Functionalization of a Ti based Alloy with Synthesized Recombinant Fibronectin Fragments to ...

279 Pages·2014·3.29 MB·English

Functionalization of a Ti-based Alloy with Synthesized
Recombinant Fibronectin Fragments to Improve
Cellular Response

Carolina Herranz Díez

PhD Thesis
Doctoral program of Biomedical Engineering

Supervised by
Dr. JM. Manero Planella
Dr. Jordi Guillem Martí

Department of Materials Science and Metallurgical Engineering
Universitat Politècnica de Catalunya · Barcelona Tech (UPC)
July 2014

Cuando me planteé realizar un doctorado, nunca pensé que el tiempo podría pasar tan
rápido y tan lento a la vez. Tras cuatro años de trabajo me encuentro escribiendo las
últimas líneas. Esta tesis es el producto del trabajo realizado durante estos cuatros años
y no habría sido posible sin la colaboración y dedicación de muchas otras personas.
En primer lugar, querría dar las gracias a mis directores de tesis, el Dr. José María
Manero y el Dr. Jordi Guillem.
También me gustaría darle las gracias a los miembros del grupo de Biomaterials,
Biomechanics and Tissue Engineering (BBT) del Departamento de Ciencia de los
Materiales e Ingeniería Metalúrgica de la ETSEIB porque cada uno de ellos ha
participado de una forma u otra en esta tesis. Mención especial merecen Sara Gallinetti
y Maria Godoy, sin ellas nada hubiera sido igual.
Otro pilar importante en la consecución de esta tesis ha sido el Instituto de
Bioingeniería de Cataluña (IBEC) que me abrió sus puertas y puso a mi alcance todos
sus recursos.
No puedo olvidarme de los investigadores de otros centros o departamentos que se
prestaron a colaborar. Gracias al Dr. Benjamin Thierry y a la Dra. Lorena Diéguez del
Ian Work Research Institute; a la Dra. Christine Selhuber-Unkel de la Universidad de
Kiel; al Dr. Jeremy Schaffer de Fort Wayne Metals Corporation y al Dr. Emilio Jiménez
y al Dr. Joan Josep Roa del Departamento de Ciencia de los Materiales e Ingeniería
Metalúrgica de la UPC.
Gracias a mis padres y a mi hermano por haber estado siempre apoyándome y gracias
también a Gonzalo por embarcarse conmigo en esta aventura sin dudarlo ni un segundo.

ABSTRACT
According to a study of the European Commission, approximately one million hips are
replaced by prostheses worldwide every year. The interaction of the human body with
foreign materials that are subjected to alternating mechanical load in a highly corrosive
environment still provides challenges. The main factors affecting prosthesis failure are
stress shielding effect and poor osseointegration.
In this thesis the problem of prosthesis failure has been approached from the material
and from the osseointegration point of view trying to give a global solution to the
problem.
Niobium and hafnium, which are demonstrated to be totally biocompatible, were used
to design a Ti-based alloy. The effect of the alloying elements regarding microstructure
and elastic modulus was studied and the best composition was deeply characterized in
terms of microstructure, elastic modulus, corrosion resistance and superficial energy.
Recombinant fragments of fibronectin were synthesised spanning the cell attachment
site and the heparin binding domain which are important for cell viability. These motifs
were used to functionalise the surface of the TiNbHf alloy. Two tethering methods were
studied: physisorption and silanisation. Silanisation was not used before to immobilise
fibronectin recombinant fragments onto metallic substrates and in this thesis, its good
performance was demonstrated.
In vitro studies were made with each fragment and with different combinations of the
fragments, which showed the importance of the heparin binding domain to obtain a cell
response equivalent to that of fibronectin in terms of cell adhesion, proliferation and
differentiation.
Key words: stress shielding effect, titanium alloy, osseointegration, fibronectin,
recombinant protein, biofunctionalisation, in vitro cell culture.

I
RESUMEN
De acuerdo con un estudio de la Comisión Europea, aproximadamente un millón de
caderas son remplazadas por prótesis en el mundo anualmente. La interacción del
cuerpo humano con materiales externos sujetos a una carga mecánica alternante en un
medio altamente corrosivo todavía presenta ciertos desafíos. Los factores que
contribuyen principalmente al fallo de una prótesis son el apantallamiento de cargas y la
pobre osteointegracion.
En la presente tesis el problema de la fallida de prótesis ha sido abordado desde el punto
de vista del material y de la osteointegracion en un intento de dar una solución global al
problema
El niobio y el hafnio, cuya total biocompatibilidad ha sido demostrada, se han utilizado
para diseñar una aleación de titanio. El efecto de dichos aleantes respecto a la
microestructura y el módulo elástico ha sido estudiado y la mejor composición ha sido
profundamente caracterizada en términos de microestructura, módulo elástico,
resistencia a la corrosión y energía superficial.
Fragmentos recombinados de fibronectina han sido sintetizados abarcando la zona de
adhesión celular y la unión de heparina, las cuales son esenciales para la viabilidad
celular. Dichos motivos han sido utilizados para funcionalizar la superficie de la
aleación TiNbHf. Dos métodos de unión diferentes han sido estudiados: fisisorción y
silanización. La silanización es un método que no se ha utilizado hasta el momento para
inmovilizar fragmentos de fibronectina sobre superficies metálicas y en la presente tesis
su idoneidad ha sido demostrada.
Finalmente, estudios celulares in vitro se han llevado a cabo con cada fragmento y con
diferentes combinaciones de ambos, lo cual ha mostrado la importancia de la zona de
unión de heparina para obtener una respuesta celular equivalente a la obtenida con la
molécula de fibronectina en cuanto a adhesión celular, proliferación y diferenciación.

