Vergleichende Analysen des Proteoms ausgewählter renaler Neoplasien

170 Pages·2017·14.54 MB·German

by  Bianca Heckelmann

Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität
München

Vergleichende Analysen des Proteoms
ausgewählter renaler Neoplasien

von Bianca Herta Heckelmann, geb. Rüb

aus Marktheidenfeld

München 2017

Aus dem Zentrum für Klinische Tiermedizin
der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität München

Lehrstuhl für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie

Arbeit angefertigt unter der Leitung von Univ.-Prof. Dr. Walter Hermanns

Angefertigt am Institut für Klinische Pathologie
des Universitätsklinikums Freiburg

Mentor: Univ.-Prof. Dr. med. Martin Werner

Gedruckt mit Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät
der Ludwig-Maximilians-Universität München

Dekan: Univ.-Prof. Dr. Joachim Braun

Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Walter Hermanns

Korreferenten: Univ.-Prof. Dr. Johannes Hirschberger
Univ.-Prof. Dr. Eckhard Wolf
Univ.-Prof. Dr. Hartmut Gerhards
Univ.-Prof. Dr. Bernd Kaspers

Tag der Promotion: 11. Februar 2017

Inhaltsverzeichnis I
INHALTSVERZEICHNIS
I EINLEITUNG ................................................................................................................................................................... 1
II LITERATURÜBERSICHT ................................................................................................................................................. 3
1 Renale Neoplasien bei Haustieren..................................................................................................................... 3
1.1 Epidemiologie und Einteilung.................................................................................................................... 3
1.2 Ätiologie .............................................................................................................................................................. 3
1.3 Makroskopische und mikroskopische Darstellung epithelialer renaler Neoplasien .......... 4
1.4 Makroskopische und mikroskopische Darstellung embryonaler renaler Neoplasien ....... 5
1.5 Mikroskopische und makroskopische Darstellung mesenchymaler renaler Neoplasien . 5
1.6 Klinik .................................................................................................................................................................... 5
1.7 Prognose und Therapiemöglichkeiten ................................................................................................... 6
2 Renale Neoplasien beim Menschen .................................................................................................................. 7
2.1 Epidemiologie und Einteilung.................................................................................................................... 7
2.2 Klarzellige Nierenzellkarzinome ........................................................................................................... 10
2.2.1 Definition ................................................................................................................................................ 10
2.2.2 Ätiologie .................................................................................................................................................. 10
2.2.3 Genetischer Hintergrund ................................................................................................................. 10
2.2.4 Klinik ........................................................................................................................................................ 10
2.2.5 Makroskopische und mikroskopische Darstellung .............................................................. 11
2.2.6 Prognose ................................................................................................................................................. 12
2.3 Chromophobe Nierenzellkarzinome .................................................................................................... 13
2.3.1 Definition ................................................................................................................................................ 13
2.3.2 Ätiologie .................................................................................................................................................. 13
2.3.3 Genetischer Hintergrund ................................................................................................................. 13
2.3.4 Klinik ........................................................................................................................................................ 13
2.3.5 Makroskopische und mikroskopische Darstellung .............................................................. 13
2.3.6 Prognose ................................................................................................................................................. 14
2.3.7 Hybridtumoren aus Onkozytom und chromophobem Nierenzellkarzinom .............. 15
2.4 Renale Onkozytome .................................................................................................................................... 15
2.4.1 Definition ................................................................................................................................................ 15
2.4.2 Ätiologie .................................................................................................................................................. 15
2.4.3 Genetischer Hintergrund ................................................................................................................. 15
2.4.4 Klinik ........................................................................................................................................................ 15
2.4.5 Makroskopische und mikroskopische Darstellung .............................................................. 16
2.4.6 Onkozytose ............................................................................................................................................ 16
2.4.7 Prognose ................................................................................................................................................. 17
2.5 Therapiemöglichkeiten .............................................................................................................................. 17
II Inhaltsverzeichnis
3 Valosin-enthaltendes Protein ........................................................................................................................... 17
4 Unspezifische cytosolische Dipeptidase 2 ................................................................................................... 19
5 Lysosom-assoziiertes Membranprotein 1 ................................................................................................... 19
6 Sorbitol-Dehydrogenase ..................................................................................................................................... 20
7 Retinol-Dehydrogenase 11 ................................................................................................................................ 21
8 Integrin alpha-V ...................................................................................................................................................... 21
III MATERIAL UND METHODEN ..................................................................................................................................... 23
1 Patientenkollektive ............................................................................................................................................... 23
1.1 Metastasierende und nicht metastasierende klarzellige Nierenzellkarzinome ................. 23
1.2 Chromophobe Nierenzellkarzinome und renale Onkozytome .................................................. 26
2 Probenaufbereitung für die massenspektrometrische Analyse ......................................................... 28
2.1 Mikroskopisch kontrollierte Makrodissektion ................................................................................. 30
2.2 Proteinextraktion ......................................................................................................................................... 30
2.3 Proteinkonzentrationsbestimmung ...................................................................................................... 31
2.3.1 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bicinchoninsäuretest ................................ 31
2.3.2 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford-Test ............................................... 32
2.4 Proteinverdau ................................................................................................................................................ 32
2.5 Erstellen eines Standards .......................................................................................................................... 34
2.6 Isotopisches Markieren .............................................................................................................................. 35
2.7 Entsalzung und Fraktionierung .............................................................................................................. 37
2.7.1 Entsalzung mittels Umkehrphasen-Festphasenextraktion ............................................... 37
2.7.2 Fraktionierung mittels HPLC .......................................................................................................... 38
2.7.3 Fraktionierung mittels StageTips ................................................................................................. 38
2.7.4 Entsalzung mittels StageTips ......................................................................................................... 39
3 Vermessung der Proben im Massenspektrometer ................................................................................... 40
4 Analyse der massenspektrometrischen Daten .......................................................................................... 40
