Development of Silver Based Antimicrobial Films for Coating and Food Packaging Applications

322 Pages·2014·4.96 MB·English

Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos
Grupo de Nuevos Materiales y Nanotecnología

Development of Silver Based
Antimicrobial Films for Coating and Food
Packaging Applications

DOCTORAL THESIS
Presented by: Antonio Martínez Abad
Supervised by: María José Ocio Zapata
José María Lagarón Cabello

Valencia, Febrero 2014

Dra. María José Ocio, Catedrática de la Facultad de Farmacia en la
Universidad de Valencia y Dr. Jose María Lagarón, Investigador
científico del Consejo Superior de Investigaciones Científicas en el
Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos (IATA)
CERTIFICAN
Que la presente memoria “Development of Silver Based Antimicrobial
Films for Coating and Food Packaging Applications” constituye la tesis
doctoral de Antonio Martínez Abad. Asimismo, certifican haber dirigido
y supervisado tanto los distintos aspectos del trabajo como su redacción.
Y para que conste a los efectos oportunos, firmamos la presente en
Valencia a 27 de Febrero de 2014

Fdo. María José Ocio Fdo. José María Jagarón

ACKNOWLEDGEMENTS
Finalmente ha llegado el momento de cerrar una etapa importante. En mi caso, esta etapa,
no sólo circunscribe el periodo predoctoral usual, sino que abarca los casi 6 años que
llevo trabajando en el IATA. En todo este tiempo he tenido la oportunidad de trabajar con
muchas personas maravillosas que de manera directa o indirecta han estado implicadas en
mi trabajo y en mi vida, así que esta sección no podía ser corta.

En primer lugar, cómo no, quiero agradecer a mis directores de tesis la confianza que en
su día depositaron y siguen depositando en mi. Gracias a Ajo, por darme la oportunidad
de entrar en el grupo en primera instancia. Gracias por el continuo apoyo en cada paso, no
sólo en el ámbito científico, sino también en el anímico e incluso personal. Gracias por
esa dosis tan equilibrada de autonomía y exigencia. Deseo de corazón que todo te vaya
bien en el futuro. A Chema también tengo mucho que agradecer en esta tesis. El trabajo
es infinitamente más sencillo si las metas son claras y concretas. Es fácil encontrar
motivación cuando continuamente se transmite ese espíritu de superación constante, esa
sensación de estar en un grupo capaz y competitivo. En nuestro grupo se aprende siempre
que el trabajo experimental es sólo una parte del trabajo de un científico. Gracias por
involucrarnos activamente en todas las tareas y enseñarnos a trabajar con independencia y
eficiencia.

También me gustaría dar las gracias a todas las personas que he conocido dentro del
grupo a lo largo de estos años. Agradezco a Patri su ayuda legándome el testigo de la
microbiología dentro del laboratorio. Gracias por enseñarme a dar los primeros pasos,
transmitirme ese agudo sentido de la equidad, responsabilidad y justicia. Gracias por
ayudarme en todo lo que necesité. Gracias a Lola, por enseñarnos que la mayor eficiencia
en el trabajo puede ser de color fucsia. Gracias por el buen rollo, incluso en situaciones
difíciles. Gracias a Sergi, por haberme dado la oportunidad de colaborar con él al
principio de mi etapa aquí. Gracias por ser el “macho” del grupo, por el humor machista y
homófobo de figuración. Todos sabemos que en realidad eres un trozo de pan, tratas a
Rocío como una reina, y te queremos por ello. Gracias a Ricardo, por pasar conmigo
innumerables tardes durante los dos primeros años en el grupo, cavilando sobre cosas a
veces sin sentido, a veces brillantes. Enseñándome por un lado el valor de las ideas en
ciencia y por otro el valor de una buena figura o una adecuada redacción. Gracias a
Merche, por su capacidad para sonrojarme una y otra vez, por el café, el cigarro, el
muñeco de barro y toda clase de barbaridades, refranes y demás, siempre activa, siempre
adelante. Gracias a la gente que pasó también por el entonces laboratorio 106. Gracias a
Javi, Vicente, Thais. Gracias a Carla.

