Zell- und Gewebekultur: Allgemeine Grundlagen und spezielle Anwendungen

436 Pages·2021·24.509 MB·German

by  Gerhard Gstraunthaler, Toni Lindl

Gerhard Gstraunthaler · Toni Lindl
Zell- und
Gewebekultur
Allgemeine Grundlagen
und spezielle Anwendungen
8. Auflage
Zell- und Gewebekultur
Gerhard Gstraunthaler · Toni Lindl
Zell- und
G ewebekultur
Allgemeine Grundlagen und spezielle Anwendungen
8. Auflage
Gerhard Gstraunthaler Toni Lindl
Pfaffenhofen, Österreich Institut für Angewandte Zellkultur
München, Deutschland
ISBN 978-3-662-62605-4 ISBN 978-3-662-62606-1 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-662-62606-1
Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über 7 http://dnb.d-nb.de abrufbar.
1.–3. Aufl.: © Gustav Fischer Verlag, Stuttgart 1987, 1989, 1994
4.–6. Aufl.: © Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2000, 2002, 2008
7. und 8. Aufl.: © Springer-Verlag GmbH Deutschland, ein Teil von Springer Nature 2013, 2021
Das Werk einschließlich aller seiner Teile ist urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung, die nicht
ausdrücklich vom Urheberrechtsgesetz zugelassen ist, bedarf der vorherigen Zustimmung des Verlags.
Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Bearbeitungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die
Einspeicherung und Verarbeitung in elektronischen Systemen.
Die Wiedergabe von allgemein beschreibenden Bezeichnungen, Marken, Unternehmensnamen etc. in diesem
Werk bedeutet nicht, dass diese frei durch jedermann benutzt werden dürfen. Die Berechtigung zur Benutzung
unterliegt, auch ohne gesonderten Hinweis hierzu, den Regeln des Markenrechts. Die Rechte des jeweiligen
Zeicheninhabers sind zu beachten.
Der Verlag, die Autoren und die Herausgeber gehen davon aus, dass die Angaben und Informationen in
diesem Werk zum Zeitpunkt der Veröffentlichung vollständig und korrekt sind. Weder der Verlag, noch
die Autoren oder die Herausgeber übernehmen, ausdrücklich oder implizit, Gewähr für den Inhalt des
Werkes, etwaige Fehler oder Äußerungen. Der Verlag bleibt im Hinblick auf geografische Zuordnungen und
Gebietsbezeichnungen in veröffentlichten Karten und Institutionsadressen neutral.
Einbandabbildung: L-929 Mausfibroblasten, Vitalfärbung mit Neutralrot (Aufnahme: Prof. Toni Lindl)
Planung/Lektorat: Sarah Koch
Springer Spektrum ist ein Imprint der eingetragenen Gesellschaft Springer-Verlag GmbH, DE und ist ein
Teil von Springer Nature.
Die Anschrift der Gesellschaft ist: Heidelberger Platz 3, 14197 Berlin, Germany
V
Vorwort zur 8. Auflage
Die vorliegende, nunmehr bereits 8. Auflage unseres Lehr- und Methodenbuches
zur Zell- und Gewebekultur wurde wieder gründlich überarbeitet und auf den letz-
ten Stand von Wissen und Technik gebracht. Das neue Layout und die mehrfarbige
Gestaltung des Buches haben sich sehr bewährt. Die Autorenzitate haben wir, in An-
lehnung an den Modus moderner Lehrbücher, im Text diesmal weggelassen, was den
Textfluss erleichtert. Dafür haben wir aber die Literaturlisten „entstaubt“, nach Stich-
worten gruppiert, aktualisiert und mit repräsentativen Review-Artikeln ergänzt.
Bereits in der 7. Auflage haben wir die Einhaltung höchster Qualitätsstandards in
der Zell- und Gewebekultur besonders hervorgehoben. Doch auch nach rund 70 Jah-
ren moderner Zell- und Gewebekultur, wie wir sie heute kennen, finden sich immer
noch die altbekannten „offenen Baustellen“: zum einen die Authentifizierung huma-
ner Zelllinien, verbunden mit einem Qualitätsmanagement, um Kontaminationen mit
Mycoplasmen und Kreuzkontaminationen zu vermeiden bzw. rechtzeitig zu entde-
cken, zum anderen die weitere Verwendung von fetalem Kälberserum endlich zu re-
duzieren oder gänzlich zu vermeiden.
