云南植物研究 !##5，9:（-）：-$"_-$8 2,’& ;"’&)(,& <$))&)(,& 我国盾叶薯蓣居群遗传结构分析! 黄春洪，杭悦宇!!，周义锋，史德荣，郭可跃（江苏省中科院植物研究所（南京中山植物园）江苏省植物迁地保护重点实验室，江苏南京 !"##"$）摘要：利用随机扩增多态%&’（(’)%）标记，分析研究了中国""个盾叶薯蓣居群*!个个体的遗传多样性与遗传结构，"+个寡聚核苷酸引物扩增共得到"#*条带，其中,-条为多态带，占**.*,/。0123343多样性指数（!）为#.5#,5，居群水平的变异从#."+-$到#.5#,*，物种水平的&67基因多样度（"）为#.!$,,，居群水平的变化范围为#."-#8到#.!"58。遗传变异分析表明，物种水平的基因分化系数 # 为#.5$"+，居群间的基因流 & 为#.,-$"，居群间遗 $% ’ 传交换小。分子方差分析（’9:;’）表明，居群内变异为-*.,-/，地区间变异为",.$+/，居群间变异为"".+*/。聚类结果以长江为界，将盾叶薯蓣分为南北两个大类群。研究结果对盾叶薯蓣种质的迁地保护有重要意义。关键词：盾叶薯蓣；(’)%；遗传多样性；遗传结构中图分类号：<,$5 文献标识码：’ 文章编号：#!+5=!8#（# !##5）#-=#-$"=#8 !"#$%&’(") *+)+’(, -’.$,’$.+ "/ !"#$%#&’( )"*+",’&’*$"$ () 01()& >?’&@ A1B3C>43D，>’&@ EB6CEB""，F>:? E7CG63D，0>H %6C(43D，@?: I6CEB6 （!($%)%*%+,-.,%/(0，1)/(2$*34,5)(6+/(78")(+$+96/7+’0,-:6)+(6+$，1)/(2$*34,5)(6)/;<+0=/>,4/%,40 -,43;/(%?@J :)%*J 8,($+45/%),(，&23K73D!"##"$，A1732） 234’.&,’：@636L7MN7O6PQ7LR23NS4SBT2L743D636L7MQLPBMLBP673*! 73N7O7NB2TQUP4V""W7TN23NMBTL7O2L6N S4SBT2L743Q4U A),$6,4+/B)(2)>+4+($)$ AJ >J XP7D1LJ W6P6QLBN76NYR(’)%V2PZ6PQJ "#* T4M7 W6P6 73C N63L7U76NW7L1"+ 4T7D43BMT64L7N6SP7V6PQ，4BL4UW17M1,- T4M7W6P6S4TRV4PS17M23N2MM4B3LU4P**.*,/ 4UL4L2T D636L7M N7O6PQ7LR 2L QS6M76Q T6O6TJ 0123343’Q 73N7M6Q 4U N7O6PQ7LR（!）O2P76N UP4V #."+-$ L4 #.5#,*，23N&67’QD636N7O6PQ7LR（"）O2P76NUP4V#."-#8L4#.!"582LS4SBT2L743T6O6T，W7L1 ![#.5#,5 23N "[#.!$,,2LL16 QS6M76Q T6O6T，P6QS6ML7O6TRJ @636L7M O2P723M6 232TRQ7Q Q14W6N L16 M46UU7M763L 4U D636 N7UU6P63L72L7437Q#.5$"+2LQS6M76QT6O6T，23NL16D636UT4W2V43DS4SBT2L743Q4U A.B)(2)>+4+($)$ 7Q#.,-$"J ’32TRQ7Q4UV4T6MBT2PO2P723M6（’9:;’）Q14W6NL12LL16V273D636L7M O2P723M6 6\7QL6NW7L173S4SBT2L743， W17M12MM4B3L6NU4P-*.,-/，O2P723M62V43DP6D743Q23NS4SBT2L743QW6P643TR",.$+/ 23N"".