virus chikungunya et traitement antiviral

134 Pages·2011·9.64 MB·French

AIX-MARSEILLEUNIVERSITE
FACULTE DE MEDECINE DE LA TIMONE
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
Discipline: Pathologie humaine
Spécialité: Maladies transmissibles et pathologies tropicales
THESEdu GRADE de DOCTEUR és sciences
Présentée par
Ilenia DELOGU
VIRUS CHIKUNGUNYA ET TRAITEMENT ANTIVIRAL
Soutenue le 2 Mai 2011
COMPOSITION DU JURY
ProfesseurJean-Louis MEGE Président du jury
DocteurElyes ZHIOUA Rapporteur
DocteurArezki IZRI Rapporteur
Professeur XavierNICOLAS DE LAMBALLERIE Directeur de thèse
UMR 190–Emergence des Pathologies Virales
Faculté de Médecine de la Timone
Marseille, France

Remerciements
Que les membres du jury trouvent ici l’expression de mes sincères remerciements :
Monsieur lePr.Elyes Zhiouapour avoir accepté de s’acquitter de la tâche de rapporteur
Monsieur leDr. Izri Arezki pour avoir accepté de s’acquitter de la tâche de rapporteur
Monsieur lePr. Jean-Louis Mege poursadisponibilité et pour avoir accepté de faire partie de mon jury
J'exprime mes profonds remerciements à mon directeur de thèse, Monsieur le Pr. Xavier de
Lamballerie pour l'aide compétente qu'il m'a apportée, pour sa patience et son encouragement à finir le
travail. Son œil critique m'a été très précieux pour structurer ce travail.
Ensuite je tiensà remercierMonsieurle Dr.Rémi Charrel pour m'avoir donné la possibilité de
participeràlarédactiondu livre:Epidemiology, transmission cycles, evolution and emergence of
chikungunya virus.Ilenia DELOGU, Xavier de LAMBALLERIE, Rémi N. CHARREL.Wilde life
viral diseases in humans, Editors Antonio Tenorio, Matthias Niedrig, Juan R Arbiza. Bentham
Publishers
Monsieur lePr. Paolo La Colla de me donnerl'occasiond'avoirentrepriscette aventure, à laRégion
Sardaignepour avoirsoutenuceprojet.
Je tiens à remercier respectivement tous ceux qui m'ont aidée, soutenue, et encouragée pour la
réalisation de ce travail : Emilie, Boris, Antoine, Maël,Yannik, Nico, Cécile B., D'autres personnes
m'ont encouragé à finir ce travail par des gestes d'amitié dont je suis reconnaissantàKarinetoujourslà
pourmesoutenir,Mercipour toutà: Charlène, Juju, Sabrina, Prajakta.
Mes copines Titou, Alex sans oublier tous l’équipe:Marie-Thérèse, Roland, Elie, Nathalie, Morgan,
Gilles, Greg, Ernest, Shelley, Reine, Laetitia, Djamel, Jean-Jacques, Odile, Laurence T., Ines,
Laurence B., Cécile F., Céline, ont beaucoup contribué à mettre en forme mon français très
approximatif. Sans eux, j'aurais sans doute été découragé par cette langue que j'aime bien au quotidien,
ilreste certainement des corrections à faire et je m'engage à les effectuer avant une éventuelle
impression.
J'exprime aussi ma gratitude àtouslesgensmerveilleuxque j'ai rencontréspendantcetteaventure,
Asharaf, Loubna, Mylène, Sonia, Elena A., Sebastiana, Hervé, Jury, Anna, Giuseppe, Roberto, Valeria
e Francesca.Jesuis sûr quej'ai oubliéquelqu'un donc à vous aussi merci et pardonnezmoi.
Infine non perché siano meno importanti ma anzi sempre i primi nel mio cuore un ringraziamento
speciale permio Padre, le mie sorelle e tutta la mia famiglia sempre qui vicina anche se lontana,
grazie di cuore anche agli amici lontani ma sempre presenti a regalarmi un sorriso eda tirarmi su
quandone ho avuto bisogno,grazie perché so che potro’ sempre contaresu di voi in particolare grazie
a: Nicoletta, Paolo, Carla, Luca, Andrea, Manu, