How does the first water shell fold proteins so fast ? Olivier Collet Institut Jean Lamour, Département 1, CNRS, Nancy-Université, UPV-Metz, Boulevard des Aiguillettes BP 239, F-54506 Vandoeuvre-lès-Nancy (Dated: January 31, 2011) First shells ofhydrationandbulksolventplaysacrucialroleinthefolding ofproteins. Here,the role of water in the dynamics of proteins has been investigated using a theoretical protein-solvent model and a statistical physics approach. We formulate a hydration model where the hydrogen bondsbetweenwatermoleculespertainingtothefirstshelloftheproteinconformationmaybeeither mainly formed or broken. At thermal equilibrium, hydrogen bonds are formed at low temperature 1 and are broken at high temperature. To explore the solvent effect, we follow the folding of a 1 large sampling of protein chains, using a master-equation evolution. The dynamics shows a clear 0 mechanism. Above the glass-transition temperature, a large ratio of chains fold very rapidly into 2 the native structure irrespective of the temperature, following pathways of high transition rates n through structures surrounded by the solvent with broken hydrogen bonds. Although these states a havean infinitesimal probability, theyact as strong dynamical attractors and fast folding proceeds J alongtheseroutesratherthanpathwayswithsmalltransitionratesbetweenconfigurationsofmuch 8 higher equilibrium probabilities. At a given low temperature, a broad jump in the folding times 2 is observed. Below this glass temperature, the pathways where hydrogen bonds are mainly formed become those of highest rates although with conformational changes of hugerelaxation times. The ] present results reveal that folding obeys a double-funnelmechanism. t f o PACSnumbers: 87.14.et s . t a To this date, the three-stranded β sheet is the faster tained those protein sequences that have a funnel-like m folder finding its native structure in the amazingly short energylandscape. Inthatconcept,the heightofthe fun- - time of 140 nano-seconds [1]. The protein folding prob- nel represents the conformational energy and its width d n lemisstillconsideredasoneofthemajorunsolvedprob- represents the entropy of the subset of chain conforma- o lems of science [2] and the answerto the Levinthalques- tions of a given energy [16–20]. The top of the funnel is c tion [3] ”how a protein can fold so fast ?” remains a populated by the huge number of denaturated configu- [ ”grand challenge” [4]. rations with a large energy and entropy and the bottom 1 Protein folding is the process whereby a protein folds with the unique native structure of very low energy and v into its native structure. The slowest folding proteins quasi-nilentropy. Eachproteinchainsfoldsfromthe top 2 may require a few minutes due among other factors to of the funnel towards the bottom. 0 proline isomerization [5]. They fold passing through Thetransition-statetheoryandthe folding-funnelpic- 5 many intermediate states. On the other hand, many turearetwodifferentapproaches. Thefirstonedescribes 5 small single-domain proteins fold very rapidly over time wellthetwo-statekinetics,butdoesnotexplainwhyfold- . 1 scales of a few microseconds [6, 7]. For many of these ingissofast. Thesecondoneexplainswellwhyfoldingis 0 proteins,the folding processis asingle exponentialfunc- so fast, andthe thermodynamic free energy barrier,that 1 tion of time [5, 6] and is modeled by a two-state mass givesrisetotwo-statekineticsandmakestransition-state 1 : action model and an Arrhenius diagram on which the theory applicable to the folding process, is essentially of v free energy of some ensembles of chain conformations is entropic nature. i X plotted as a function of reaction coordinate, usually not Latticemodelsofproteinsareamongthefavoritetools r known. Thisdiagramexhibitsatransitionstatebetween forthetheoreticalstudyoffolding. Themicroscopicrep- a the unfolded and the native states [8]. resentation of the proteins is simplified to allow large Moreover, some ultra fast folders exhibit more com- samplingofthe configurationalspace. Proteinsaremod- plex kinetics with non-Arrhenius behavior [10] (i.e. non- eled as self-avoiding-walk chains of beads, which are lo- linear dependence of the logarithmofthe folding rate on cated on a two or three-dimensional square or cubic lat- the inverse of the temperature). Some results show that tice. For small-length chains, a full enumeration of the the activation energy is positive at room temperature, conformations allows the exact calculation of the parti- decreases as the temperature increases and may become tion function, and, thus of statistical averages [21–24]. negative athigh temperature [11]. It has been suggested The Hamiltonian of a given conformation of the chain thatthiscouldarisefromthetemperaturedependenceof results from the interaction of the first neighbors of the the hydrophobic effect [12, 13]. beads on the lattice, but not in the sequence. The more An alternative to this transition-state view is the con- popularmodelofcouplingsbetweenmonomersareknown cept of folding funnel [14]. This energy-landscape pic- astheGõ[22],theHP[21,25–27]andtherandom-energy ture is based on the idea of minimal frustration [15], model(REM) [28–33]. In the Gõ model, the interaction which states that the evolutionary mechanism has re- between the beads of a given compact structure, cho- 2 sen as the native conformation, is set to -1 and all the dynamics[59]. This couldbe responsibleforthe protein- other