+*/，P6C QS6ML7O6TRJ ATBQL6P73D232TRQ7QDP4BS6N2TTL16""S4SBT2L743Q73L4!V2K4PDP4BSQW17M1M23Y6Q6S2P2L6NYR E23DL]6P7O6PJ ^16P6QBTLQ12O62DB7N23M6L4L16 +@.$)%*J M43Q6PO2L7434U A.B)(2)>+4+($)$ D6PVST2QVJ 5+67".84：A),$6,4+/B)(2)>+4+($)$；(’)%；@636L7MN7O6PQ7LR；@636L7MQLPBMLBP6 ! 基金项目：国家自然科学基金项目（5#!8#"#*）及江苏省科技攻关项目（b‘!##"5+-） !! 通讯作者 ^6T：（#!+）$5$8#+!，‘=V27T：123DRB6RBa!"M3.M4V 收稿日期：!##5=#+=#-，!##5=#*=#+接受发表作者简介：黄春洪（",8,=）男，硕士研究生，主要从事植物遗传多样性研究。 0A> 云南植物研究 >2卷盾叶薯蓣（!"#$%#&’( )"*+",’&’*$"$ !" #" $%&’()"）是我国特有植物，隶属薯蓣属根状茎组。其根茎中含有薯蓣皂苷元（*&+,’-.&.），是提取和合成激素类药物和避孕药的重要原料。研究表明：盾叶薯蓣单株的薯蓣皂苷元最高含量为/0123，超过了几种国外的高含量薯蓣，如墨西哥的小穗花薯蓣（!1$-"%./"0/#&( #-4,5"）（含量为 /23）、菊叶薯蓣（!1%#1-#$"2( #-4,5"）（含量为/63），南非的森林薯蓣（!1$3/4(2"%( 7895+.）（含量为 21:3），印度的三角叶薯蓣（!15’/2#"5’( $;55"）（含量为21<3）等，是目前世界上单株薯蓣皂苷元含量最高的薯蓣种（丁志遵等，/=<6）。近>?年来，随着对薯蓣皂苷元需求的增大，野生盾叶薯蓣被大量采挖，资源破坏严重，造成了许多优良性状的丧失（遗传衰退），薯蓣皂苷元含量逐年下降。资源调查表明：上世纪0?年代末在整个盾叶薯蓣分布区，其总蕴藏量约为0万吨，湖北产区约为612万吨，而据>??/年的资源调查结果，整个秦巴@武当山地区的野生盾叶薯蓣储量仅为A0=21/吨，乱采滥挖已使该资源濒临绝境（袁晓颖等，>??6）。盾叶薯蓣作为我国的一个特有种，同时还是一个狭域种，其分布范围为东经/?AB26CD//>B2?C，北纬>6BA>CD6AB/?C，即秦岭以南，南岭以北的米仓山、大巴山、武陵山、雪峰山和衡山等山区以及长江中上游及其支流的低中山丘陵，垂直分布在海拔/??D/ 2?? 4的河谷、山地，落叶阔叶与常绿落叶阔叶混交林的边缘或稀疏的常绿灌木林内（丁志遵等，/=<6）。特殊的分布范围和生长环境使得这种植物在自然界中处在一种弱势状态，其资源量恢复非常缓慢（丁志遵等，/=<6）。因此，随着人们对资源的掠夺和对生境的破坏，野生盾叶薯蓣居群数目和居群规模在不断变小，生境也逐渐片断化，物种基因库迅速萎缩，遗传多样性下降。对物种居群的遗传结构和变异水平的研究有助于我们有效地保护和利用这种重要的中药资源，同时也有助于我们探索盾叶薯蓣的遗传特性及其生存环境与薯蓣皂苷元含量的关系。 EFGH指纹能极其明显地揭示两个亲缘关系十分相近的个体之间的遗传变异，因此它适合于检测种下水平的多样性：包括野生植物天然居群的遗传结构分析，种质资源的评估，栽培植物品种的鉴定等（邹喻萍等，>??/）。本文利用 EFGH标记对我国盾叶薯蓣分布区的//个居群的遗传多样性进行检测，结合各居群的种质分析结果，提出高含量、高产量野生盾叶薯蓣保护策略的建议，并为杂交育种中亲本选择提供依据。 ! 材料与方法 !"! 实验材料实验材料采自我国盾叶薯蓣分布区的//个居群，见图/。 !"# 分子标记 /1>1/ 基因组HIF的提取每个居群取<个个体，共<>份（由于分雌雄株取样，保康和永顺居群分别仅取A株和0株），每一个体取>D6片新鲜幼嫩的叶片，用 !JFK法（G;)-%,+.等，/==6）提取总 HIF，最后溶解在J7缓冲液中。 /1>1> EFGH 的 G!E 扩增与检测 HIF 扩增在 G7@ =0?? 型 G!E 仪上进行，反应条件参 E;4,-% 等（/==0）：>2!5的反应液含有>?44+5LMJ%&,N#!5（O#<1A），2?44+5LMP!5，*IJG,分别?1>44+5LM，?1S延伸=?,，6个循环；再=AS变性/2,，62S退火6?,，:>S延伸=?,，6<个循环，最后:>S保温/2? ,。G!E扩增产物在/103琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，在紫外透射仪上成像，记录实验结果。 HGG 云南植物研究 B;卷表! 供试随机引物及扩增结果 !"#$%& ’()*+,-.%,/"01".+$-2-%1,%/3$4/ 567 ),-.%, 8%93%0:%（;<=><） !?4"$/-4%/ )?$@.?,+A-:/-4%/ & 8&BCD E!F((!FEFF ; G B 8&B&& FFF((F(EFF H ; > 8&B&B FF(!EF!EFF ; ; G 8&B&> FFF!EFFE!! I ; ; 8&B&H !FFFFE!E(( D I H 8&>I& !EE(FEFEF! J D I 8&>IH (FFEF((E!F I I D 8&>JJ !F(FFEF!F! D D J 8&GCB FF(((EEEE! D I &C 8&GCG FFE(EFEF!! &C &C && 8&GC; EEEF((FEF( J D &B 8&GCJ FFFEF(E!(E H G &> 8&G;H ((EFFFEF!E I I &G 8&G;D (EF(F(FFE( D I &; 8&G;J E!!FFE(EF( ; G !?4"$ &CD JH 盾叶薯蓣各居群的遗传多样性和分化指数见表B。根据 ))K值，各居群遗传变异由高向低为：安康居群L营山L马道L郧西L永顺M宜昌L安化L云阳M万源L武当山L保康。而根据 ! 值各居群遗传多样性高低排列为：永顺L安康L营山L安化L郧西L宜昌L 马道 L 云阳 L 武当山 L 万源 L 保康。8A"00?0 多样性指数（!）变化范围为 CN&;HG 至 CN>CJD，物种水平多样性为 CN>CJ>，5%- 基因多样性从 CN&HCI 到 CNB&>I，物种水平为 CNBGJJ。保康居群为多年栽培，多样性条带和8A"00?0指数均最低。表" 盾叶薯蓣的遗传多样性 !"#$%B F%0%4-:1-O%,/-4@".?0P4A%&&+?+3$"4-?0/?2 "N#$%&$’()(%*$* )?+3$"4-?0 5+# ))KQ %( + ! R-:A"0P ;H ;&ND; &NBJ&C CN&IB; CNBH&C S31"0P/A"0 ;C GHN>C &NB;H; CN&;BJ CNB>&J K"?T"0P BJ BHND; &N&DHG CN&CHI CN&;HG R30U- ;I ;BNID &NBJD; CN&I;J CNBH;I (0T"0P HH H&N&& &NBJDG CN&D;; CNBDI> V"1"? HC ;;N;H &NBH&C CN&HBG CNB;>C S"0@3"0 ;& GINBB &NB&;G CN&>BD CNBCIH R-0P/A"0 H> ;DN>> &N>CBB CN&DB> CNBIJB R30@"0P ;& GINBB &NB;I> CN&;G; CNB>GJ R?0P/A30 ;H ;&ND; &N>DIJ CNB&>I CN>CJ> (0A3" ;> GJNCI &N>BHB CN&DBJ CNBHJC 8+%:-%/ JH DDNDJ &NGCBB CNBGJJ CN>JCD 847 *%O7 （CN>BH&）（CN&H>C）（CNB&DH） 5?4%：5+#：53.#%,?2+?$@.?,+A-:#"01/；))K：+%,:%04"P%?2+?