Equine and bovine microvesicles derived from amniotic progenitor cells in regenerative and ...

234 Pages·2012·14.15 MB·English

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI MILANO

PhD course in Veterinary and Animal Science

Equine and bovine microvesicles derived from
amniotic progenitor cells in regenerative and
reproductive topics

PhD Supervisor:
Prof. Dr. Fausto Cremonesi

PhD Added Supervisor:
Dr. Anna Lange-Consiglio
PhD Student:
Claudia Perrini
Matr. R10416

XXIX cycle VAS
1
Supervisors
Professor Fausto Cremonesi
Università degli Studi di Milano
Reproduction Unit
Centro Clinico-Veterinario e Zootecnico-Sperimentale di Ateneo
Via dell’Università 6 – 26900 Lodi (Italy)

Department of Veterinary Medicine,
Via Celoria 10 – 20133 Milano (Italy)
E-mail: [email protected]
Tel: [phone] Fax: [phone]
http://www.veterinaria.unimi.it/Facolta/2605_ITA_HTML.html

Doctor Anna Lange-Consiglio
Università degli Studi di Milano
Head of Reproduction Laboratory
Centro Clinico-Veterinario e Zootecnico-Sperimentale di Ateneo
Via dell’Università 6 – 26900 Lodi (Italy)
E-mail: [email protected]
Tel: [phone] Fax: [phone]
http://www.veterinaria.unimi.it/Facolta/2605_ITA_HTML.html
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RIASSUNTO
Durante questo progetto di dottorato sono stati condotti studi per comprendere la capacità
delle cellule mesenchimali amniotiche (AMCs) di agire attraverso meccanismi paracrini. La
prima fase del disegno sperimentale ha valutato l’efficacia delle AMCs sulla proliferazione delle
cellule endometriali (EDCs) in assenza di un contatto cellula-cellula. Le EDCs sono state co-
coltivate in un sistema trans-well con le AMCs o sono state coltivate in presenza del loro
medium condizionato (CM). In entrambe le condizioni sperimentali è stato osservato un
aumento del tasso di proliferazione delle EDCs definendo, così, il ruolo cruciale dei fattori
secreti dalle AMCs come mediatori dell'azione delle cellule staminali. Il CM è composto da
fattori solubili e non-solubili rappresentati da microvescicole (MVs). Per capire il ruolo delle
MVs e del loro contenuto nell’azione paracrina, la seconda fase del disegno sperimentale è
stata incentrata sull’individuazione del tipo di MVs secrete dalle AMCs e sulla loro efficacia in
processi infiammatori in vitro su due importanti modelli sperimentali nella specie equina quali
l’endometrio ed il tendine. La produzione di MVs è stata ottimizzata attraverso
un’ultracentrifugazione del CM a 100.000 g per 1 ora. Attraverso lo strumento Nanosight è
stato calcolato che la produzione di MVs da AMCs equine è di circa 2550±71 particelle/cellula,
con una dimensione media di 258±55 nm. La microscopia elettronica a trasmissione ha
confermato la presenza di vescicole cellulari che per dimensioni e modalità di secrezione sono
state classificate come shedding vesicles. Per capire se le cellule endometriali (EDCs) e tendinee
(TNCs) fossero target delle MVs secrete dalle AMCs, è stata studiata l’incorporazione delle
medesime dopo marcatura con un fluorocromo lipofilico quale il PKH-26. Dopo uno studio di
una curva dose-risposta è stato osservato che la dose ottimale per l'incorporazione di MVs in
EDCs è stata di 50x106 MVs/ml a 72 h e per le TNCs di 50x106 MVs/ml a 24-48h. Per esaminare
l'abilità delle MVs nel contrastare un processo infiammatorio, entrambe le linee cellulari sono
state stressate in vitro con LPS e trattate con MVs. La vitalità cellulare, l'espressione di alcuni
geni pro-infiammatori ed il rilascio delle rispettive citochine sono stati i parametri impiegati per
valutare l’efficacia delle MVs. Per entrambe le linee cellulari, il tasso di apoptosi è
drammaticamente salito nelle cellule trattate con LPS, rispetto al controllo (CTR). LPS ha indotto
un aumento significativo dell'espressione di TNF-α, IL-6 e IL-1β in EDCs e di MMP-1, MMP-9,
MMP-13 e TNF-α in TNCs. Le MVs sono state in grado di contrastare l'effetto di LPS,
diminuendo il tasso di apoptosi in entrambe le linee cellulari e riducendo il livello di espressione
dei geni pro-infiammatori. Una conferma di questi dati è stata ottenuta attraverso l'analisi delle
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citochine pro-infiammatorie (TNF-β and IL-6) ed anti-infiammatorie (TGF-α) rilasciate dalle EDCs
nel terreno di coltura, confermando l'abilità delle MVs di trasportare molecole capaci di
contrastare la risposta infiammatoria in cellule stressate con LPS.
Data l'importanza del contenuto in miRNA delle MVs, sia nelle AMCs sia nelle loro MVs è stata
studiata la presenza di tre miRNA (miR-335, miR-146a, and miR-26a-2) coinvolti nella
regolazione dei processi infiammatori. Questi tre miRNA sono stati identificati sia nelle AMCs
sia nelle MVs, di conseguenza, è possibile ipotizzare che l'espressione genica dopo
infiammazione con LPS e trattamento con MVs possa essere stato modulato dal trasferimento
di miRNAs dalle MVs alle cellule target.
Successivamente a questi studi, si è tentato di capire quanto in un processo rigenerativo possa
essere imputato alle MVs e quanto ai fattori solubili presenti nel CM e, a questo proposito, è
stata valutata l’abilità delle MVs di inibire la proliferazione delle cellule periferiche
mononucleate del sangue (PBMC). La loro azione è stata comparata a quello del CM e del
sovranatante (SN) ottenuto dal CM dopo scorporazione delle MVs. Il CM ed il SN hanno
manifestato capacità immunosoppressiva ma, anche dopo un trattamento di sonicazione al fine
del rilascio del loro contenuto, le MVs non hanno dimostrato quest’abilità. Questi risultati
portano a dedurre che le MVs sono in grado di trasportare informazioni alle cellule target
attraverso molecole capaci di contrastare l'effetto infiammatorio dovuto all'uso di LPS ma,
tenendo in considerazione la mancanza di effetto immunomodulatorio, probabilmente in vivo
la loro azione è integrata anche dalla presenza dei fattori solubili presenti nel CM.
I meccanismi paracrini materno-fetali sono di vitale importanza ai fini dell’instaurarsi di una