couplings to 0. In the HP model, the sequence solvent dynamical transition connected with the liquid of the protein is given in terms of a series of hydropho- glass transition of hydration water [60]. These results bic (H) or polar (P) residues and the coupling between showthe importanceofthe degreesoffreedomofthe hy- two hydrophobic beads is set to -1 and that involving at dration first shell for the dynamics of the proteins. A least one polar monomers to 0. In the REM,a matrix of theoretical model of the hydrophobic effect introduced couplings between all pairs of residues is constructed by byMuller[61]andextendedbyLeeandGraziano[62]al- drawing random numbers from a Gaussian distribution. lows to separate the contribution of the hydrogen bonds Despitethenumerousresultsobtainedwithsuchmod- of the first shell and that of the bulk water. The basic els, they fail to reproduce a fundamental feature of a ideastemsfromtheresultthatthehydrationofnonpolar protein : its cold denaturation. This mechanism is as- solutespresentsalargeentropycostandasmallfavorable sociated to the loss of stability of the native structure energy. The hydrogen bond breakage in the bulk is con- upon cooling down the system [34–36]. For half a cen- sidered as a two-state equilibrium between the formed tury, it has been well known that water plays a crucial and the broken hydrogen bonds. The equilibrium con- role in the mechanism of folding [37–39] and an under- stant between the two states is related to the fraction of standing of cold denaturation requires a finer model of formedhydrogenbondsandtothe differenceinenthalpy the solventthanthe temperature-independent attractive and the ratio of degeneracy resulting from the breaking parametersusedin Gõ, HP or REM.Some recentrefine- of one hydrogen bond. A similar description is used for ments of the models, including temperature dependence tothewatermoleculesofthe firstshell. Itconsidersthat ofthehydrophobiceffect,haveallowedtomodelthecold the thermodynamics of a broken hydrogen bond in the transition [24, 40–42] to be described. first shell is the same than that in the bulk and gives a picture of the hydrophobic effect based on the enthalpy Asthephysicsofproteinfoldingproceedsinwaterand gainandentropycostarisingfromthecreationofabond theinteractionsoftheproteinchemicalgroupsaresolvent in both situations. A little bit later, Lee and Graziano mediated,therepresentationofthesolventisofgreatim- [62] pointed out that the energy associated to a broken portance[43]. Thehydrophobiceffectisanactivefieldof hydrogen bond is not the same for a water molecule of research by itself [44–48]. It represents the tendency of thefirstshellandforoneofthe bulk. Thepresenceofan water to exclude nonpolar solutes. It results from a dis- nonpolarsoluteinducesthebreakageofahydrogenbond ruptionofthenetworkofhydrogenbondsbetweenwater of the first shell, leading to a more unfavorable energy molecules caused by the transfer of an nonpolar solute thanthe sameeventinthe bulk. The two-statemodelof into water. The energy variation of this process is fa- the hydrophobic effect has been applied [63] to the two- vorable at room temperature, whereas the entropy cost dimensionalMercedes-Benzmodelofwater[64,65]. Asa leads to a large positive free energy of transfer. In ad- result, they give a spectrum where the non-degenerated dition, the physics of the solvent-mediated interactions groundstate is forthe formedhydrogenbondinthe first of the protein may be captured by studying the interac- shell and the highly degenerated states for the broken tionoftwononpolarsolutesimmersedinwater[43]. This hydrogenbondinthefirstshellcorrespondstothelarger prototypicalinteractioncanbehandledbyaveraginge.g. value of the spectrum. The energies and the degenera- the degrees of freedom of the solvent in the free-energy cies of the formed or brokenbonds in the bulk are found functionoftwomethanesolutesinexplicitwater[49,50]. between the two previously described. Theprofileofthefreeenergyasafunctionofthedistance betweenthetwomethanesolutesshowsadeepminimum Inthispaper,this picture hasbeenreducedfurtherby for the contact distance between the two molecules and gathering together the two close energy levels associated anotherone,lesspronouncedwhentheyareseparatedby to the broken and formed hydrogen bonds of bulk water a distance slightly smaller than one solvent molecule di- [40]andhasbeenappliedtoalattice modelofproteinto ameter. A maximum, higher than the free energy of the studytheeffectofthefirstshellontheproteindynamics. two isolated solutes arises between these two configura- Asidefromthehydrophobicmodelitself,howthesolvent tions. This maximum is known as the desolvation bar- is simulatedhas a significant impact onthe energy land- rier. As the temperature increases, the contact between scape of the protein. Explicit solvent models are very the nonpolar solutes becomes more favorable as the des- computationally expensive [66]. Implicit solvent models olvation barrier is reduced. This barrier tends to favor a have been developed to take into account the solvent as high thermodynamic cooperativity of the model in con- a mean field effect [67–73]. Yet, results obtained from trastwithamodelwithoutdesolvationbarrier[51,52]. It explicit simulations do not always agree with those from has also been shownthat the physics behind this barrier implicit models [74, 75]. Up until now, the strategy to is responsible for the large diversity in the folding rates, follow the kinetics of the proteins consisted in averaging similar to what is observed experimentally [53] the degrees of freedom of the solvent by calculating the Moreover, recent experimental work has shown that freeenergyofsolvationofeachproteinstructureandthe structural fluctuations of the solvent may control struc- transitionratesbetweentwoproteinconformations. The turalfluctuations ofthe protein[54–58]. Ithasalsobeen system evolves along effective routes made of conforma- observed that motion of hydration water drives protein tions surrounded by an averagedsolvent. 