X-Ray Absorption Near Edge Structure of Amino Acids and Peptides

89 Pages·1999·0.56 MB·English

X-Ray Absorption Near Edge Structure of Amino
Acids and Peptides
AThesisPresented
by
JanMarkus Boese
to
TheGraduateSchool
inPartialFulfillmentoftheRequirements
fortheDegreeof
MasterofArts
in
Physics
StateUniversityofNewYork
at
StonyBrook
December 1996
StateUniversityofNewYork
at StonyBrook
TheGraduateSchool
JanMarkus Boese
We, the thesis committee for the above candidate for the Master of Arts degree,
herebyrecommendacceptance ofthethesis.
Chris Jacobsen
Professor,PhysicsDepartment
DavidFossan
Professor,PhysicsDepartment
DmitriAverin
Professor,PhysicsDepartment
Thisthesisisaccepted bytheGraduateSchool.
GraduateSchool
ii
Abstract of the Thesis
X-Ray Absorption Near Edge Structure of Amino
Acids and Peptides
by
JanMarkus Boese
MasterofArts
in
Physics
StateUniversityofNewYorkat StonyBrook
1996
Carbon edge x-ray absorption near edge structures (XANES) of
aminoacids andpeptides havebeen investigatedforthefirst time. The
samples have been analyzed in solid form, because their heat sensitiv-
itymakesevaporationdifficult. Inordertoobtainquantitativemeasure-
mentsusingtransmissionspectroscopy,thesamplehastobeofuniform
thickness across the illuminatedspot. For this reason a special sample
preparation technique was used, and the spectra were taken using the
smallspot size ofthe StonyBrookscanningtransmissionx-ray micro-
iii
scope, which is operated at the National Synchrotron Light Source at
Brookhaven National Laboratory. XANES spectra of six amino acid
monomers,four dipeptides and one tripeptidewere compared. The re-
sults show that the peptide spectra can be explained as a sum of the
spectraofthemonomerstheyconsistof. Thisindicatesthatthepeptide
bond has only a weak effect on the spectra. If this is true in general, it
shouldbepossibletopredictXANESspectraofproteinsfromthespec-
tra of the constituent amino acids. This could be used for estimations
inproteinspecific imagingusingx-raymicroscopes.
iv
ToChristine
Contents
ListofFigures ix
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
ListofTables xii
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
Acknowledgements xiii
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
1 Introduction 1
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
1.1 X-RayMicroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 XANEScontrast . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
2 Background Information 8
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
2.1 InteractionofX-Rays withMaterial . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.2 X-RayAbsorptionNear EdgeStructure . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.1 MolecularOrbitals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
2.2.2 XANESResonances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
2.3 AminoAcids andProteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
vi
2.3.1 Chemical StructureofAminoAcids . . . . . . . . . . . . . 23
2.3.2 ThePeptideBond . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
3 Experimental Methods 31
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
3.1 MethodsforXANESspectroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.1 Gas Phase vs. SolidSamples . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.1.2 Transmissionvs. ElectronYieldDetection. . . . . . . . . . 32
3.1.3 TheThicknessEffect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.1.4 HigherOrderContamination . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
3.2 TheScanning TransmissionX-Ray Microscope . . . . . . . . . . . 36
3.3 SamplePreparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
3.4 DataAcquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.4.1 EnergyResolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.4.2 Effect ofbeamlineandsamplewindow . . . . . . . . . . . 42
3.4.3 EstimationofRadiationDoseandDamage . . . . . . . . . 45
3.5 DataAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.5.1 QuantitativeAnalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.5.2 Monochromatorenergydriftcorrection . . . . . . . . . . . 51
3.5.3 Energyscalecalibration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
vii
4 Results 54
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
4.1 Interpretationofthemonomerspectra . . . . . . . . . . . . . . . . 54
4.2 ComparisonofMonomerandPeptideSpectra . . . . . . . . . . . . 57
4.3 SensitivityofXANESimaging . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5 Conclusions and Future work 70
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
A Sample Preparation Protocol 75
: : : : : : : : : : : : : : : : : : : : :
viii
List of Figures
1.1 Absorptioncoefficientsofwater andprotein. . . . . . . . . . . . . . 3
1.2 CarbonedgeXANESspectraofDNA,protamine1andprotamine2,
takenfrom [1]withpermission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3 Water window image, protein map and DNA map of a bull sperm,
takenfrom [1]withpermission . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.1 Thelinearcombinationofatomicorbitals(LCAO)approximation . 17
2.2 Energylevelsofthemolecularorbitalsofdiatomicmolecules. . . . 18
2.3 Schematic potential and XANES spectra of atoms and molecules.
From[2]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.4 Structureofthecommonaminoacids. . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.5 Resonancestructuresoftheunprotonatedcarboxyl group. . . . . . . 24
2.6 Twoaminoacidmonomersformadipeptidebydehydration. . . . . 29
2.7 Theresonance structuresofthepeptidebond. . . . . . . . . . . . . 29
3.1 SchematicdiagramofthemaincomponentsoftheSTXM. . . . . . 38
ix
3.2 Resolvingpowerofthemonochromator. . . . . . . . . . . . . . . . 43
3.3 Theoretical undulator spectrum compared to measured spectrum
withoutsample . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3.4 Spectrum of a silicon nitride sample window. The straight line is
thespectrumpredictedfrom atomiccrosssectiondata. . . . . . . . 45
3.5 Repeatedspectratakenatthesamespotdonotshowindicationsfor
radiationdamage. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.6 Measured XANES spectrum of an amino acid (tyrosine) fitted to
atomiccrosssectiondatatoobtainanabsolutemeasureofthemass
absorptioncoefficient. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.7 Correctionforenergydriftofthemonochromator. . . . . . . . . . . 51
3.8 CO calibrationspectrum. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
2
4.1 BindingofTFAtoanaminoacid. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.2 CarbonedgeISEELspectrumofTFA. . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.3 Spectra of Glycine and Tyrosine and a weighted sum compared to
aspectrumofthedipeptide. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.4 SpectraofGlycineandTryptophaneandaweightedsumcompared
toaspectrumofthedipeptide. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.5 Spectra of Histidine and Phenylalanine and a weighted sum com-
paredtoaspectrumofthedipeptide. . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
x