gravidanza, per cui si è ritenuto interessante studiare questi meccanismi durante la produzione
in vitro di embrioni bovini. Le differenti componenti del secretoma (CM, SN e MVs) ottenute da
AMCs ed EDCs bovine sono state aggiunte al terreno di coltura embrionale a differenti giorni di
coltura. I risultati hanno dimostrato che il giorno 5 è il migliore momento per la
supplementazione e che le MVs di AMCs portano a migliori risultati qualitativi. Questi dati sono
stati confermati dalla valutazione di alcuni geni coinvolti nell'apoptosi e nella protezione contro
specie reattive dell'ossigeno. I motivi per i quali le MVs di AMCs si siano dimostrate migliori di
quelle secrete dalle EDCs non sono ancora conosciuti ma è probabile che le EDCs coltivate in
monostrato in vitro vadano incontro a de-differenziamento che altera la qualità del loro
secreto.
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In conclusione, è possibile affermare che le AMCs sono una linea cellulare affascinante in
quanto derivano da materiale di scarto biologico, e quindi a basso costo, e possono essere
impiegate in medicina rigenerativa per la loro capacità di trasportare informazioni alle cellule
target. Le MVs possono offrire un nuovo strumento terapeutico privo di cellule nell’ambito
della nanomedicina.
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ABSTRACT
During this PhD project, studies were carried out to understand the ability of amniotic
mesenchymal cells (AMCs) to act by paracrine mechanism. At first, AMCs and their conditioned
medium (CM) were investigated in an in vitro model using equine endometrial cells (EDCs) as
target. Proliferation of EDCs was studied co-culturing them with AMCs in a trans-well system or
in presence of AMC-CM. In both conditions, there was a significant increase in EDC proliferation
rate, defining the crucial role of factors secreted by AMCs in stem cells action. CM is composed
of soluble factors and no-soluble factors as microvesicles (MVs). In this context, in the second
step of this project, the presence and the type of AMC-MVs were identified to understand their
role in regenerative medicine. The production of MVs was optimized through a CM
ultracentrifugation at 100.000 g for 1 hour. Microvesicle production from equine AMCs was
2550±71 particles/cell, with a mean dimension of 258±55 nm. The transmission electron
microscopy confirmed the presence of extra-cellular vesicles that were classified as shedding
vesicles for their size and modality of secretion. In order to understand if endometrial cells
(EDCs) tendon cells (TNCs) were target of these MVs, an incorporation study was performed
labelling MVs with a lipophilic fluorochrome such as PKH-26. By a dose-response curve, the
optimal conditions of incorporation were at 72 h at a concentration of 50x106 MVs/ml for EDCs,
and at 24-72 h at a concentration of 50x106 MVs/ml for TNCs. In order to study MVs ability to
counteract an in vitro inflammation, EDCs and TNCs challenged with LPS and treated with MVs
were evaluated by viability cell tests, by expression of some pro-inflammatory genes, and by
release of respective cytokines. For both cell types, the apoptosis rate increased dramatically in
cells treated with LPS if compared to the control (CTR). LPS significantly upregulated the
expression of TNF-α, IL-6 and IL-1β in EDCs and of MMP-1, MMP-9, MMP-13 and TNF-α in TNCs.
MVs were able to counteract the action of LPS, decreasing the apoptosis rate and reducing in
the expression levels of the pro-inflammatory genes in both cell lines. Coherent results were
obtained through the analysis of pro-inflammatory (TNF-β and IL-6) and anti-inflammatory
(TGF-α) cytokines released by EDCs in the culture medium, confirming the ability of MVs to
transport molecules able to counteract the stress induced by LPS.
Since MVs contain various active molecules, the presence of three miRNAs (miR-335, miR-146a,
and miR-26a-2) was investigated, as they are involved in the regulation of inflammation. The
selected miRNAs have been found in both AMCs and their MVs, so the previously observed
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downregulation of gene expression could be correlated to miRNA transfer from MVs to target
cells. Moreover, the ability of MVs to inhibit peripheral blood mononuclear cell (PBMC) was
evaluated, but MVs, also after lysis by sonication to release their content, were not able to
inhibit PBMC proliferation despite to CM and SN. These results led to hypothesize that MVs
brought to the target cells some molecules able to counteract the inflammatory situation due
to the LPS but, taking into account the lack of their immunomodulatory action, probably, for an
in vivo healing, soluble factor of CM are necessary too.
Paracrine mechanism are essential also in maternal-fetal communication. In this context, we
studied these mechanisms during bovine in vitro embryo production. Different components of
secretome (CM, SN and MVs) from bovine AMCs and EDCs were supplemented to the embryo
culture media at different days of culture. The results demonstrated that the day 5 of culture is
the best time point for the supplementation of these components and that AMCs-MVs
provided the best environment for the embryo concerning the blastocyst quality. These data
were confirmed by the evaluation of genes involved in apoptosis and reactive oxygen species
protection. The reasons for which the MVs of AMCs have proved better than those secreted by
EDCs are not yet known but it is likely that in vitro culture of EDCs in monolayer may induce a
de-differentiation that alters the quality of their secretion.
As conclusion of this project, it is possible to speculate that AMCs are fascinating in view of
producing off-the-shelf products, at low cost, and their use in regenerative medicine for their
capacity to carry information to the target cells. The MVs may offer a new therapeutic cell-free
tool in nanomedicine.