3 Here,asthesolventmodelallowsit,wehavecalculated iandjaredrawnatrandomfromaGaussiandistribution the rate between two protein-solvent microscopic configu- centered on −2 with standard deviation equal to 1 [29]. rations and grouped together some equivalent transitions. Such a way of designing the sequences leads to create a Thephysicalpathwaysaremicroscopicroutesinthepro- configurationalspacewithsmallenergygapsbetweenthe tein and the solvent configurational space, not ”mean” structures of bottom of the energy spectrum. A particu- routes in the conformational space of the protein sur- lar compact (native) structure does not emerge as a sta- rounded by an effective solvent. bleconformationofthesequencewithalargeenergygap The dynamics of a large set of chains in the solvent with other compact conformations. To increase the sta- is calculated using a master equation evolution. In the bility of the native conformation of the sequence[76, 77], spirit of the concept of folding funnel [14, 16, 17, 19], a weselectacompactconformationforthenativestructure picture of the folding in terms of two surfaces, depend- of the sequence and we rank the couplings such that the ing on the state of the hydrogen bonds of the first shell minimum ones are associated with the native contacts. solvent, drawn in an entropy-energy plot, is given. The mechanismsresponsibleforthe fastfolding andthe glass transition are detailed in the body of the paper. In the B. Solvent Model first part, the protein and the solvent models are described. In the second part, the equations of the evolu- For each chain conformation, the empty nodes of the tion are established. In the third part, the mechanism, lattice models the solvent effect[24, 40]. We do not at- whichoccursduringthe fastovercomingofkinetic barri- tempt to introduce a fine description of the structural ers is explained, then the mechanism responsible for the properties of solvent around proteins itself, but we de- glass transition is revealed. scribearealisticsolventeffectontheweightsofthechain conformations. The bulk water contribution is simply modelled by an I. MODEL. extensive negative free energy term which guides chains towards compact structures. The microscopic structures ThemicroscopicHamiltonianofthechaininconforma- ofthefirstshellsolventaroundanygivenchainconforma- tionm,surroundedbyafirstshellofsolventmoleculesin tionareseparatedintotwogroupsdependingonwhether configuration β and bulk solvent molecules in structure most of the hydrogen bonds are formed or not. Hence, α is denoted : eachproteinconformationhas two possible values for its Hmic =Hch+Hshell+Hbulk energy depending on the structure of the first shell: one mαβ m mβ mα for a ground state (GS) associated to a rather organized The first term results from the intrachain interactions, firstshellandanother one foran excitedstate (ES) with the secondone from the contribution of the molecules of mainly broken hydrogen bonds. the first shell solvent in interaction with the protein and For each chain conformationm, the first shell interac- the last one from that of the bulk water. tion is extensive with respect to A . The links between m a solvent node and the chain beads account for the first shell contribution. The non-degenerated ground state A. Protein Model denoted by β = 0 models the first shell water molecules with formed hydrogen bonds around the protein. It is The proteins are represented as self-avoiding walk takenastheenergyreferencewhichequals0. Theexcited strings of N monomer beads located on a two- states,correspondingtoβ ≥1,areforthe gAm firstshell dimensional lattice [21, 23, 33] (here N = 12). This sh structures with broken hydrogen bonds. Their energy is length of the chain is short enough to allow analytical A ε . TheHamiltonianofthefirstshellsolventforthe m sh calculations for the dynamics and long enough to give chain structure m is written : interesting results. The compactness of a structure m is the number of intrachain contacts of the chain confor- σ(0)=0 mmaotnioomnemrs:iaCnmdj=areifi≥rjs+t3n∆ei(igjmh)bowrhseornet∆he(ijmla)t=tic1eaifntdh0e Hmshβell =Amεshσ(β) with (cid:26)σ(β)=1 if 1≤β ≤gsAhm P otherwise. The accessible surface area of the conforma- Whenoneintrachaincontactisformed,twomonomers- tion m to the solvent is defined as the number of links solventbonds arebroken. Then, after removingthe con- between the chain beads and the empty sites of the lat- stantterm,thepuresolventcontributionisasimplefunc- tice : Am =2N +2−2Cm. The intrachain Hamiltonian tion of 2Cm[24, 42]. The factor of 2 guarantees that the of the peptide structure m is : solvent volume does not depend on the chain structure. Hch = B ∆(m) For each chain structure m, the gb2Ckm-fold degenerated m ij ij Hamiltonian of the pure solvent is independent of the i≥j+3 X bulk micro-state : To model the heterogeneity of the sequence of amino- acids of the chain, the couplings B between monomers Hbulk =2C ε for 1≤α≤g2Cm ij mα m bk bk 4 ergy (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) hhhyiiggdhhrb odergnoeekgenree gnnbyeornadcsy is: Z(T) == Xmm ggαXb2b2=CkCkm1mgβXesA=hxm0pe(cid:18)x−p H−mchH+TmmTHiαcβmbu!