Expression and activity analysis of the recombinant Solenopsis invicta Buren venom allergen Sol i1

2007·3 MB·

by  Xue-Qing, Han

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&&’，(（& ’）：)((*))+ ,--.&/(/0)%1)
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重组红火蚁毒素致敏原 的表达及活性分析
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韩雪清+，林祥梅+，张永国%，陈 岩+，冶贵生F，杨伟东/，夏巧钰+，杨泽晓F，王建峰+
（+G中国检验检疫科学研究院，北京 +&&&%1；%G军事医学科学院微生物与流行病学研究所，北京 +&&&’+；
FG西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 ’+%+&&；/G 深圳出入境检验检疫局，广东深圳 (+H&/(）
摘要：【目的】为研究红火蚁 ,’)-&’./+/+&0+"#$ I"J:8毒素蛋白致病分子机理，制备用于红火蚁蜇伤防治的制剂。【方
法】本研究采用反转录KL@（@M0KL@）与套式KL@（8KL@）扩增出红火蚁体内毒素蛋白-=# 6+全基因及其活性基因片
段-=#6+5，进行测序与序列分析，构建重组质粒-=#6+0D3M/FG+5和 -=#6+50D3M/FG+5，经KL@、酶切和测序鉴定后转化
IN%（+ O3F）进行,KMP诱导表达，对表达产物进行-O-0KCP3分析和Q:RE:J8 S#=E检测后，用亲合层析法纯化，并将纯
化的重组蛋白通过动物试验进行了致敏活性分析以及过敏体质治疗研究。【结果】本研究克隆的-=# 6+基因序列与
P:8I58T中红火蚁序列同源性为11U，原核表达预期大小的%种重组蛋白能与组氨酸单抗发生特异性反应，且具有
较高的致敏活性和良好的免疫治疗效果。【结论】原核表达的%种重组蛋白-=# 6+和 -=# 6+5具有良好的生物活性，
为红火蚁蜇伤的致病机理和防治研究奠定了基础。
关键词：红火蚁；基因；致敏原蛋白；表达；生物活性分析
中图分类号：V1)) 文献标识码：C 文章编号：&/(/0)%1（) %&&’）&’0&)((0&’
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X,CV65=0\"+，\C.P [:0X65=F，QC.P !6580]:8Y+（+G L768:R: C?5B:4$ =^ ,8RD:?E6=8 58B V"5J58E68:，
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基金项目：国家质检总局重点科研项目（%&&(,2+)1）
作者简介：韩雪清，女，+1)%年生，甘肃兰州人，博士，研究员，主要从事病原微生物分子生物学、免疫学及蛋白质功能的研究，30456#：7589":;<
$57==>?=4>?8
收稿日期@:?:6A:B：%&&’0&%0+(；接受日期C??:DE:B：%&&’0&/0&1
3.3 昆虫学报 0*+,-%+"1"#"2(*,!(%(*, .=卷
红火蚁 !"#$%"&’(’ (%)(*+, !"#$%是在我国新发现 的构象（9G51B;: $+ ,#*，+,,3）；利用杆状病毒载体表
的一种具有严重危害的外来生物。红火蚁原产于南 达的9’@ B? 重组蛋白与毒蛋白有相似的 C)D 活性
美洲的巴西、阿根廷、巴拉圭和巴拿马运河一带，其 （9G51B;: $+ ,#*，<==?）；对毒蛋白 9’@ B+和 9’@ B8的
繁殖迅速，具有强大的入侵性和极强的攻击性 研究相对较少。红火蚁作为在我国第一次出现的新