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Structure of the work - The first section of this thesis gives a brief overview of the literature
about the regenerative medicine, focusing the attention on the paracrine communication
between cells. More details are provided on the description of extracellular vesicles that are
supposed to be mainly involved in this paracrine action. The second section concerns some
models for the study of the paracrine communication in regenerative veterinary medicine such
as equine tendinitis and endometritis, and, furthermore, in bovine embryo production. Lastly, a
list of the publications realized during my PhD project follows, within which it is possible to find
the protocols used to study the mechanisms involved in these communications and the original
results of the research of the 3-academic-year–period (2014-2016).
This thesis is based on the following papers:
I. Corradetti B, Correani A, Romaldini A, Marini MG, Bizzaro D, Perrini C, Cremonesi F, Lange-
Consiglio A. Amniotic membrane-derived mesenchymal cells and their conditioned media:
potential candidates for uterine regenerative therapy in the horse. 2014 PLoS One.
9(10):e111324.
II. Perrini C, Strillacci MG, Bagnato A, Esposti P, Marini MG, Corraddetti B, Bizzaro D, Idda A,
Ledda S, Capra E, Pizzi F, Lange-Consiglio A, Cremonesi F. Microvesicles secreted from
equine amniotic-derived cells and their potential role in reducing inflammation in
endometrial cells in an in vitro model. 2016 Stem Cell Res Ther doi: 10.1186/s13287-016-
0429-6
III. Lange-Consiglio A, Perrini C, Tasquier R, Deregibus MC, Camussi G, Pascucci L, Marini MG,
Corradetti B, Bizzaro D, De Vita B, Romele P, Parolini O, Cremonesi F. Equine amniotic
microvesicles and their anti-inflammatory potential in a tenocyte model in vitro. 2016
Stem Cell Dev 15;25(8):610-21.
IV. Perrini C, Esposti P, Compagnoni D, Treglia S, Cremonesi F, Lange Consiglio A. Secretome
derived from different cell lines in bovine in vitro embryo production. 2016 Submitted to
PlosOne