αlk(cid:19) en (cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:0)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1)(cid:1) lnhooywnd −feronodrgeemreggneeyn dbeornadtesd toToiffohPnceomaenuqlapsdtplieiavntceegerscmooBfniniftjoehdrea(cid:20)Xmnb1caydh+taaisoigonfnsAulhvamlielstneltetnohxwueppmast(cid:18)rteear−rmumapcAtetieomturTenraεretsoshuofur(cid:19)ftesh(cid:21)l.eaedFrcgohoernesrttfoehv,reamtl(suh1eaeet)- native conformationis a compactstructure of intrachain FIG. 1: The solvent around a chain conformation chosen at energy -9.895. The folding transition temperature is de- random. The unique solvent configuration where the hydro- fined as, the melting temperature T of the experimen- gen bonds between water molecules and between water and m talliterature[78,79]atwhichtheequilibriumprobability the chain are formed (shown in the left picture) is the non- degeneratedgroundstate(GS)ofthefirstshellandtheother of the native structure equals that of all the other de- structures (one is shown in the right picture), where the hy- natured conformations One specific chain structure (the drogen bondsaremostly broken,are groupedtogetherin the native conformation) has a larger equilibrium probabil- highlydegenerated excitedstate(ES).Only,thehighly orga- ity tooccur thanallthe otherconformationsfor T T (here T = 0.45). Last, the prob- 0 0 ability of occurence of the native structure with of the The results given in the paper hold while the parame- first shell solvent in ES equals that in GS at a specific ters are ranked as follow : 0 < ε < ε and g < g . temperature denoted T∗ (here T∗ =0.54). bk sh bk sh In the spirit of the results obtained by Silverstein et Wenoteinpassing,asthesolventparameteroftheGS al[63], the values of the solvent parameters are ranked ofthefirstshellislowerthanthatofthebulk,itcouldbe as follow ε = 0.2, ε = 0.6, g = 2 and g = 3. possibletoobservecolddenaturationofthechains,ifthe bk sh bk sh The reported results in this paper are quite robust with GS of the extended chains would be the state of lowest regardstochangetheparametersholdingtheaboverank- energy among the whole configurational space [24, 42]. ing equation. However, for some technical reasons (dis- Here, however, the parameterization chosen avoids this cussed below) if g or/and g are chosen too large, the possibility inorderto study only the folding mechanism. bk sh computational times of the calculation becomes too pro- Figure3showstheconformationaldistributionasfunc- hibitive. tion of the number of native intrachain contacts calculated as follow : The energy and the degeneracy of the ground and excited macro-state of each peptide conformation are : F (Q)=−T ln δ(Q−Q ) g exp(−Hmac/T) T m mσ mσ m σ X X Hmmaσc =Hmch+2Cmεbk+σAmεsh with σ =0 or 1 where δ(0 = 1 and 0 otherwise and Qm is the number g =gσAm g2Cm of native contact of the chain structure m. Under dena- mσ sh bk (cid:27) tured conditions (T > T ), the free energy profile show m a barrier between the native and non-native conditions. Thesetsofconformationwithoneortwointrachaincon- tacts, surrounded by solvent in ES (see fig. 4) have the largestprobabilityofoccurrence. Atthemeltingtemper- C. Results for the chain in interaction with the solvent ature, the same barrier still separates the equiprobable native and non-native populations. Under strong native condition(lowtemperature),theshapeofthefreeenergy The thermal equilibrium probability of each macro- profile is similar to that observe for a downhill folding. state is given by : Pmeqσ =gmσexp(−Hmmaσc/T)/Z(T) and Indeed, as the temperature decreases, the more prob- that of a chain structure is Peq = 1 Peq . Here the able non-native population shifts from the sets with few m σ=0 mσ Boltzmannconstantissetto1andthepartitionfunction nativecontactstothatwiththemaximalnativecontacts P 5 1 conformation m is : peq Hshell A ε gAmexp(−A ε /T) H-bonds broken Ushell(T)= αβ mαβ mβ = m sh sh m sh m peq 1+gAmexp(−A ε /T) P αβ mαβ sh m sh y blit and the heat caPpacity is : a0,5 b dUshell A 2ε2 gAmexp(−A ε /T) o cshell(T)= m = m sh sh m sh pr H-bonds formed m dT T2[1+gsAhmexp(−Amεsh/T)]2 Thesecurvesasfunctionofthetemperatureonlydepends onthechainexposuretothesolvent,i.e. onthecompact- ness (fig.4). They exhibit a maximum at the same tem- 0 0 0,5 1 1,5 T 250 A =14 (C =6) m m FIG. 2: Equilibrium probabilities of occurrence of the native Am=18 (Cm=4) structure (black solid line) as functions of the temperature 200 Am=22 (Cm=2) (giveninarbitraryunits)withthecontributionoftheground H-bonds Am=26 (Cm=0) state (red long dashed line) and of the excited state (green T)150formed thdhyaesdhrpeordgoeblnianbbei)oli.ntydAsttoaaroebtesbmerropvkeeerhanytudbrreeocgoTem0n,ebsthosneigdpnsriofiabrcoaaunbntilditaynthdtehaanttatTtihv∗ee, shellc(100 Hb-brooknedns conformationisthesameasthattoobservewaterwithbroken hydrogen bonds. The probability of occurrence of the native 50 T0 structureequals 1/2 at Tm. T* 0 0,4 0,6 0,8 T 7 T=0.45 T=0.90 FIG. 4: The heat capacity of the solvent around the chain Q) 5 T=1.35 structures depends on the compactness of the conformation. ( At low temperature, the chain are surrounded by rigid cages P n 3 of water molecules. The higher the compactness, the higher T l is the temperature of occurrence of the chain with broken − hydrogen bondsof thesolvent. = 1 Q) perature: T∗ =0.54. It is the temperature of equiproba- F( −1 bilityofoccurrenceofthetwophases: brokenandformed hydrogenbondsofthefirstshellaroundthepeptide. For −3 T < T < T∗, the solvent configurations with a water 0 0 2 4 6 cage around the peptides is preferred to the broken hy- Q drogen bonds. For T < T , it is the only relevant state. 