II
THESIS OBJECTIVES
The main objective of this thesis is on one hand, study the ternary system TiNbHf as a
potential substitute for the alloys used in total hip replacement and on the other hand,
synthesise a fibronectin recombinant fragments spanning the III and III domains
8-10 12-14
to improve osseointegration.
The specific objectives of the present thesis are:
1. To design a titanium alloy based on optimization of molecular orbital calculations of
electronic structures towards low modulus of elasticity and the potential for super
elasticity and study the effect of niobium and hafnium alloying elements in terms of
microstructure and elastic modulus.
2. To select the appropriate TINbHf composition, fabricate a bar and characterise its
microstructure, determine its elastic modulus, determine its corrosion resistance and
study its superficial energy.
3. To fabricate, by recombinant protein techniques, the fibronectin fragments FNIII
8-10
(CAS) and FNIII (HBII) and characterise the fuctionalisation of the TiNBHf alloy
12-14
with such fragments.
4. To study cell response to the biofunctionalised material in terms of adhesion force
and cell adhesion, proliferation and differentiation.

III
CONFERENCE CONTRIBUTIONS
C. Herranz, J. Schaffer, T. Trifonov, J. Portillo, S. Estrade, Ll. Yedra, J. Mendoza, FX
Gil, J.M. Manero. “Microstructural characterization of a potential superelastic Nickel-
free titanium alloy”. III Microscopy at the Frontiers of Science Conference,
September 2013, Tarragona, Spain (Poster Presentation).
C. Herranz, J. Schaffer, J.M. Manero. “Potential Superelastic nickel-free titanium
alloy”. 2013 Shape Memory and Superelastic Technology Conference, May 2013,
Prague, Czech Republic (Poster Presentation)

C. Herranz, M. González, J. Guillem-Martí, J. Peña,J.C Rodríguez-Cabello, F.J. Gil,
J.M. Manero. “New nickel-free titanium alloys design and functionalization for
implantology”. XXXIII Iberian Society de Biomechanics and Biomaterials
Conference, November 2010, Valencia, Spain (Oral Presentation).

IV
ABSTRACT .................................................................................................................................... I
RESUMEN ..................................................................................................................................... II
THESIS OBJECTIVES ................................................................................................................. III
CONFERENCE CONTRIBUTIONS .............................................................................................. IV
I Introduction .......................................................................................................................... 1
Chapter 1 Introduction ................................................................................................................ 3
1. Bone ....................................................................................................................... 5
1.1 Bone composition ................................................................................................ 5
1.2 Bone mechanics................................................................................................... 7
1.2.1 Creep and stress relaxation ........................................................................... 7
1.2.3 Viscoelasticity .............................................................................................. 8
1.3 Bone cytology ..................................................................................................... 8
1.3.1 Mesenchymal Stem Cells (MSC) ................................................................. 8
1.3.2 Osteoblasts .................................................................................................... 9
1.3.3 Osteoclasts .................................................................................................. 10
1.3.4 Osteocytes ................................................................................................... 10
1.4 Bone remodelling process ................................................................................. 11
1.4.1 Cell processes during bone remodelling ..................................................... 11
1.4.2 Bone functional adaptation ......................................................................... 13
1.5 Bone diseases .................................................................................................... 14
2. Materials used for bone replacement ................................................................... 16
2.1 Biomaterials ...................................................................................................... 16
2.1.1 Definition .................................................................................................... 16
2.1.3 Use of biomaterials ..................................................................................... 16
2.2 Metals used as biomaterials for prosthesis ........................................................ 18
2.2.1 Introduction ................................................................................................ 18
2.2.2 Stainless Steels. .......................................................................................... 18
V
2.2.3. Co- Based Alloys ....................................................................................... 20
2.2.4 Ti and Ti-Based Alloys .............................................................................. 21
2.2.5 Other metals ................................................................................................ 22
2.3 Titanium as a biomaterial .................................................................................. 23
2.3.1 History ........................................................................................................ 23
2.3.2 What makes titanium biocompatible? ........................................................ 23
2.4 Titanium alloys .................................................................................................. 23
2.4.1 Ti-6A-l4V ................................................................................................... 24
2.4.2 TMZFTM Alloy ........................................................................................... 25
2.4.3 Ti-13Zr-13Nb ............................................................................................. 25
2.4.4. Tyadine 1610 ............................................................................................. 25
2.4.5 Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn ..................................................................................... 25
3. Problems derived from the interaction prosthesis-body ......................................... 26
3.1 Host response .................................................................................................... 26
3.1.1 Wound healing process ............................................................................... 26
3.1.2 Foreign body reaction ................................................................................. 27
3.2 Toxicity and Allergy ......................................................................................... 29
3.2.2 Toxicity ....................................................................................................... 29
3.2.1 Allergy ........................................................................................................ 30
3.3 Stress shielding effect........................................................................................ 31
3.4 Poor osseointegration ........................................................................................ 33
4. Mimicking extracellular matrix .............................................................................. 34
4.1 Extracellular matrix ........................................................................................... 34
4.1.1 Functions .................................................................................................... 34
4.1.2 Composition ............................................................................................... 35
4.1.4 Adhesion process ........................................................................................ 39
4.2 Biofunctionalisation of surfaces ........................................................................ 41
VI