$@.?,+A-:#"01/；%(：%22%:4-O%03.#%,?2"$$%$%/；+：5%-’/P%0% 1-O%,/-4@；!：8A"00?0’/-02?,."4-?0-01%U "#$ 遗传距离和聚类分析由’()*分子标记数据计算的&&个盾叶薯蓣居群的成对相似系数和遗传距离，见表 >。其中安康、马道遗传距离最短为CNC>C>，而保康和安化的遗传距离最大为CNB;JC。 =期黄春洪等：我国盾叶薯蓣居群遗传结构分析 =;< 表! 居群间遗传相似系数和遗传距离 !"#$%& ’()($"*(+,-.%//(-(%0+"012%(’34%0%+(-1(3+"0-%./55 !6"#$%#&’(’$)#) 7.78$"+(.03 9.78$"+(.0 5 : & ; < = > ? @ 5A 55 5 !!!! A6@&<5 A6??;; A6@A=? A6@;:= A6@<<> A6@;5@ A6@:=5 A6?@<> A6@::? A6?=&@ : A6A=>5 !!!! A6?@@< A6@;&? A6@:;? A6@;?; A6@;A> A6@5&& A6?>&A A6?@AA A6?:5> & A65::? A65A<@ !!!! A6@:;5 A6@A<5 A6@:A& A6?@=A A6?=5A A6?5:: A6?5<> A6>>5? ; A6A@>@ A6A<>@ A6A>@A !!!! 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A65<@= A65<>= A65<&& A6A5&<; A655@; A6A>A? !!!! 2.+%：5B55*%7*%3%0+7.78$"+(.0./C(-D"04，E81"043D"0，F".G"04，C80H(，I0G"04，J"1".，E"0,8"0，C(043D"0，C80,"04，C.04K 3D80，I0D8"，*%37%-+(L%$,M 2%(’34%0%+(-(1%0+(+,（"#.L%1("4.0"$）"014%0%+(-1(3+"0-%（#%$.N1("4.0"$）M 根据2%(’3遗传距离，得到55个居群的聚类图，见图&。 55个居群聚类结果表明：居群间的遗传距离呈现明显的地域性，居群间地理距离越近，遗传距离越小而聚为一类，如安康和马道，武当山和郧西，永顺和安化等。栽培居群（保康）单独成为一支。根据居群的聚类结果，大致的可以将我国的盾叶薯蓣分为图& 55个盾叶薯蓣居群的聚类图两个大类群：南方类群和北方类群。南方类 O(4M & P%01*.4*")./1(//%*%0+ !6"#$%#&’(’$)#) 7.78$"+(.03 群即云阳（盾叶薯蓣样品采自于长江南岸）、 #,-$83+%*(04"0"$,3(3 永顺和安化居群代表的湖南，湖北西南部，重庆，四川东南部；北方类群包括宜昌、秦巴B武当山地区，四川万源、营山居群等。长江可能在南北两个大类群的分化中起地理隔离作用。 "#$ 群体遗传分化以IJQRI 进行的遗传变异巢式方差分析和用9Q9ST2T计算的分化系数见表;和表<。从表;看，以地区为单位时，地区间的变异占总变异的 5?6&A6<&6=; &<>6?? 5&6>= ?56=< WA6AA5 L"*("0-%").047.78$"+(.03 5A ;>=6:5 ;>6=: ;6?= :@6;< WA6AA5 L"*("0-%N(+D(07.78$"+(.03 ?5 ?:;6A; 5A65> 556=5 >A6<< WA6AA5 ! ’(40(/(-"0-%+%3+3"/+%*5AAA7%*)8+"+(.03M *6+：1%4*%%.//*%%1.)；’’：38)./3X8"*%3；J’：)%"03X8"*%3；,K-./0’：7*.#"#($(+,./08$$1(3+*(#8+(.0M 9;9 云南植物研究 7&卷表! 盾叶薯蓣基因分化系数用CDCEFGF在假设遗传平衡条件下对所 !"