Deshalb gilt weiterhin unser Grundsatz und unsere Aufforderung: Ändern Sie Ihre
„Kultur“ der Zellkultur!
Seit dem Erscheinen der 7. Auflage haben diese offenen Fragen zusätzliche Brisanz
erfahren.
Die Coronavirus-Pandemie rückte nicht nur die Virologie plötzlich ins öffentliche
Bewusstsein, sondern auch die Zell- und Gewebekultur. Denn ohne Zellkultur keine
Virusforschung! Viren können sich nur in lebenden Zellen replizieren. Bald nach Aus-
bruch der Corona-Pandemie und der ersten Isolierung des Virus gelang es, SARS-
CoV-2 in Kulturen von Vero-Zellen, einer Affennierenepithel-Linie, zu vermehren.
Damit war erst der Grundstein gelegt, das SARS-CoV-2-RNA-Genom zu entschlüs-
seln und tragfähige PCR-Nachweisverfahren für dieses neue Coronavirus zu entwi-
ckeln. Auch bei den weltweiten Anstrengungen, einen SARS-CoV-2-Impfstoff zu ent-
wickeln, spielen Zellkulturen eine unverzichtbare Rolle. Ebenso ist das auf Seite 318
beschriebene 3-dimensionale Lungenmodell zu einem wertvollen Experimentalansatz
weiterentwickelt worden, das Infektionsgeschehen bei COVID-19 unter Zellkulturbe-
dingungen zu studieren.
Thema Kreuzkontaminationen und Falschidentifizierung von Zelllinien: Die
Durchseuchung der Zellkulturlabore mit falsch identifizierten Zelllinien hält leider
weltweit an.
Ebenso die Problematik des fetalen Kälberserums (FKS): Im Jahr 2013 wurde
schon wieder ein schwerwiegender Fall von „gepanschtem“ FKS publik. In der Zeit-
spanne von 2008 bis 2013 wurden mehr als 10 % der Weltproduktion gepanscht. Die
Auswirkungen auf hunderte, wenn nicht tausende von Zellkulturexperimenten kön-
nen nur annähernd abgeschätzt werden. Hier bietet das Buch in den Kapiteln 6 und 7
ausreichende Alternativen, um FKS in der Zellkultur dauerhaft zu vermeiden.
Doch es gibt auch Positives zu berichten. Immer mehr wissenschaftliche Journale
verlangen bei Einreichung von Manuskripten einen eindeutigen Befund über die kor-
rekte Authentifizierung der verwendeten humanen Zelllinien. Im 7 Abschn. 2.8 fin-
den sich ausführliche Anleitungen hierzu.
Die dreidimensionale Zellkultur, die Kultivierung von Organoiden und Miniorga-
nen wie auch mikrophysiologische Systeme „on Chips“ haben die Zellkultur näher
an histio- und organotypische Strukturen herangeführt. Kultivierte Organoide bie-
ten heute wertvolle in vitro-Modelle zur Erforschung von Organentwicklungen oder
als Testsysteme in Pharmakologie und Toxikologie. Diese neuesten Entwicklungen in
der Zell- und Gewebekultur haben wir in das neu gestaltete Kapitel 20 einfließen las-
sen. Für ihre wertvollen Beiträge sei Profs. Drs. Doris Wilflingseder und Michael J.
VI Vorwort zur 8. Auflage
Ausserlechner, Medizinische Universität Innsbruck und Dr. Joachim Wiest, cellasys
GmbH, Kronburg aufrichtig gedankt.
Die Kultivierung von Stammzellen, induziert pluripotenten und mesenchyma-
len adulten Stammzellen, „boomt“ seit Jahren und ist in der bio-medizinischen
Grundlagenforschung nicht mehr wegzudenken. Dieser Entwicklung haben wir eben-
falls Rechnung getragen und die Abschnitte über iPSC und adulte Stammzellen neu
gestaltet und aktualisiert. Der interessierte Praktiker findet nunmehr Kultivierungs-
protokolle für embryonale Stammzellen der Maus, humane iPSC und mesenchymale
Stammzellen.
Besonders danken möchten wir Dr. Yvonne Reid, ATCC, Prof. Dr. Walther Par-
son, Gerichtsmedizin Innsbruck und Dr. Wilhelm Dirks, DSMZ, die uns zur Aktuali-
sierung des Kapitels Kreuzkontaminationen und Authentifizierung mittels DNA-Pro-
filing Abbildungen und wertvolle Hinweise lieferten.