（&’()#$% $+ ,#*，+,-.），它用厉害的螫刺，能迅速攻 有害物种，国内对其研究报道甚少。我们从中国新
击任何骚扰其巢穴的人或动物，人被叮咬后，皮肤出 发现红火蚁体内提取 IFH，经过 IJKLMI 与套式
现红斑、红肿、痛痒、高烧、休克，一些体质极敏感的 LMI（%LMI）方法获得其毒素蛋白 9’@ B+全基因及其
人，严重时可导致死亡（/01$2 $+ ,#*，+,-3）。由于 活性基因片段9’@ B+0，经测序后进行了大量表达，并
其能造成重大经济、社会和环境影响，已经被国际上 将表达的重组蛋白纯化后，通过动物致敏试验和免
列为最具入侵性和破坏性的百种外来有害生物之一 疫治疗试验进一步研究了其生物活性，为临床上早
（4$2506’ $+ ,#*，+,78；9:0((’#;，+,,3）。<==8年,月 期预防、有效诊断和治疗红火蚁蜇伤引起的过敏反
我国的广东省吴川市，<==. 年广东省珠海市、惠州 应提供了相关制剂。
市、深圳市、湛江、张家界以及香港部分地区相继发
生红火蚁疫情，并造成了人员伤害和巨大的经济损 ! 材料与方法
失及社会的恐慌（张润志等，<==.；薛大勇等，<==.；
罗礼智，<==.）。 !"! 材料
研究发现，红火蚁毒液中过敏原引起的过敏反 试剂：DN J0O 酶、HPQ 酶、IFH02$ 抑制剂、
应是红火蚁蜇伤导致严重反应甚至死亡的主要原
-*"I!、./"!、质粒纯化试剂盒（L@021B; PB%B RB:
因。红火蚁的毒液主要由水、不溶性的生物碱和痕
43,8<K=+）、凝胶回收试剂盒（S$@ DN:#0G:B’% RB:
量的蛋白质组成（!0$# $+ ,#*，+,-,；>’((10%，+,7-）； 4<.=+K=+）、4FH &B)0:B’% RB:（L#’1$)0）等购自宝生物
毒液中毒素蛋白是已知致敏原中最有效的一类，只
工程（大连）有限公司，TCH01UI QB#0@ IFH PB%B RB:
需毫微克就可以致敏并诱发过敏反应（>’((10%， （.<,=8）购 自 TCHSDF 公 司，FB 9$U50#’2$ >B)5
+,,?；9’@@$A $+ ,#*，<==<），临床上，已被广泛用于红 L$#(’#10%G$购自H1$#2501 !B’2GB$%G$2 公司。
火蚁引起的过敏反应的诊断和红火蚁过敏病人的免
仪器：DUU$%;’#( P02:$#GAG@$# LMI 仪，DUU$%;’#(
疫治疗。>’((10%等（+,770）从商品化的红火蚁毒液 HS S$#10%A 产品；紫外成像系统（H&L>HK..==）；高
中分离纯化出 9’@ B+、9’@ B<、9’@ B?和 9’@ B8四种毒素
速冷冻离心机（9VIQH&&I），>$#0$"2产品；核酸电泳
蛋白，其中的主要蛋白是 9’@ B< 和 9’@ B?，只有少量
系统 4WWK7M，北京市六一仪器厂生产，PB%B
的9’@ B+和 9’@ B8，用火蚁毒素过敏病人的血清对其
L#’JDHFI? 9A2:$1 !B’KI0;产品等。
进行试验，所有8种蛋白均具有明显的致敏活性，并
菌株和载体：UDJ8?X+0 载体购自 C%YB:#’)$% 公
且红火蚁毒液中这8种致敏原的 C)D反应彼此无相
司，!&<（+ 4D?）、4>."由本实验室保存。
关性（>’((10%，+,7-；>’((10% $+ ,#*，+,77E）。虽然红
红火蚁：由深圳出入境检验检疫局提供。
火蚁毒液中的 8 种毒素蛋白的 C)D 反应间无相关
!"# 方法
性，但与蜜蜂、黄蜂及斑纹蝎等的毒液过敏原存在交
!"#"! 引物设计与合成：参照S$%!0%Z已发表的红
叉反应（>’((10% $+ ,#*，+,77E；F")$%: $+ ,#*，<==8）。
火蚁核苷酸序列设计 8 条引物（表 +），引物由宝生
目前用于红火蚁过敏病人检测和治疗的毒素蛋白主
物（大连）工程有限公司合成。
要是通过收集和饲养红火蚁得到的全蚁提取物或纯
的毒液，由于毒液中毒素蛋白含量非常低，不易大量 表! 引物编号、序列及长度