0 Above T∗, the solventoccurs in the excited macro-state. This is in good agreement with the result obtained for FIG. 3: Free energy profile for thelattice model at thethree the thermodynamics of the chains presented above. temperaturesindicated. P(Q)istheprobabilityofoccurrence overQ at thermal equilibrium. II. TIME EVOLUTION. D. Results for the solvent at equilibrium To explore all the possible routes from the non-native structures to the native conformation, the probabilities of each micro-state, composed of one protein structure Atthermalequilibriumwith abath attemperatureT, in interaction with one solvent configuration, evolve us- theprobabilityofoccurrenceoftheconformationmwith ing a continuous time Markov process applied to a large the solvent in micro-state (αβ) tend towards : pemqαβ = sampling of peptides. exp −Hmic /T /Z(T). Master equation approach to protein folding has al- mαβ ready be used in lattice model with an effective solvent (cid:16) (cid:17) Themeanenergyofthefirstshellsolventaroundchain [80]. ItisshowninappendixA,thatamasterequationof 6 the macro-statesmay be deduced from the master equa- 6. They exhibit some findings on the out of equilibrium tion of the micro-states. In a finite time approach, the folding of a large sampling of chains at different temper- probabilitiesofthemacro-statesevolvefollowingtheEu- atures. ler algorithm[81] : Figure5showsanon-Arrheniusbehaviorofthemodel. Because of the tiny value of δt, the early events of the Pmmσac(t+δt)=Pmmσac(t)+δt Ymσ,m′σ′Pmm′aσc′(t) folding are shown, here. The remaining part of this plot m′ σ′ will be deduced from the results given below. It will XX be shown that even if the curves may be well fitted by a where Vogel-Fulcher-Tammanfunction(t (T)∝exp(−E /(T− p a V(0) T0))), which is the signature of an α-relaxation with a Ymσ,m′σ′ =gmσ τmmimc′(1+exp((Hmmaσc−Hmma′σc′)/T)−1 dynamical temperature T0 = T0(p), the remaining part m,m′ of the curves exhibits a more complex shape which can not be capture by effective solvent models. for m6=m′ or σ 6=σ′ and Ymσ,mσ =− Ym′σ′,mσ 0.002 0.003 m′σ′6=mσ T=0.10 T=0.20 X y As explained in appendix A, Vm(0m)′ = 1 if structures m abilit 0.001 0.002 and m′ are connected by a one monomer move (either ob 0.001 a corner flip or a tail move) or if m = m′. The charac- pr teristic time associated to a chain move (τmm,imc ′ = τc if 0 0 m 6= m′) and to a solvent move (τmic = τ if m = m′) T=0.30 T=0.40 m,m′ s y 0.150 are set to τc =1 and τs =0.001≪τc. bilit 0.020 a 0.100 −12 ob 0.010 p=0.20 pr 0.050 0.000 0.000 −20 −15 −20 −15 −10 −14 ln(t) ln(t) ) p=0.02 p t ( n l FIG.6: Evolution oftheprobabilities of occurrenceofnative −16 structure (back solid line), the contribution of excited state (green dashed line) and of theground state (red long dashed line) as functions of the time at different temperatures. For temperatureof0.10 and0.20, somechainstopologically close −18 tothenativestructurereachitveryfastbecausenoactivation 2 2.2 2.4 2.6 2.8 3 3.2 barrier occurs in their pathway. Then, the probability of the ES decreases monotonically to zero and that of the native 1/T structure reach a plateau and the kinetics is frozen. As the number of chain structures of the basin do not depend on the temperature, the plots have very similar shapes and the FIG.5: Logarithmofthewaitingtimetptoobservethenative valuesoftheprobabilitiesareveryclosetoeachothershowing structure with a probability equal to p plotted as a function that a local phenomenon is taking place. For temperature of the inverse of the temperature for p=0.02 to p=0.20 by of 0.30 and 0.40, the ES of the native conformation (which steps of 0.02. have a null equilibrium probability) acts as an attractor, in the early events, and reach very rapidly a maximum of its Asufficientconditiontoconservethenormoftheprob- probability of occurrence, much larger than its equilibrium abilityvector(i.e. Pmac(t)=1)issatisfiedbyfixing probability. A fast transition takes place towards the GS of mσ mσ δt=1/max {Y }. As the values ofg σ andthen the native structure. Then, a slower dynamic regime guides mσ mσ,mσ m P theotherchainstowardsthenativestructure. Now,thevalues those of Ymσ,m′σ′ may be huge, the value of δt is tiny. oftheprobabilitiesdependonthetemperaturesshowingthat Then,theevolutionoftheprobabilityvectorisveryslow. a global mechanism dominates. The simulations of folding start with the initial condition : Pmac(0) = 1/2N where N = 15019 is mσ conf conf the number of chain structures. The probability of oc- Figure6showsthat,evenifitsequilibriumprobability currence of conformation m after time t is P (t) = is infinitesimal, the excited state of the solvent acts as a m Pmac(t)+Pmac(t). The waiting time to observe the na- strong dynamical attractor above a particular tempera- m;0 m;1 tive structure with a probabilityp is notedt . The main ture to be discussed later. Below this temperature the p results of the calculation are summarized in fig.5 and kinetics is the same whatever the temperature. 