Einen Hinweis in eigener Sache möchten wir allen neuen und alten Lesern des Bu-
ches noch auf den Weg geben: Nutzen Sie das Buch bitte nicht nur zum Nachschla-
gen von Bekanntem und Nachkochen von Anleitungen, sondern nehmen Sie unsere
Texte als Vorlagen für Neues und für Versuche, über diese bestehenden Zeilen und
Kapitel hinaus eigenständig kreativ zu werden und evtl. Aktuelles mit unseren Texten
in Ihren Versuchen zu verbinden.
Und last but not least, bedenken Sie den Wert des geschriebenen Wortes; denn
nichts ist so flüchtig wie ein „nur“ digital heruntergeladenes Dokument, das nach ei-
ner kurzen Zeit doch wieder vergessen wird.
Danken wollen wir auch wieder allen Firmen, die uns mit qualitätsvollen Bildern
und Hinweisen versorgten, so dass wir aus der ganzen Fülle des Angebots nur ausge-
wählte Abbildungen einbringen konnten.
Danken möchten wir auch dem Verlag, Frau Dr. Sarah Koch, besonders aber
Frau Dr. Meike Barth für ihre Geduld, die sie mit uns bei der Herstellung des Buches
hatten. Ein Dank ergeht auch an Frau Shalaka Kulkarni und Herrn Kent Muller für
die Erstellung des Layout.
Nun möge das Buch allen Lesern die Freude und den Nutzen bringen, den sie er-
warten und auch erwarten dürfen.
Gerhard Gstraunthaler
Toni Lindl
Pfaffenhofen und München
im Oktober 2020
VII
Über die Autoren
Univ.-Prof. Dr. Gerhard Gstraunthaler
geb. 1953 in Landeck/Tirol. 1972–1979 Studium der Mikrobiologie und Biochemie an der
Universität Innsbruck. 1979 Univ.-Assistent am Institut für Physiologie der Universität
Innsbruck, 1987 Habilitation für Physiologie mit bes. Berücksichtigung der Zellphysiologie,
1994–2018 Titularprofessor am Institut für Physiologie der Medizinischen Universität Innsbruck.
1984/1985 Forschungsaufenthalte an den National Institutes of Health, Bethesda, MD und 1995
an der Colorado State University, Fort Collins, CO. Externer Lektor an der Fachhochschule
Management Center Innsbruck (MCI). Spezialgebiete: Zellphysiologie, epitheliale Zell- und
Gewebekultur, Nierenbiochemie, Alternativen zum fetalen Kälberserum, serumfreie Zellkultur,
induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC), Ersatzmethoden zu Tierversuchen.
Prof. Dr. Toni Lindl
Studium der Chemie und Biologie an der TH München und an der Universität Freiburg. Univ.-
Assistent an der Universität Konstanz und wiss. Assistent an der Universität Bonn. 1981 Gründung
des privaten Instituts für angewandte Zellkultur (I-A-Z, Dr. T. Lindl, GmbH) in München (BMFT-
u. BMBW-Projekte, Zellkulturkurse: Grundkurse und Spezialkurse für Fortgeschrittene). 1990
Berufung an die Fachhochschule Weihenstephan, 1995 Forschungsaufenthalt am Massachusetts
Institute of Technology (MIT), Cambridge, Mass., USA. Autor von zahlreichen wissenschaftlichen
Originalartikel, darunter Nature, BBA, Toxicology In Vitro, ALTEX und anderen. Fachgebiete:
Pflanzenzellkulturen, tierische und humane Zellkulturen, Zellphysiologie und Zelltoxikologie,
Alternativmethodenentwicklung zum Tierversuch (langjähriges Mitglied einer Kommission
nach §15 Tierschutzgesetz), Alternativen zum fetalen Kälberserum, serumfreie Medien, humane
Thrombocytenlysate.
Das Buch Zell- und Gewebekultur hat T. Lindl als Erstautor 1987 zusammen mit J. Bauer ins
Leben gerufen und mit G. Gstraunthaler ab der 6. Auflage entscheidend weiterentwickelt und
aktualisiert.