Other papers published during the PhD project include the following:
I. Lange-Consiglio A, Corradetti B, Perrini C, Bizzaro D, Cremonesi F. Leptin and leptin
receptor are detectable in equine spermatozoa but are not involved in in vitro fertilization.
2014 Reprod Fertil Dev 28(5):574-85.
II. Lange-Consiglio A, Cazzaniga N, Garlappi R, Spelta C, Pollera C, Perrini C, Cremonesi F.
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Platelet concentrate in bovine reproduction: effects on in vitro embryo production and
after intrauterine administration in repeat breeder cows. 2015 Reprod Biol Endocrinol
13:65.
III. Lange-Consiglio A, Corradetti B, Bertani S, Notarstefano V, Perrini C, Marini MG, Arrighi S,
Bosi G, Belloli A, Pravettoni D, Locatelli V, Cremonesi F, Bizzaro D. Peculiarity of porcine
amniotic membrane and its derived cells: a contribution to the study of cell therapy from a
large animal model. 2015 Cell Reprogram 17(6):472-83.
IV. Lange-Consiglio A, Romaldini A, Correani A, Corradetti B, Esposti P, Cannatà MF, Perrini C,
Marini MG, Bizzaro D, Cremonesi F. Does the bovine pre-ovulatory follicle harbor
progenitor stem cells? 2016 Cell Reprogram 18(2):116-26.
V. Marini MG, Perrini C, Esposti P, Corradetti B, Bizzaro D, Riccaboni P, Fantinato E, Urbani G,
Gelati G, Cremonesi F, Lange-Consiglio A. Effects of platelet-rich plasma in a model of
bovine endometrial inflammation in vitro. 2016 Reprod Biol Endocrinol doi:
10.1186/s12958-016-0195-4
VI. Lange-Consiglio A, Perrini C, Bertero A, Esposti P, Cremonesi F, Vincenti L. Isolation,
molecular characterization and in vitro differentiation of bovine Wharton's jelly-derived
multipotent mesenchymal cells. 2016 Theriogenology doi:
10.1016/j.theriogenology.2016.09.042.
VII. Andrade GM, da Silveira JC, Perrini C, del Collado M, Gebremedhn S, Tesfaye D, Meirelles
FV, Perecin F. MicroRNA mediated regulation and role of PI3K-Akt pathway in bovine
oocyte developmental competence. 2016 Submitted to Scientific Reports.

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Table of contents
List of abbreviations pag 11
1. Introduction pag 14
2. Source of stem cells pag 16
3. Amniotic mesenchymal cells: the human lesson pag 18
4. Paracrine mechanisms of communication pag 20
4.1 Conditioned medium pag 20
4.2 Extracellular vesicles pag 22
4.3 Methods of isolation and characterization of microvesicles pag 22
4.4 Molecular composition of microvesicles pag 23
4.5 Microvesicles biogenesis and uptake mechanisms pag 24
4.6 Microvesicles in regenerative medicine pag 25
5. Microvesicles and non coding RNAs: miRNAs and piRNAs pag 27
6. Models for the study of paracrine communication pag 29
6.1 Important pathologies in equine species: endometritis and tendon
lesions pag 29
6.2 Bovine in vitro embryo production pag 30
6.2.1 Bovine maternal-fetal communication pag 31
6.2.2 Co-culture systems in bovine embryo production pag 32
6.2.3 Embryonic bi-directional communication: amniotic mesenchymal
cells and endometrial cells pag 32
7. Summary of the project pag 34
7.1 Publications pag 38
8. Discussions pag 39
9. Conclusions pag 50
10. Future perspectives pag 51
11. References pag 52
12. APPENDIX: other publications pag 66
13. Acknowledgements pag 68

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