Recognition and masking of putative U1 snRNA binding sites Erkennung und Maskierung von

170 Pages·2017·9.24 MB·English

by  A & A

Recognition and masking of putative U1 snRNA
binding sites
Erkennung und Maskierung von putativen U1 snRNA
Bindesequenzen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
vorgelegt von
Anna-Lena Brillen
aus Oberhausen
Düsseldorf, März 2017
aus dem Institut für Virologie
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Gedruckt mit der Genehmigung der
Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf
Referent: Prof. Dr. H. Schaal
Koreferent: Prof. Dr. M. Feldbrügge
Tag der mündlichen Prüfung: 19.05.2017
Für meine Familie
Table of Contents
Table of Contents......................................................................................................... 1
Abstract........................................................................................................................ 2
Zusammenfassung…................................................................................................... 3
1. Introduction....................................................................................................... 5
1.1. Pre-mRNA splicing................................................................................ 5
1.1.1. Mechanisms of pre-mRNA splicing................................................... 5
1.1.2. Exon and Intron definition.................................................................. 9
1.1.3. Splice site recognition...................................................................... 11
1.1.4. SR proteins..................................................................................... .13
1.1.5. hnRNP proteins............................................................................... 16
1.2. Splicing and disease............................................................................. 18
1.3. Prediction of localization of SREs......................................................... 20
1.4. The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1).............................. 21
1.4.1. HIV-1 life cycle............................................................................... 22
1.4.2. HIV-1 splicing................................................................................. 24
1.4.3. HIV-1 proteins................................................................................. 2. 7
1.5. Theses of this dissertation.................................................................... 31
1.6. Thesen dieser Dissertation................................................................... 32
2. Critical Regulators of Endothelial Cell Functions: For a Change
Being Alternative............................................................................................ .34
3. Succession of splicing regulatory elements determines cryptic
5'ss functionality.............................................................................................. 55
4. Analysis of competing HIV-1 splice donor sites uncovers a
tight cluster of splicing regulatory elements within exon 2/2b.......................... 72
5. Differential hnRNP D isoform incorporation may confer plasticity
to the ESSV-mediated repressive state across HIV-1 exon 3....................... 120
6. Summary and conclusion.............................................................................. 135
7. Curriculum Vitae........................................................................................... .138
8. Acknowledgements....................................................................................... 140
9. Erklärung...................................................................................................... .141
10. References................................................................................................... .142

1
Abstract
Removal of intronic sequences during pre-mRNA processing requires accurate
recognition of the exon-intron boundaries. Here, the initial step is the RNA duplex
formation between the 5’ splice site (5’ss) and the 5’ end of U1 snRNA. Human as well
as viral, e.g. HIV-1, 5’ss sequences however, do not depend on full complementarity
to all 11 nucleotides of the 5’ end of U1 snRNA. So-called cis-acting regulatory
sequences (SREs), which can be bound by SR or hnRNP proteins , can greatly
influence 5’ss recognition, with both positive and negative impacts. Algorithms like the
hexamer-based ‘HEXplorer’, calculating enhancing or silencing properties of regions
in the vicinity of splice sites, as well as algorithms (e.g., MaxEnt, HBond -Score (HBS))
calculating intrinsic splice site strength, aim at reliably describing splice site selection
and uncovering splice variants that may result in different protein isoforms. As it is for
endothelial cell function, suppressing or upregulating specific protein isoforms might
lead to the development of new therapeutic strategies fighting inherited diseases that
can even occur through silent point mutations . To take a step forward in understanding
splice site regulation, we investigated splice donor usage and exon definition in two
model systems. The human fibrinogen Bβ -chain gene (FGB) exon 7 and HIV-1 exon
2/2b both contain neighboring splice donor sites of comparable strength. We show that
those donor sites are regulated via a multitude of SREs, acting in a strict position
dependent manner. Additionally, we dissected the role of hnRNP D in viral pre-mRNA
splicing and found hnRNP A1 and hnRNP D binding to ESSV at overlapping motifs.
Thereby, levels in vpr mRNAs seem to be dynamically regulated. Disrupting only one
of those elements leads to an altered splicing phenotype and might therefore represent
valuable targets for LNA-mediated therapy.
2
Zusammenfassung
Während der mRNA Prozessierung erfordert die Entfernung von intronischen
Sequenzen die genaue Erkennung von Exon-Intron Grenzen. Hierbei ist der erste
Schritt die Bildung eines RNA-Duplex zwischen der 5‘ Spleißstelle (5’ss) und dem 5‘
Ende der U1 snRNA. Humane und virale, z.B. HIV-1, 5’ss Sequenzen benötigen
jedoch keine völlige Komplementarität aller 11 Nukleotide zum 5‘ Ende der U1 snRNA.
So genannte cis-agierende regulatorische Sequenzen (SREs), die von SR und hnRNP
Proteinen gebunden werden können, können die 5’ss Erkennung positiv oder negativ
beeinflussen. Algorithmen, wie der auf Hexamer-basierende ‚HEXplorer‘, der die
fördernden und inhibierenden Eigenschaften der Sequenzen in der Nachbarschaft von
Spleißstellen berechnet, und Algorithmen (z.B. MaxEnt, HBond-Score (HBS)), die die
intrinsische Stärke von Spleißstellen kalkulieren, zielen darauf ab, die
Spließstellenselektion zuverlässig zu beschreiben und Spleißvarianten aufzudecken,
die zu unterschiedlichen Proteinisoformen führ en. Wie bei Endothelzellen könnte eine
Unterdrückung oder Hochregulation spezifischer Proteinisoformen zur Entwicklung
von neuen Therapie-Strategien führen. Therapie-Strategien, die auch stille Mutationen
einbeziehen, könnten auch Erbkrankheiten adressieren. Um dem Verständnis der
Spleißstellenselektion einen Schritt näher zu kommen, haben wir die Benutzung von
Spleißdonoren und die Exondefinition in zwei Modellsystemen untersucht. Exon 7 des
humanen FGB-Gens und Exon 2/2b von HIV-1 beinhalten beide benachbarte
Spleißdonoren vergleichbarer Stärke. Wir konnten zeigen, dass diese Donoren von
einer Vielzahl positionsabhängiger SREs reguliert werden. Zusätzlich haben wir die
Rolle von hnRNP D beim viralen Spleißen analysiert. Hier zeigte sich, dass hnRNP A1
und hnRNP D das ESSV Element an überlappende Motive binden. Dadurch werden
vpr mRNA Level dynamsich reguliert. Die Inaktivierung von nur einem dieser Elemente
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führt zu einem veränderten Spleiß-Phänotyp. Diese Zielsequenzen könnten deshalb
als nützliche Angriffsziele einer LNA-basierenden Therapie dienen.

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