制备获得，而且饲养大量的红火蚁也存在一定的风 $%&’(! $)(*+,(-(./(0*(%0,’(012)+32)(4567(5-
险，这就使得该过程比较复杂和不安全；并且建立 引物编号 引物序列 长度（EU）
L#B1$#%’* L#B1$#2$O"$%G$2 &$%):5
在全蚁提取物和纯红火蚁毒液基础上的检测方法不
D9+K( .[KJMMSHHJJMHJSHSHHHSJJJSMMSMSK?[ <-
能准确区分红火蚁与蜜蜂、黄蜂及斑纹蝎等的毒液 D9+K# .[KSJSMJMSHSJJJHJJSMJSMMJSMHMJJK?[ <7
引起的过敏反应。9G51B;: 等（+,,?）首次对 9’@ B<毒 D9+0K( .[KMMSSHHJJMSSMJJMHMMHSJJMJSMHK?[ <-
D9+0K# .[KSJSMJMSHSMJHMMMSMHMJJHJJSMJK?[ <-
素蛋白进行序列测定并克隆分析其编码 G4FH 序
列，随后在 9(,细胞中进行了表达，表达的重组蛋白 !"#"# 9’@ B+基因的获取：（+）IFH的提取：红火
9’@ B（< #$G’1EB%0%: 9’@ B<，#9’@ B<）具有毒蛋白 9’@ B< 蚁的预处理，将一定数量的成年红火蚁工蚁全蚁在
=期 韩雪清等：重组红火蚁毒素致敏原#?4*@的表达及活性分析 G(=
液氮中充分研磨，然后用 !"# 悬浮，$%% & ’ 离心 ( （9）重组质粒的鉴定：按常规方法分别取两种
)*+，收集上清液，按照 ,-./)01 2*3/4 15. 6*+* 7*8 连接产物 P E 转化 "E9@（XFP）感受态细胞，挑选
!
（(9:%;）试剂盒操作说明书提取红火蚁的总 15.， .)0O抗性克隆培养扩增，用!4/M)*L 6*+* 7*（8 XG:;9B
<=%>保存备用。 %@）提取质粒，进行 !C1、!"#1#和 $%##双酶切以
（9）#?4 *@全基因 1AB!C1：以制备好的总 15. 及测序鉴定，同时保存菌种。
为模板进行反转录，总 15. @%D(!E，加反向引物 !"#"% 原核表达：（@）诱导表达：将保存菌种涂布
F#@B3 @!E，G(>水浴@% )*+，立即冰浴( )*+，加(& 于.)0O E"板上过夜培养，挑取单个菌落接种于 P
1ABHIJJK3 ;!E，L5A!9!E，.629!E，15/M*+%D(!E， )E含@%%!’Y)E氨苄青霉素的 9& ZA 培养基中过
;9> @ N，反转录产物 <9%>保存，备用；以反转录 夜培养后，取(%% E接种于(% )E 9&ZA培养基中
!
产物作为 !C1模板进行扩增：采用(%!E反应体系 于P=>培养 @D( [ 9D% N，当 SXG%%为 %DG [ @D%，加
（@%& !C1 HIJJK3 (!E，6’9O P!E，L5A! ;!E，引物 -!AU至终浓度为@D( ))?4YE进行诱导表达，继续培
F#@BJ @!E，引物 F#@B3 @!E，模板 @%!E，A/Q酶 %D( 养P[; N后收菌，进行 #X#B!.UF分析，同时培养诱
!E，LLR9S 9(D( !E），反应条件为 :(>，( )*+； 导含空载体0FA;PD@/的受体菌。
:(>，@ )*+；(%>，@ )*+；=9>，@D( )*+，P(个循环； （9）表达蛋白的检测：根据张维铭（9%%P）方法
=9>，@% )*+，反应结束后，进行 @T琼脂糖凝胶电 进行试剂配置与样品处理。收集诱导表达菌液，
泳，;>保存备用。 P %%%&’离心 ( )*+，弃上清液，用 !"# 液悬浮后加
（P）#?4 *@/基因+!C1：以（9）中1AB!C1的产物 入等体积的 9& #X#B!.UF 上样缓冲液于沸水中煮
为模板进行#?4 *@ 活性基因片段 #?4 *@/的扩增，以 @% )*+ 作为上样样品，分别进行 #X#B!.UF 分析与
F#@/BJ 和 F#@/B3为引物，反应体系与（9）相同，反应 \KM8K3+ H4?88*+’检测。