Weitere Bücher: T. Lindl und R. Steubing: Atlas of Living Cell Cultures, Wiley-VCH (2013);
T. Lindl und H. Plank (Hrsg.): F. X. Lindl, Italienische Reise, Eigenverlag (2020).
IX
Inhaltsverzeichnis
I Allgemeine Grundlagen der Zell- und Gewebekultur
1 Das Zellkulturlabor: Räumliche und apparative Voraussetzungen ............... 3
1.1 Der Reinigungsbereich .................................................................. 5
1.2 Der Vorbereitungs- und Verarbeitungsbereich .......................................... 5
1.3 Der Sterilbereich. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Weiterführende Literatur ................................................................ 14
2 Steriltechnik – Kontaminationen ..................................................... 15
2.1 Der Sterilbereich. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.2 Laborreinigung .......................................................................... 18
2.3 Hygiene .................................................................................. 18
2.4 „Aseptische“ Arbeitstechnik ............................................................. 18
2.5 Sterilisationsverfahren .................................................................. 21
2.6 Antibiotika (Verwendung von Antibiotika in der Zellkultur) ............................ 29
2.7 Mycoplasmen ............................................................................ 32
2.8 Kreuzkontaminationen .................................................................. 43
Weiterführende Literatur ................................................................ 49
3 Sicherheit in der Zellkultur ........................................................... 53
3.1 Sicherheitsvorschriften .................................................................. 54
3.2 Gesetzliche Regelwerke ................................................................. 55
3.3 Entsorgung .............................................................................. 58
Weiterführende Literatur ................................................................ 60
II Die Zelle und ihre Umgebung
4 Zellbiologische Grundlagen der Zell- und Gewebekultur .......................... 63
Weiterführende Literatur ................................................................ 65
5 Kulturgefäße und ihre Behandlung .................................................. 67
5.1 Züchtung von Zellen auf Glas ........................................................... 68
5.2 Züchtung von Zellen auf Plastikmaterial ................................................ 69
5.3 Züchtung von Zellen auf anderen Materialien .......................................... 71
5.4 Spezielle Kulturgefäße .................................................................. 71
5.5 Reinigung und Vorbehandlung von Glaswaren ......................................... 76
5.6 Vorbehandlung von Kulturgefäßen mit Polylysin oder mit Komponenten der
extrazellulären Matrix zur Modifizierung der Oberflächeneigenschaften .............. 79
Weiterführende Literatur ................................................................ 85
6 Zellkulturmedien ...................................................................... 87
6.1 Zusammensetzung der Medien ......................................................... 92
6.2 Kurze Beschreibung der gebräuchlichsten Kulturmedien ............................... 104
6.3 Herstellung gebrauchsfertiger Medien .................................................. 107
Weiterführende Literatur ................................................................ 113
7 Serumfreie Zellkultur ................................................................. 115
7.1 Grundmedien ............................................................................ 118
7.2 Zusätze zu serumfreien Medien ......................................................... 118
7.3 Modularer Aufbau serumfreier Medien ................................................. 119
7.4 Übergang von serumhaltigen zu serumfreien Medien .................................. 120
X Inhaltsverzeichnis
7.5 Serumfreie und proteinfreie Kulturmedien ............................................. 123
Weiterführende Literatur ................................................................ 123
8 Physiologische Zellkulturparameter ................................................. 125
8.1 Osmolarität .............................................................................. 126
8.2 Temperatur .............................................................................. 126
8.3 Oxygenierung ........................................................................... 126
8.4 pH-Wert und Pufferung. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
Weiterführende Literatur ................................................................ 129
9 Reinstwasser für Zell- und Gewebekulturen ........................................ 131
9.1 Verfahren der Aufbereitung, Vorbehandlung ........................................... 132
9.2 Reinstwasseraufbereitungssysteme ..................................................... 133
9.3 Lagerung von Reinstwasser ............................................................. 134
9.4 Wasser für Reinigungszwecke ........................................................... 134
Weiterführende Literatur ................................................................ 135
III Routinemethoden zur allgemeinen Handhabung
kultivierter Zellen
10 Mediumwechsel und Fütterungszyklen ............................................. 139
10.1 Mediumwechsel bei Monolayerkulturen ................................................ 140
10.2 Mediumwechsel bei Suspensionskulturen .............................................. 142
Weiterführende Literatur ................................................................ 143
11 Subkultivierung/Passagieren ......................................................... 145
11.1 Subkultivierung von Monolayerkulturen ................................................ 146
11.2 Subkultivierung von Suspensionskulturen .............................................. 153
Weiterführende Literatur ................................................................ 154
