Doublecortin 的在海馬迴的分佈情形。海馬迴中的腦源性神經滋養因子的量則
利用酶聯免疫吸附測定進行評估。認知行為則是使用的八臂迷宮來評估。
測量和主要結果：急性一氧化碳中毒後在大鼠海馬迴的齒狀回顆粒下區可以發現
的 DCX+細胞、Ki-67+細胞，和溴脫氧尿苷陽性細胞的數量明顯減少，意味著一氧
化碳中毒會顯著抑制成年海馬迴神經細胞的新生及發育與成熟。這種由一氧化碳
中毒引發的抑制會明顯地被早期高壓氧治療緩解。高壓氧治療也促進了海馬迴腦
源性神經滋養因子的持續增長。急性一氧化碳中毒後利用重組TrkB-Fc嵌合體的
腦室內注射來阻斷海馬迴腦源性神經滋養因子的訊息傳遞會顯著減弱高壓氧治
療所帶來的保護作用;而腦源性神經滋養因子側腦室內注射用以模擬高壓氧的作
用，則可以在急性一氧化碳中毒後依然保持神經新生的能力。此外，對於急性一
氧化碳中毒所導致遲發性的認知功能損害，高壓氧治療則可以明顯地透過腦源性
神經滋養因子依賴的方式改善認知功能障礙。
結論：早期高壓氧治療可透過維持海馬迴腦源性神經滋養因子含量增加成年神經
細胞新生緩解急性一氧化碳中毒引發的遲發性記憶障礙。

關鍵詞：腦源性神經滋養因子; 一氧化碳中毒; 遲發性神經精神症候群; 高壓
氧治療; 神經新生
vi
Abstract
Background: Carbon monoxide (CO) is a colorless, odorless gas produced by
incomplete combustion of carbonaceous material. Commonly overlooked or
misdiagnosed, CO poisoning often presents a significant challenge, as treatment
protocols, especially for hyperbaric oxygen therapy, remain controversial because of a
paucity of definitive clinical studies in delayed neurological sequelae after acute
poisoning.
Objective: To test the hypothesis that hyperbaric oxygen therapy ameliorates delayed
cognitive impairment after acute CO poisoning by promoting neurogenesis through
upregulating the brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in the hippocampus.
Materials and methods: Adult male Sprague-Dawley rats weighted 250~280 gm were
randomly divided into five groups: (1) non–CO-treated Naïve, (2) acute CO poisoning,
(3) acute poisoning followed by 7-day hyperbaric oxygen treatment, (4) CO +
hyperbaric oxygen with additional intracerebroventricular infusion of Fc fragment of
tyrosine kinase receptor B protein (TrkB-Fc) chimera, and (5) acute CO poisoning
followed by intracerebroventricular infusion of BDNF. Acute CO poisoning was
achieved by exposing the rats to CO at 2,500 ppm for 40 minutes, followed by 3,000
ppm for 20 minutes. Hyperbaric oxygen therapy (at 2.5 atmospheres absolute with
100% oxygen for 60 min) was conducted during the first 7 days after CO poisoning.
vii
Recombinant human TrkB-Fc chimera or BDNF was infused into the lateral ventricle
via the implanted osmotic mini-pump. For labeling of mitotic cells in the hippocampus,
bromodeoxyuridine was injected into the peritoneal cavity. Distribution of
bromodeoxyuridine and two additional adult neurogenesis markers, Ki-67 and
doublecortin, in the hippocampus was evaluated by immunohistochemistry or
immunofluorescence staining. Tissue level of BDNF was assessed by enzyme-linked
immunosorbent assay. Cognitive behavior was evaluated by the use of eight-arm radial
maze.
Measurements and Main Results: Acute CO poisoning significantly suppressed adult
hippocampal neurogenesis evident by the reduction in number of bromodeoxyuridine-
positive, Ki-67+, and doublecortin+ cells in the subgranular zone of the dentate gyrus.
This suppression of adult neurogenesis by the CO poisoning was appreciably alleviated
by early treatment of hyperbaric oxygen. The hyperbaric oxygen treatment also
promoted a sustained increase in hippocampal BDNF level. Blockade of hippocampal
BDNF signaling with intracerebroventricular infusion of recombinant human TrkB-Fc
chimera significantly blunted the protection by the hyperbaric oxygen on hippocampal
neurogenesis; whereas intracerebroventricular infusion of BDNF mimicked the action
of hyperbaric oxygen and preserved hippocampal neurogenesis after acute CO
poisoning. Furthermore, acute CO poisoning resulted in a delayed impairment of
viii