4.1 Auswertung der Massenspektren mit MaxQuant ............................................................................ 40
4.2 Validierung des Standards ........................................................................................................................ 41
4.3 Verwendete statistische Testverfahren .............................................................................................. 42
4.4 Identifizierung angereicherter, biologischer Motive ..................................................................... 42
Inhaltsverzeichnis III
5 Hämatoxylin-Eosin-Färbung an Gewebeschnitten .................................................................................. 43
6 Immunhistochemische Reaktionen an Gewebeschnitten ..................................................................... 43
6.1 Entparaffinierung ......................................................................................................................................... 43
6.2 Vorbehandlungen zur Antigendemaskierung .................................................................................. 44
6.3 Antikörperetablierung ............................................................................................................................... 45
6.4 Färbeprotokoll .............................................................................................................................................. 48
7 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen ........................................................................... 49
7.1 Qualitative Beurteilung .............................................................................................................................. 49
7.2 Semiquantitative Evaluation ................................................................................................................... 49
7.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ............................................................................................... 50
7.4 Verwendete statistische Testverfahren .............................................................................................. 51
IV ERGEBNISSE ................................................................................................................................................................ 53
1 Vergleich metastasierender mit nicht metastasierenden ccRCC ....................................................... 53
1.1 Ergebnisse aus der massenspektrometrischen Analyse .............................................................. 53
1.1.1 Identifizierung und Quantifizierung durch MaxQuant ........................................................ 53
1.1.2 Validierung des Standards .............................................................................................................. 54
1.1.3 Signifikante Unterschiede in der Proteinexpression ........................................................... 55
1.1.4 Angereicherte, biologische Motive .............................................................................................. 58
1.2 Aminopeptidase N ....................................................................................................................................... 60
1.2.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ...................................... 61
1.2.2 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ..................................................... 62
1.3 Valosin-enthaltendes Protein.................................................................................................................. 62
1.3.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ...................................... 64
1.3.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen ....................... 64
1.3.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ..................................................................................... 65
1.3.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ..................................................... 67
1.4 Unspezifische cytosolische Dipeptidase 2 ......................................................................................... 68
1.4.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ...................................... 69
1.4.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen ....................... 70
1.4.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ..................................................................................... 70
1.4.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ..................................................... 71
2 Vergleich zwischen chRCC und RO ................................................................................................................. 72
2.1 Ergebnisse aus der massenspektrometrischen Analyse .............................................................. 72
2.1.1 Identifizierung und Quantifizierung durch MaxQuant ........................................................ 72
2.1.2 Validierung des Standards .............................................................................................................. 74
2.1.3 Signifikante Unterschiede in der Proteinexpression ........................................................... 75
2.1.4 Angereicherte, biologische Motive .............................................................................................. 80
IV Inhaltsverzeichnis
2.2 Lysosom-assoziiertes Membranportein 1 .......................................................................................... 82
2.2.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ....................................... 83
2.2.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen ....................... 84
2.2.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ...................................................................................... 86
2.2.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ...................................................... 89
2.3 Sorbitol-Dehydrogenase ............................................................................................................................ 90
2.3.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ....................................... 91
2.3.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen ....................... 92
2.3.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ...................................................................................... 92
2.3.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ...................................................... 93
2.4 Retinol-Dehydrogenase 11 ....................................................................................................................... 94
2.4.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion ....................................... 95
2.4.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen ....................... 96
2.4.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ...................................................................................... 96
2.4.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ...................................................... 98
2.5 Integrin alpha-V ............................................................................................................................................ 99
2.5.1 Qualitative Beurteilung der immunhistochemischen Reaktion .................................... 100
2.5.2 Semiquantitative Evaluation der immunhistochemischen Reaktionen .................... 101
2.5.3 Auswertung mit IHC Profiler in ImageJ ................................................................................... 102
2.5.4 Korrelationen zwischen den verschiedenen Methoden ................................................... 105
V DISKUSSION .............................................................................................................................................................. 108
1 Verwendete Methoden ..................................................................................................................................... 108
1.1 Massenspektrometrische Analyse ...................................................................................................... 108
1.2 IHC zur Validierung von Ergebnissen aus der Massenspektrometrie ................................. 109
1.3 Vergleich zwischen semiquantitativer Evaluation und Auswertung mit IHC Profiler . 113
2 Vergleich metastasierender mit nicht metastasierenden ccRCC .................................................... 115
2.1 Zusammensetzung des Patientenkollektivs ................................................................................... 115
2.2 Unterschiede im Proteom ...................................................................................................................... 116
2.3 Expression von Valosin-enthaltendem Protein ............................................................................ 117
2.4 Expression von unspezifischer cytosolischer Dipeptidase 2................................................... 118
2.5 Abschließende Beurteilung ................................................................................................................... 119
3 Vergleich zwischen chRCC und RO .............................................................................................................. 122
3.1 Zusammensetzung des Patientenkollektivs ................................................................................... 122
3.2 Unterschiede im Proteom ...................................................................................................................... 123
3.3 Expression von Lysosom-assoziierten Membranprotein 1 ..................................................... 125
3.4 Expression von Sorbitol-Dehydrogenase ........................................................................................ 126
3.5 Expression von Retinol-Dehydrogenase 11 ................................................................................... 126