7 III. RELAXATION TIMES OF THE MOVES. Tp1 TS1 Tp2 TS2 Nat −3.866 −3.284 −6.026 −5.165 −9.895 Onlytwoconnectedmacro-states(mσ)and(m′σ′)are considered for a while. The equations 6 and 7 show that the rate of the transition (m′σ′) → (mσ) depends on reaction coordinate the degeneracy of the macro-state (mσ) and not of that of (m′σ′). In other words, the increase of the prob- p=0.35 p=0.75 ability of (mσ) and the decrease of that of (m′σ′) is −5 due to the degeneracy of (mσ) and to the difference of energy between the states with (m′σ′). After thermal ) equilibration, the probability of (mσ) would go towards T ( −10 p=0.30 oPfm(∞eσq)u=atiPomneqsσ/6(,Pfomerqσo+nlyPmetqw′σo′)stTahteessioslu:tion of the system ln tp Tg p=0.65 0.2 0.3 0.4 Pmmσic(t)=Pm(∞σ)+[Pmσ(0)−Pm(∞σ)] exp(−t/τmσ,m′σ′)] −15 glassy 0.6 0.5 p with a very small relaxation time : 0.4 dynamics 0.3 τmσ,m′σ′ =(Ymσ,m′σ′ +Ymσ,m′σ′)−1 ≪τmm,imc ′ (2) 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 T which now depends on the energies and degeneracies of the macro-states. While numerous chains initially in FIG. 7: Top: A possible pathway with five chain structures state (mσ) move into state (m′σ′), some of them may connected byone monomer movesending in Nat taken as an gobackto (mσ). As aconsequence,the relaxationtimes example to capture the role play by the solvent in the fold- depend on forward and backward rates of a move. As ing kinetics. The energy of the GS is given above of each an aside, if the move from (mσ) to (m′σ′) were allowed conformation. A single route from Tp to Nat is considered, 1 andnotthebackwardtransition,thentherelaxationtime to simplify the study of this first approach, and the reaction would simplify to 1/Ymσ,m′σ′. coordinate is simply a function (not given) of the number of As the degeneracy ofthe excited state is alwayslarger conformational changes necessary toreach Nat. Bottom: the than that of the ground state, the value of the rates be- waitingtimestoobservearatiopofproteinsinNat,starting tween two excited states of the chain is larger than that from an equiprobability of all the states, show a glass transition at temperatures dependingon p (shown in theinset). between two ground states (if the energy difference is of the same order) As a consequence, the relaxation times oftheformertransitionsarealwaysverysmallatnottoo lowtemperature. Theyaresupposedtosimulatepeptide problem. This pathway consists in five chain structures evolving in a fluid solvent. In contrast, the relaxation connected by one monomer moves. In contrast with the times of the latter transitions are larger. This models whole conformational space where there exist a great chainsevolvinginaviscousmedium. Thus,thedynamics number of routes from a given conformation to the na- ofthe chainssurroundedby waterwith brokenhydrogen tive structure, in this section we first consider a sim- bonds is faster than that of low degenerated structures plified trajectory where there is a unique pathway (via in interactionwith solventwith formed hydrogenbonds. TS , Tp and TS ) from Tp to Nat. Structures Tp 1 2 2 1 1 In addition, the more extended the structure, the and Tp have five intrachain contacts and thus, smaller 2 larger the degeneracy of the excited states and the energy than TS and TS which have three intrachain 1 2 smaller is the relaxation time. This is because a more contacts. Then, the GS of the structures Tp and Tp 1 2 extended chain has a larger exposure to the solvent and should act as kinetics traps and that of TS and TS 1 2 thus a lot of hydrogenbonds are brokenin the first shell as transition states towards the native conformation. At and as a consequence the dynamics is faster. t=0, the initial probabilityofeachmacro-stateis setto Last the connexion between the excited and ground P(t = 0) = 0.1. An Euler algorithm is applied to simu- states of the same chain conformation (m ≡ m′) have a late the evolution of the probabilities of the ten macro- small relaxation time because τs ≪ τc. The difference statesofthis subsystemcomposedbytheESandthe GS between that case and the fluid connexion depends on of this five chain structures. The waiting time t to ob- p the ratio τc/τs. serve the native structure with a probability equal to p is plotted for p = 0.30 to p = 0.65 by steps of 0.05 as function of the temperature. At t=0,the probabilityof IV. FAST FOLDING MECHANISM occurrence of Nat is already 0.20 and for p < 0.30, the waitingtimeistinysinceamanychainsintheTS states 2 Tounderstandthemechanismunderlyingthefastfold- fold instantaneously in Nat. For T < 0.20, the waiting ing, a possible pathway leading to the native structure, timetoreacharatiop=0.30becomesconstant,butthat shown in fig.7, is considered as a first approach of the to observe a larger ratio become huge. 8 For p > 0.30, the waiting times increase continuously Hmmiσc (TS 1;ES) T=0.10 as the temperature is decreaseduntil a temperature, de- (TS ;ES) 2 pending on p and denoted by Tg(p), where a broad dy- 6 (Tp1 ;ES) nbaovinnfiaeadFcmdteohiapiggmic,esulaaenrvlsssedesmtevryr8nyaeabrtlnlsyfesahtlsiiosstoymmtiwwso,te.nase,slmolott.lhc0.vc,eeuTntvrhthsee.ertyrTpEarhneSoeasbirokatlfiybionNinleei.atvtityecnAsrotetifslsataoflxhfuetiientdEmhtoeaSpbtefoohrofvaeldetNuGinTarSgget −−−402642 (Tfast solvent p 1;GtransitionS) (Tfast solvent S 1;GtransitionS) (fast solvent Tp 2;transitionES) (TS 2;GS) fluide(Nfast solvent at;EtransitionS) 0.8 0.8 −−180 (Tp 2;GS) viscous T=0.10 T=0.20 (Nat;GS) y t bili a 0.4 0.4 reaction coordinate b o r FIG.9: Thedirection