#$%& ’(%))*+*%,-().%,%/*))%0%,-*"-*(,() 有的88个居群进行分析，计算出的基因分化 !1"#$%#&’(’$)#) 2(23$"-*(,4 系数 , 为 61:;8&，即在总的遗传变异中有 )+ * * , - + ) )+ . :;18&H存在于群体间，比 IJDKI 的分析结 52%+*%4 617&89 6189&9 61:;8& 61<9;8 *：.%,%/*=%04*->()42%+*%4；*：.%,%/*=%04*->?*-@*,2(23$"A 果略高。基因流为61<9;8，说明居群间的遗 + ) -*(,4；, ：+(%))*+*%,-().%,%/*))%0%,-*"-*(,；- ：.%,%)$(?B 传交换较少，这与薯蓣属的生物学性质有关。 )+ . " 讨论通过对88个居群盾叶薯蓣的 LICM分析，可以看出盾叶薯蓣的遗传结构及分化与其生物学性质有密切关系，分析原因如下。 "#$ 居群间基因分化基因分化系数 , N61:;8&，说明:;18&H的遗传变异存在于居群之间，9&1O&H的变异 )+ 存在于居群内，该结果与IJDKI计算的结果一致。这可能是因为盾叶薯蓣雌雄异株，是典型的远交植物，自交很少发生。参考 P"Q0*+R和 E(/-（8<<6）对种子植物 89&属 ;;< 种植物的统计结果，单子叶植物 , 为617:8，特有种为617;O，狭域种为617;7。盾叶薯蓣基 )+ 因分化系数比平均结果高。朱其慧等（7667）用 LICM 标记对栲树（/0)+0$12)#) 30(%’)## S0",+@）的基因流估测， - 值为88179:&。而盾叶薯蓣居群间基因流 - N61<9;8，说明盾叶薯蓣居群间遗传交换 . . 很弱，可能有如下原因：（8）基因流主要通过种子、花粉两种形式发生，盾叶薯蓣种子和花粉传播距离有限，野生状况下盾叶薯蓣种子的萌发率很低，而盾叶薯蓣花较小，其传粉媒介是一些飞行能力有限或者无飞行能力的小型昆虫。（7）生境的片断化、居群数目及规模的下降，使居群间的基因交流以很小的几率发生。此外，天然的物理屏障（如江河）也是造成盾叶薯蓣居群间基因流估测值偏低的原因。 "#% 盾叶薯蓣类群分化原因居群的聚类结果支持以长江为界线，把盾叶薯蓣分布区分为南北两个大类群。有两个方面的原因：（8）盾叶薯蓣居群间通过种子和花粉发生的基因流比较微弱。（7）地理隔离或物理屏障在种群的分化和种群间的遗传交流中的重要作用。53等（766:）对居庸关长城9种植物居群的遗传多样性及其遗传结构分析发现，长城有阻碍基因交流作用，被长城隔离的植物有明显的差异。相对于存在时间仅有7666多年的长城而言，长江更是植物种群间基因交流的一道天然屏障，削弱了长江两岸植物种群基因流的发生。这两个原因造成长江南北盾叶薯蓣由于缺乏有效基因交流，在漫长的生物演化中两者的遗传距离越来越远，从而导致种内的分化。 "#" 盾叶薯蓣迁地保护的建议在种质资源的保护和利用中，建立“核心种质”（+(0% +($$%+-*(,）是一个提高种质资源管理质量和效率的重要途径（K*0R，8<<&）。对于一个基因流（- ）比较小，, 值为6196 . )+ 的物种，至少要取样9个居群才能保存其 <&H的遗传多样性；而对 , 值为 6176的物种， )+ 要达到同样的效果这只需要取样 7 个居群就足够（P"Q0*+R等，8<<8）。根据盾叶薯蓣 , )+ W期黄春洪等：我国盾叶薯蓣居群遗传结构分析 WV\ 值，我们认为只要保存永顺、安康、营山等几个遗传多样性高的居群就可以保存盾叶薯蓣的种质多样性。致谢感谢江苏农科院遗传所陆维忠研究员，张旭老师提供实验条件和指导；感谢中科院北京植物所朱其慧，张富民博士帮助分析数据！〔参考文献〕丁志遵，唐世蓉，秦慧贞等，!"#$% 甾体激素药源植物［&］% 北京：科学出版社，$!—$’ ()*+,,-./0，!""$% 123456-6+,&+4.*743/83/-32*.（1&981）8./6-+2!:;% <.2.