条件:(>，( )*+；:(>，G% M；((>，P% M；=9>，@D( !"#"& 表达蛋白的纯化：（@）#?4 *@/表达蛋白的纯
)*+，P(个循环；=9>，@% )*+，反应结束后，进行@T 化：将收集的菌体悬浮于 @Y@% 体积 9% ))?4YE A3*M
琼脂糖凝胶电泳，;>保存备用。 （0R=D%），超声波破碎，使超声时间累积 ;% )*+（工
（;）测序分析：根据UK4 FV83/W8*?+ 7*8说明书进 作时间9 M；间隙时间9 M；工作次数:%次；循环次
行 1AB!C1 产物凝胶回收，按照 X5. E*’/8*?+ 7*8 数G次；功率P%% R]）后@9 %%%&’ ;>离心P% )*+，
（!3?)K’/）操作说明将纯化回收产物连于 0UF6BA 收集上清液，再次离心收集上清液，过滤，作为样品。
载体（0UF6BA载体@!E，A; X5. E*’/MK HIJJK3 (!E， 用(倍体积的超纯水洗涤柱子，用 ([@% 倍柱子体
A; X5.E*’/MK@!E，纯化回收产物P!E，混匀后@G> 积的 !"# 平衡。加预处理的样品，重复 P 次上样。
过夜），按常规方法转化 XR("感受态，挑取阳性克 用洗涤缓冲液（9% ))?4YE A3*M，%D( )?4YE 5/C4，@(
隆送宝生物（大连）工程有限公司测序。 ))?4YE咪唑，0R =D%）洗涤，考马斯亮蓝检测是否洗
!"#"$ 重组质粒的构建：（@）表达载体的构建：根 涤完全，直到无杂蛋白为止。用洗脱缓冲液（9%
据 UK4 FV83/W8*?+ 7*8 说明书将 1AB!C1 的产物与 ))?4YE A3*M，%D( )?4YE 5/C4，@%% ))?4YE 咪唑，0R
+!C1产物琼脂糖凝胶电泳纯化回收后进行 !"#1# =D%）溶解洗脱。考马斯亮蓝检测是否洗脱完全。洗
和 $%##双酶切（!"#1# (!E，$%## (!E，@%& R 脱产物浓缩至体积为%D([@D% )E，将浓缩液移至无
HIJJK3 =!E，回收 !C1产物 (%!E，LLR9S P!E，混匀 菌离心管中，;>保存。
后置 P=> 反应 P N）；同时用 !4/M)*L 6*+* 7*8 （9）#?4 *@ 表达蛋白的纯化：根据 #/)H3??^
（XG:;9B%@）提取质粒 0FA;PD@/，并进行 !"#1#和 （9%%9）方法采用尿素提取包涵体法进行 #?4 *@表达
$%##双酶切（!"#1# (!E，$%## (!E，@% & R 蛋白的洗涤与溶解，再按照可溶蛋白的纯化方法用
HIJJK3 =!E，0FA;PD@/ ;(!E，LLR9S $!E，混匀后置 5*#K0N/3?MK R*’N !K3J?3)/+WK 柱纯化。并将纯化产
P=>反应P N）；酶切反应后用UK4 FV83/W8*?+ 7*8纯化 物进行#X#B!.UF分析。
回收酶切产物，;>存放或<9%>保存备用。 !"#"’ 表达蛋白的活性试验：（@）致敏试验：将纯
分别取纯化回收的目的基因酶切产物与表达载 化的蛋白除去咪唑与尿素后用生理盐水稀释至适当
体 0FA;PD@/ 酶切产物进行连接。连接体系（@% 浓度（9( ’Y)E），分别皮下注射小白鼠和白兔，进行
!
E）：目的基因酶切产物G E，0FA;PD@/酶切产物9 蛋白质活性即过敏性试验。（/）兔体致敏试验：实
! !
E，@%& A; X5. E*’/MK HIJJK3 @ E，A; X5. E*’/MK @ 验兔子为大耳白@(只，;[G个月龄，@D( ^’左右，随
! !
E；@G> 连接过夜。 机分为(组，每组 P 只。首先测定体温、被毛、消毒
!
8"3 昆虫学报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$ "’卷
后在一侧背部皮下注射纯化蛋白（!" #$%&），每只 法进行“攻毒”实验，观察兔体是否有过敏反应。
!
兔子注射 ’(! %&。第 ) 组，注射 *+, -) 蛋白；第 !