Ya en el subsuelo del Instituto, he de dar las gracias a mis actuales compañeros de
laboratorio. A Amparo, gracias por su asesoramiento en incontables ocasiones, su
frescura, su buen rollo, su punto de vista, su eficiencia, su positivismo, su manera de
afrontar las cosas. Gracias a Mª José, por su nobleza, su sinceridad, su integridad, su
sonrisa, por prestarme ayuda cuando la he necesitado. Gracias a Rocío, sofisticada y a la
vez tan humilde, tolerante, afable, amable. ¿Quién le puede negar cualquier cosa? A Jesús
le agradezco su inestimable ayuda con la portada de esta tesis y con muchas otras cosas.
Gracias por saber hacer de todo. Gracias por ser el más fallero. Gracias por la
expresividad, la empatía que contagias, absorbes y transmites, todo a la vez justo enfrente
de mí. Gracias, amigo. Gracias a Wilson, por las pequeñas charlas, por su bondad y, ¿por
qué no?, su fé, que también le hace como es. Por supuesto, gracias a Marta. Con ella he
compartido más de cuatro años, y siempre de menos a más. Una compañera excepcional y
un ejemplo en lo profesional y en lo personal. Gracias por ser tan exageradamente tímida,
por esa risa escandalosa. Gracias, en definitiva, por ser tan de verdad. Gracias también a
las personas que se han incorporado hace poco. Gracias a Laura, por concederme la
oportunidad de conocerla. Espero que sigamos disfrutando juntos y compartiendo buenos
momentos, generando nuevas anécdotas. A Lorena, por ser una chica excepcional,
inteligente, luchadora, prudente, emprendedora. Ahora te toca a ti recoger el testigo.
Estoy seguro que tendrás mucho éxito en el futuro. Aprovecha las estancias todo lo que
puedas, en todos los sentidos. No me olvido de Pablo, aunque ya no esté en nuestro grupo.
Sus ganas de ayudar a todo el mundo, su prudencia, entereza, su sentido de la justicia.
Sigo admirando muchos de estos aspectos. Tampoco de Gloria. Gracias por tu ayuda con
los virus, y por los buenos ratos en el almuerzo o en el laboratorio. También un recuerdo
de agradecimiento a las personas que pasaron por el grupo durante estancias, o realizando
prácticas dentro de sus respectivos programas de formación. Gracias, primero, a Kiko,
Rubén, Ana y Marta, que se involucraron activamente en varias partes de esta tesis y sin
cuya ayuda mi progreso hubiera sido más lento y mucho menos ameno. Gracias por las
conversaciones en campana y por soportar mi interminable verborrea de sabelotodo.
Gracias a Marysol, cantando canciones y sintonías. Gracias a Adriana, Rafa, Bego, Paula
y María. Gracias por los miércoles no sagrados, los jueves de marcha y las cenas y
cervezas compartidas.

También quiero agradecer al Dr. Byron Brehm-Stecher el brindarme la oportunidad de
realizar una estancia en la Iowa State University. Aunque no se incluya en esta tesis, el
trabajo allí realizado ha contribuido en mucho a expandir mi formación predoctoral. En
este sentido, mi sincero agradecimiento a Kim y Deb, por aceptarme tanto y tan bien, por
ayudarme en todo lo que necesité durante mi estancia en el laboratorio y por el alcohol y
las Chicken Wings. Extiendo mi agradecimiento a la comunidad Tamil, en especial a
Babu, a la comunidad Bengalí, y a todas las personas que, aunque no trabajaron conmigo
directamente en el laboratorio, me hicieron sentir parte de su familia. Gracias por las
escapadas, las tardes de “Ultimate Frisbee” y todos los buenos momentos.

Tengo sólo palabras de agradecimiento para la gente de la UJI, en especial para Lluis, un
tío brillante y trabajador, a la vez que cercano y amigo. Gracias a todo el grupo por
completar eficientemente la caracterización de muchos materiales y por los buenos ratos
compartidos en congresos y demás. También, gracias a la gente de NBM (Eugenia, María,
etc) y a Mariam, por la buena compañía. Gracias, también, a Alí, a Fran y a los vigilantes
y porteros que tan amablemente me han tratado, siempre dispuestos a ayudar.