and magnitudesof thefluxof thecon- p ln(t) ln(t*) 0 0 0 nexionofthepathwayshowninfig.7att0 andT =0.10. The larger the flux, the wider is the line. Connections with tiny 0.8 0.8 T=0.30 T=0.40 fluxare not drawn. y I II III IV t abili 0.4 0.4 Hmmiσc (TS 1;ES) T=0.40 b (TS 2;ES) o (Tp ;ES) r 6 1 p F(bIlGac.k08−:so2.li0Edvloinluetsi)ol−nan1n(otd0)ftthheeEprSob(0ga−rbe2iel0intidesasohfetl−dhn1el(itn0n)east)ivaensdtrt0uhcet0uGrSe −−−402642 (Tfast solvent p 1;GtransitionS) (TS 1;GS) (fast solvent Tp 2;transitionES) (TS 2;GS) fluide(Nfast solvent at;EtransitionS) f(orerddilffonergendtastheemdpleinraetsu)rceosn.tributionsas functionsofthetime −−180 (Tp 2;GS) viscous (Nat;GS) At low temperature (T = 0.10 or T = 0.20), half of thechainsinconformationTS foldinNatandtheother 2 reaction coordinate half goes to Tp between the time t and a tempera- 2 0 ture dependent time, t∗ after which the probability of FIG.10: Samethanfig.9atT =0.40. FluxintheGSpathway occurrence of the native structure becomes constant for is thesame for both simulations. a while. Then, a long plateau with p≈0.3 occurs where the dynamics is glassy. At higher temperature, the probability of occurrence GS of Nat. During this period, the ES of all structures ofNatatt0 becomeshigherandthelengthoftheplateau relax to the GS. Between the times t0 and t∗, TS1 and smaller. Many chains in the Tp1, TS1 or Tp2 jump to TS2 relax to Tp1, Tp2 and Nat. The probabilities of GS Nat. At T = 0.40, the probability of the ES becomes of Tp1, Tp2 and Nat increase until all other state have very high (≈ 0.3) at a time denoted by t in the early ainfinitesimalprobabilityandthe probabilityofthe Nat M events and the probability of Nat equals 0.8 very fast. increases to one half of that of TS2. Then, all the fluxes Betweent and t∗, the solventof the chains in ES relax become tiny and the dynamics is frozen. M in GS. Here, the ES of Nat acts as a strong dynamical At T = 0.40, the equilibrium probabilities of the ES attractor. are infinitesimal. Then, we could also expect a kinetic The instantaneous flux from (m′σ′) to (mσ), given which would only pass through the ground states, as for by km′σ′→mσ = Ymσ,m′σ′Pm′σ′(t)−Ym′σ′,mσPmσ(t) can T = 0.10. Instead of this, the sampling of chains finds alsobe calculated. Figure9 showsthat, atT =0.10,the another strategy to overcome the barrier very fast. At kinetics is only guided by the difference of energy of the time t , the probability of the GS of Nat is already of 0 micro-states. 0.6. Thefluxbetweenthepairsofstates,drawninfig.10, The solvated chains have a very large probability to show that the chains in GS of Tp do not fold via the 1 movetowardsamicro-stateoflowerenergy. Betweenthe GS of the other structures of the pathway. First, they initial time and t , the ES of Nat relax very fast to the reach the ES of Tp and then they pass through the ES 0 1 9 ofthe other structuresandlastlythey relaxto the GSof Nat. This is a consequence of the larger transition rates 20 between the ES than between the GS. In addition, the T=0.10 entropy probabilities of the ES remain very small. el n The chains follow a pathway with large transition rates 10 n beeqtuwaelsentheimopurtogbaobinleg ksteaetpeisngfotrheiwrhpicrhobathbielitiinesgsominagll.flux nergy ES fu in theR GelSa xbaatriroenl proAbtatbiimliteiets0,otfhteheprEobSaabrielitqyuoafsiN-nautlli.s Tarhoeunfldux0.v7i.aTthhee e 0 Gs barrel rap zone in theT GraSp bpainrrgel ES pathway is the same as via the GS pathway. The T kinetics become very slow and then a plateau occurs in −1−020 −10 0 10 20 the curves of the probability of Nat as a function of the time shown previously. 20 T=0.40 entropy V. HOW WATER LUBRICATES OR FREEZES THE FOLDING. A PHYSICAL PICTURE. 10 Excitation y g in the ES funnel Curves of figs. 6 and 8 are not exactly the same but er are similar. The basic mechanisms found for the direct en Folding fold in the case of the five-chain conformations pathway 0 in the ES funnel Relaxation may be extended to the whole configurational space of in the GS of Nat the protein. Puttogether, the results ofthis paper allow us to give the picture of the folding given in fig.11. To −10 −20 −10 0 10 20 draw one of the envelop in the energy-entropy plot, the entropy,notedS (E)forσ =0,associatedtoagivenmi- σ croscopic energy, is calculated from the number of chain andsolventconfigurations,withformedhydrogenbonds. FIG. 11: Top: At T = 0.10, the chains in any energy level oftheES-funnelrelax veryfast in theGS-barrel. Then,they The same calculation, of the entropy noted S (E) for σ movedownslowlyinthebarrel,theyreachthetrapzoneand σ = 1, is done for the solvent without hydrogen bonds. the dynamics is frozen. Only a tiny fraction of the chains, The two functions S (E) are related to the total num- σ synthesizedinchainstructuresveryclosetoNat,reachitina ber of protein-solvent configurations whose total energy reasonabletime. Bottom: Thepictureofthefoldingathigher matches the energy values E: temperature but below T where the ES of the chains still 0 hasaninfinitesimalequilibriumprobability,depictsadifferent Sσ(E)=ln[ δ(σ−σ(β)) δ(ε)(E−Hmmiαcβ)] mechanism. AtT =0.40,thechainsintheGS-barrelmoveto m α,β theES-funnel. Then,mostofthemfoldveryfasttowardsthe XX bottom of the ES-funnel (in the ES of the native structure) where δ(ε)(x) = 1 if −ε/2 < x < ε/2 and 0 otherwise. andtheyrelaxinthebottomoftheGSbarrel(intheGSofthe They may be written as functions of the degeneracy of nativestructure). Theygetroundthetrapzonebypassingin