=-*632>?-+@.=/503A+/3=+/5% B2-C./6-=5+,<.2.C3 D3@/-*EF0，<+>=&FG，!""H% 144+I5@.>-C./6-=5-2J432= 6J.*-.6［1］% K2：?/+L2 1DM，N4.OO&P，Q3R4./ 10 !" #$% （.>6） S432=S+J743=-+2<.2.=-*6，?/..>-2O32><.2.=-*T.6+7/*.6［&］% U72>./432>：U-237./，V$—W$ D3@/-*EF0，<+>=&FG，&7/3L6E-U1，!"#$% !""!% N+//.43=-+26A.=L..26J.*-.6=/3-=6，344+I5@.>-C./6-=5：-@J4-*3=-+26,+/*+26./X C3=-+2A-+4+O5［1］% K2Y34EM1，D+46-2O./M(%（.>6）<.2.=-*6，N+26./C3=-+2+,T3/.S432=6［&］% Z.L[+/E：9),+/>B2-C./X 6-=5S/.66，\;—#W S3=./6+21D，?/7A3E./N0，G.2>.4FY，!""$% 1/3J->@.=R+>,+/.)=/3*=-+2+,*+==+2（%&’’()*+, 6JJ%）O.2+@-*MZ167-=3A4.,+/ TY0S+,SNT323456-6［F］% -$#."/&$0*&1!)，!!（$）：!’’—!’\ ]-32G（钱韦），<.U（葛颂），’HH!% 123456-6+,J+J743=-+2O.2.=-*6=/7*=7/.A576-2O>+@-232=@3/E./6［F］% 23"#%!.!"4*.（遗传学报），"#（$）：’VV—’;; T3@6./F，N/-6=-230S，G.=I.4T，!"#$，!""W% <.2+@-*C3/-3=-+232>/.43=-+26R-J6-23./-3453@（5*&’3&6!#7+$7*8!6#）>.=.*=.>A5 /32>+@3@J4-,-.>J+45@+/JR-*MZ1［F］% %!.&,!，$%（!）：!\—’; U7D，]70F，D.Q，!"#$，’HH$% PR..2=-,-*3=-+2 +, >7J4-*3=. 3**.66-+2 L-=R-2 3 /-*. O./@J436@ *+44.*=-+2 76-2O T1SM 323456-6［F］% ;+L24+3>,/+@R==J：^^LLL:734A./=3:*3^_,5.R^% [732‘[（袁晓颖），a7[<（祖元刚），[7FD（于景华），’HH$% 12.C3473=-+2=+/.6+7/*.66=+/-.6+, 5*&’3&6!#=*.>*7!6!.’*’ N% D% G/-OR=-2NR-23［F］% 0+$$0&"1!’（植物研究），"$（!）：!H$—!H; aR32OY&（张富民），<.U（葛颂），’HH’% M3=3323456-6-2J+J743=-+2O.2.=-*6% !% 323456-6+,T1SM>3=3L-=R1&981［F］% 0*&:*?!643*（生物多样性），!&（V）：V$#—VVV aR+7[S（邹喻苹），<.U（葛颂），G32O‘M（王晓东），’HH!% &+4.*743/&3/E./-2U56=.@3=-*32>(C+47=-+2?+=325（系统与进化植物学中的分子标记）［&］% ?.-b-2O：U*-.2*.S/.66 aR7]D（朱其慧），S32D‘（潘惠新），aR7<]（诸葛强），!"#$，’HH’% 123456-6+,O.2.=-*6=/7*=7/.+,23=7/34J+J743=-+26+, @#’"#.&)’*’8#6>!’** A5T1SM6［F］% 23"#0&"4*.（植物学报），’’（!!）：!$’!—!$’W

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