Por último, quiero agradecerles su apoyo a todas las personas que, sin tener ninguna
relación con mi trabajo, me han apoyado de una manera u otra. Gracias a los amigos de
toda la vida, a Víctor, Sergio, Rober, ... Con vosotros los problemas desaparecen o son
mucho más fáciles de llevar y eso también es muy importante. Gracias a mis padres, por
aguantar algún que otro sermón y rollazo que, a ellos, pobres, ni les viene, ni les va. Por
creer en mi de manera incondicional. Gracias, por último, a Lidia. La seguridad, la
determinación y todas mis florituras sólo son posibles gracias a la confianza, el apoyo, la
fé de mi alma complementaria. Gracias por ser mi confidente y amiga. Ah, y por las
presentaciones. Probablemente me olvido de más de uno o una y me tendreis que
disculpar por ello. Gracias a todos los que no he mencionado. Gracias por todo.
ABSTRACT
Although silver is used as key component to control microbial proliferation in
countless applications, available silver based technologies are scarce. This
relies in the difficulties in assessing silver efficacy due to stability and
speciation issues. In the present dissertation, silver ions were directly
incorporated into biopolymer matrices as to obtain materials with prolonged
antimicrobial performance based on the sustained release of silver ions. A
profound insight into the chemical interactions between the active silver
species and both bacteria and the environment of action was carried out as to
correctly assess silver efficacy in the subsequent design of the antimicrobial
materials. Silver was found to be effective at the nanomolar level under
optimum conditions. However, time dependent chemical interactions with
several ligands drastically affected silver efficacy and the assessment of
viability by traditional enumeration methods. The incorporation of silver ions
into EVOH films produced by casting and electrospinning did not alter the
physicochemical properties of the materials and showed a rapid release of the
whole silver content upon contact with moisture. This was reflected in
inactivation of bacteria at very low silver loadings (0.0001wt.%) under
optimum conditions. When incorporated in PLA by casting or melt
compounding, the release of silver ions and antimicrobial performance was
prolonged from days to months depending on the silver content or the method
for incorporation. Release was also found to be highly dependent on moisture
content and pH. An initial burst release stage was attenuated by the
application of a beeswax layer, which allowed the release profiles to be
tailored to suit a specific release profile and comply with current legislation.
The films demonstrated a high antibacterial and antiviral effect against the
most common food-borne pathogens in synthetic media, real liquid and solid
food samples as well as on the surface of the films. This study represents a
step forward in the understanding of silver antimicrobial efficacy and puts
forth its possible suitability for food packaging, food contact or other
applications.

RESUMEN
Aunque la plata se usa como componente clave en el control microbiano en
incontables aplicaciones, las tecnologías basadas en plata disponibles son
escasas. Esto radica en la dificultad para evaluar su eficacia debido a
problemas de estabilidad y de especiación. En la presente tesis, iones de plata
se incorporaron en matrices biopoliméricas para obtener materiales de
prolongada capacidad antimicrobiana basados en su liberación sostenida. Se
realizó un estudio profundo de las interacciones químicas entre las especies
activas de plata, las bacterias, y posibles ligandos presentes en el medio de
acción. En condiciones óptimas, la plata demostró ser eficaz en el rango de
los nanomoles. Sin embargo, interacciones químicas con varios ligandos
afectaron drásticamente tanto su eficacia como la evaluación de la viabilidad
bacteriana. La incorporación de iones de plata en películas de EVOH no
alteró las propiedades físico-químicas de los materiales que mostraron una
rápida liberación del contenido de plata al entrar en contacto con la humedad.
Esto se reflejó en la inactivación de las bacterias a concentraciones muy bajas
(0.0001wt.%) en condiciones óptimas. Cuando se incorporaron iones de plata
en PLA por casting o mezclado-fundido, la liberación y el rendimiento
antimicrobiano se prolongaron de días a meses, dependiendo del contenido, el
método de incorporación, la humedad o el pH del medio de liberación. Una
etapa inicial de liberación mayor pudo ser atenuada gracias a la aplicación de
una capa de cera de abejas, lo que permitió adaptar los perfiles de liberación a
demanda y cumplir con la legislación vigente en diversas condiciones de
liberación. Las películas demostraron un alto efecto antibacteriano y antiviral
contra los patógenos transmitidos por los alimentos más comunes en medios
sintéticos, en superficie y en alimentos líquidos y sólidos. Este estudio
representa un avance en la comprensión de la eficacia antimicrobiana de la
plata y destaca su posible idoneidad para la fabricación de materiales de
envasado de alimentos, de contacto con alimentos u otras aplicaciones.