the macro-states: theES-funnelwherethetransitionratesareveryhigh. Afew chains relax in the GS-barrel during their descent in the ES- S (E)=ln[ g δ(ε)(E−Hmac)] σ mσ mσ funnel and then they have slow dynamics. The temperature m where the folding mechanism switches from one scenario to X theother one is theglass temperature of thesystem. Moreover a parameter θ allows one to distinguish m between the structures of the bottom of the configura- tionalvalleys,whichmaybekineticstrapsinthefolding. One defines θm =1 for the macro-states,only connected where gm;0 and Hmma;0c are for the degeneracy and energy to macro-states of higher energies and 0 otherwise. Al- of the GS of the structure m. though the native conformation satisfies to this defini- Figure 11 shows the three surfaces drawn on the same tion, it can not be considered as a trap and the value of plot. The GS-barrel (respectively ES-funnel) is associ- θ is set to 0. Considering the five structures of fig. 7, Nat ated to the GS (respectively ES) of the chain structures. 9 and 10 as an example, one has θ = θ = 1 and Tp1 Tp2 A part of the surface of the GS-barrel is populated with θ = θ = θ = 0. Thus, the envelop of the trap TS1 TS2 Nat the trap conformations We have already shown, in this region in the energy-entropy plot is a subset of the GS paper,thattheconnectionsbetweentwochainstructures barrel, given by : in the ES-funnel have small relaxationtimes and that in S (E)=ln[ θ g δ(ε)(E−Hmac)] the GS-barrel long relaxation times. This results from Tp m m;0 m;0 thefollowingmechanism. Asingleproteinanditssolvent m X 10 isinagivenconfiguration,atagiventime,whichbelongs Appendix A. to a corresponding macro-state, and not in all the configurations of a the macro-state. As a consequence, the The probability of occurrence of the conformation m transition rates between one protein-solvent configura- andthesolventinmicro-state(α, β)attimetisdenoted tion of the macro-state (mσ) and those of a macro-state bypmic (t). Themasterequationofthesystemiswritten (m′σ′) depends on the energy difference between these : mαβ states and also on the degeneracy of (m′σ′) but not on the degeneracy of (mσ). dpmic Inparticular,theconnexionfromagivenconfiguration dmtαβ = Xmαβ;m′α′β′ pmmi′cα′β′ (3) of the GS to those of the ES of the same chain confor- mX′α′β′ mation involves a huge number of routes which increase the energy On the opposite, a few connexions allow the where Xmαβ;m′α′β′ = X(m′α′β′ → mαβ) is the transition rate from configuration (m′α′β′) to (mαβ). The backward transition which decreases the energy. diagonal terms which take into account of the transition from (mαβ) to the other configurations, are : At ”very low” temperature, the proteins and solvent follow pathways which minimize the microscopic energy. Then, they very slowly evolve, along the few routes of the Xmαβ;mαβ =− Xm′α′β′;mαβ GS barrel and fall rapidly in some trap conformations. (m′α′βX′)6=(mαβ) At ”not too low” temperature, proteins and solvent fol- The detailed balance conditions, low pathways where the number of routes is maximized. Then, they quickly evolve along the vast possibilities of Xmαβ;m′α′β′pemq′α′β′ =Xm′α′β′;mαβpemqαβ (4) routes of the ES funnel without traps and reach very fast allow to write the rate of transition as : the native structure. V(0) glaAsss titrahnassitipornevwiohuicshlysbepeeanrasthesowthne, tthweotmemecphearnaitsumresoisf Xmαβ;m′α′β′ = τmmm,immc′′ aT(Hmmiαcβ;Hmmi′cα′β′) (5) not clearly defined because it depends on the ratio of folding proteins where V(0) = V(0) = 1 if the two structures are mm′ m′m In addition, we mention that, the calculation of the connected by a corner flip and tail moves[82] (see partition function is independent on the informations fig.12)whatever the solvent configurations and 0 other- concerningthenetworkofconnexions. Asaconsequence, wise. Theacceptancefunctionisa (x;x′)=[1+exp((x− T the glass temperature is not related to the temperatures x′)/T)]−1andτmic isasymmetricfunction: τmic =τ m,m′ m,m′ c (T0, T∗ and Tm) defined above. This explains why the if m6=m′ and τmm,imc ′ =τs if m=m′. excited states of the first shell lubricate the folding un- Theprobabilityofoccurrenceofthe macro-state(mσ) derconditionswhereonlythegroundstateshavenon-nil at time t denoted equilibriumprobabilitiesandwhythefoldingisfrozenat lower temperature. Pmac(t)= pmic (t) δ(σ−σ(β)) mσ mαβ α,β X VI. CONCLUSION. where δ(0) = 1 and δ(n) = 0 if n 6= 0 and the following relations : We have shown that a model of protein-solvent which takes into account the difference of degeneracies of the pmmi′cα′β′ = pmmi′cα′β′δ(σ′−σ(β′)) bulk solvent and the first shell solvent with mainly α′β′ σ′ α′β′ X XX formedormainly brokenhydrogenbonds permitsanun- = Pmmσac′ derstanding of the mechanism which may lead to quasi- σ′ X instantaneous folding of a sufficiently significant ratio of the proteins in solution. Figure 11, shows that two dis- tinct folding mechanisms exist. Inthe firstone,the fold- δ(σ−σ(β))=gmσ ingtimesareverylargeandinthesecondoneveryshort. αβ X will be used below. Now, we rewrite the master equation 3 as : Acknowledgments dpmic mαβ Acknowledgment to Christophe Chatelain and δ(σ−σ(β))= dt BertrandBercheforhelpfuldiscussionsandtoRosemary αβ X Harris and Chris Chipot for critical reading of the δ(σ−σ(β))Xmαβm′α′β′ pmmi′cα′β′ manuscript. αβ m′α′β′ X X

How does the first water shell fold proteins so fast ?

Similar How does the first water shell fold proteins so fast ?