表! 重组致敏毒素蛋白的免疫治疗方案
组，注射*+, -).蛋白；第/组，注射*+, -)蛋白与*+,
"#$%&! "’&())*+,-’&.#/012’&)&3(-’
-).蛋白混合物；第0组，注射纯12*蛋白；第"组，
-’&.&2,)$(+#+-/.,-&(+1
注射纯生理盐水（空白对照）。注射完毕，每 3 4 观 皮下接种剂量Q>R?I@-+>G+J?+A@4?F?I+%5->.>@EF+@?->J（!#）
免疫时间
察一次动物反应，连续观察 " 天。（5）小白鼠致敏 P-%? 第)天 第!天 第/天 第0天
试验：取)"只小白鼠，每组 /只，分为 "组，将纯化 6.S) 6.S! 6.S/ 6.S0
蛋白稀释至适当浓度，分别分点皮下注射（四肢腋 ’3：/’ ’(’’’/ ’(’/ 8"(’ 8"(’
’;：’’ ’(’’’8 ’(’8 8"(’
下、腹部）*+, -) 蛋白、*+, -).蛋白、*+, -) 蛋白与 *+,
’;：/’ ’(’’)! ’()! 8"(’
-).蛋白混合物、纯 12* 蛋白与生理盐水，每只 ’(/
)’：’’ ’(’’!0 ’(!0 8"(’
%&，每3 4观察一次动物反应，观察"天。 )’：/’ ’(’’/ ’(/ 8"(’
（!）蛋白皮试与免疫治疗试验：将纯化的蛋白 ))：’’ ’(’’8 ’(8 8"(’
用生理盐水稀释至适当浓度（蛋白含量 !(’ >#$%&） ))：/’ ’(’)! )(! 8"(’
后，进行皮下注射，每只兔子注射 ’(! %&。取大耳 )!：’’ ’(’!0 !(0 8"(’
)!：/’ ’(’/’ /(’ 8"(’
白)"只，0N8个月龄，)(" O#，分为/组，每组 "只。
第)组，接种*+, -)蛋白；第!组，接种*+, -).蛋白；
第/组，注射纯生理盐水（空白对照）；3 4后观察有 ! 结果与分析
否过敏反应。
取有过敏反应的兔子进行免疫治疗试验，按表 !45 6,% (5基因与 6,% (5#基因的获取
!方案分别皮下注射纯化的重组致敏毒素蛋白 *+, 以红火蚁全蚁提取的总D19为模板，用所设计
-)和*+, -).，在0天治疗结束后，再按)(!(8节（)）方 的!对特异性引物进行反转录 BCD（DPTBCD）与套
图) 克隆的片段（67’)8’/3，上行）与红火蚁*+,-)基因核苷酸序列（9:830;;3，下行）同源性分析
<-#= ) 9,-#>%?>@+A@4?BCDEF+GHI@J（67’)8’/3，@+E,->?）K-@4*+,-) J?LH?>I?EH5,-J4?G（9:830;;3，5+@@+%,->?）
“M”表示上下两序列碱基相同“M”->G-I.@?J-G?>@-I.,5.J?->5+@4J?LH?>I?J=

"期 韩雪清等：重组红火蚁毒素致敏原Q?16%的表达及活性分析 OO%
!""#$%&!，"#：$#%&$#"! M(2)2! W)6]6,L：QC6),C) N()EE! % ;J;&% ;OI<［R! 萨姆布鲁克，
’())*+,-.，/01+,2)( 3，4(567 8，.+(56, .9，%::;< =*>?(5)2 @6() +,5 ;II;< 在大肠杆菌中表达克隆化基因! 见：R! 萨姆布鲁克，K!
6**A,?5B)(+>0：)@@)C56D),)EE?@FB?1)G?20)H5(+C5E! ’! (&&)*+,-&.$! Y! 拉塞尔! 分子克隆试验指南!第M版! 北京：科学出版社!
!""#$%&!，:（I ;）：;%I&;%J! %;J;&%;OI］
/?@@*+, K3，%:$"< 811)(L),E 6, /0*),?>5)(+ D),?*!!"! 811)(L),6C QCB*625.，.CS?,,)11-R，/?@@*+,K3，%::O< N(?2AC56?,?@+()C?*G6,+,5
C?*>?,),5E?@ /%&)$%01.1.$2.345（6*>?(5)2@6()+,5）D),?*! ’! (&&)*+, 6*>?(5)2@6()+,5 D),?*+11)(L),，Q?1 6; 6, ,+56D) +,2 6**A,?()+C56D)
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Q+*G(??XR，3AEE)1K)2E! .?1)CA1+(S1?,6,L：8V+G?(+5?(0.+,A+1! （责任编辑：黄玲巧）