12 Bestimmung allgemeiner Wachstumsparameter ................................... 155
12.1 Mikroskopische Betrachtung der Kulturen .............................................. 156
12.2 Bestimmung der Zellzahl (und Zellmasse) .............................................. 156
12.3 Bestimmung allgemeiner Stoffwechselparameter ...................................... 165
12.4 Vitalitätstests ............................................................................ 165
Weiterführende Literatur ................................................................ 172
13 Einfrieren, Lagerung und Versand von Zellen ...................................... 173
13.1 Einfrieren von Zellen .................................................................... 174
13.2 Lagerung der Zellen ..................................................................... 177
13.3 Auftauen von Zellen ..................................................................... 178
13.4 Versand von Zellen ...................................................................... 179
Weiterführende Literatur ................................................................ 181
14 Qualitätskontrolle und Cell Banking ................................................. 183
14.1 Qualitätskontrolle ....................................................................... 184
14.2 Cell Banking ............................................................................. 185
Weiterführende Literatur ................................................................ 185
15 Standardisierung in der Zellkultur (Good Cell Culture Practice) ................... 187
Weiterführende Literatur ................................................................ 189
XI
Inhaltsverzeichnis
IV Spezielle Methoden und Anwendungen
16 Allgemeine Aspekte der Primärkultur ............................................... 193
16.1 Anlegen einer Primärkultur ............................................................. 194
16.2 Etablierung einer Zelllinie, Zellalterung und Seneszenz ................................ 197
16.3 Apoptose in der Zellkultur .............................................................. 201
16.4 Transformation und Immortalisierung .................................................. 202
Weiterführende Literatur ................................................................ 206
17 Spezielle Primärkulturen ............................................................. 209
17.1 Kultivierung von Herzmuskelzellen des Hühnchens .................................... 210
17.2 Kultivierung von Herzmuskelzellen aus neonatalen Rattenherzen ..................... 211
17.3 Primärkulturen aus frischen Hautproben (Biopsien) menschlichen Ursprungs ......... 212
17.4 Isolierung von Lymphocyten aus Vollblut mittels
Dichtegradientenzentrifugation ........................................................ 212
17.5 Primärkulturen aus Mäusecerebellum (Kleinhirn) ....................................... 214
17.6 Primärkulturen von Hepatocyten ....................................................... 216
17.7 Isolierung und Primärkultur von Endothelzellen ........................................ 219
17.8 Gewinnung einer Zellkultur aus soliden Humantumoren ............................... 222
17.9 Gewinnung von Keratinocyten .......................................................... 224
Weiterführende Literatur ................................................................ 226
18 Kultivierung spezieller Zelllinien ..................................................... 229
18.1 Mammaliazelllinien ...................................................................... 232
18.2 Kaltblütige Vertebraten ................................................................. 244
18.3 Invertebraten ............................................................................ 245
18.4 Insektenzellen für die biotechnologische Produktion rekombinanter
Proteine (Sf9-Zellen aus Spodoptera frugiperda) ........................................ 246
Weiterführende Literatur ................................................................ 249
19 Spezielle zellbiologische Methoden in der Zellkultur .............................. 251
19.1 Transfektion ............................................................................. 253
19.2 Klonieren ................................................................................ 259
19.3 Zellfusion, Hybridomatechnik ........................................................... 262
19.4 Zellsynchronisation ..................................................................... 269
19.5 Cytometrie/Cell Sorting ................................................................. 274
19.6 Versuche zur In-vitro-Toxizität ........................................................... 280
19.7 Migrationsassays ........................................................................ 294
19.8 Chromosomenpräparation .............................................................. 299
Weiterführende Literatur ................................................................ 300
20 Organkulturen, 3D-Kulturen, Organoide und mikrophysiologische
Systeme (Organ-on-Chips) ............................................................ 303
20.1 Organkulturen ........................................................................... 304
20.2 Dreidimensionale (3D-)Kulturen, Organoide und 3D-Biodruck ......................... 311
20.3 Mikrophysiologische Systeme (Organ-on-Chips) ........................................ 321
Weiterführende Literatur ................................................................ 324
21 Stammzellen ........................................................................... 327
21.1 Embryonale Stammzellen ............................................................... 328
21.2 Induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) ............................................ 329
21.3 Adulte Stammzellen ..................................................................... 330
21.4 Embryonaler-Stammzell-Test (EST) (Spezies: Maus) ..................................... 336
Weiterführende Literatur ................................................................ 346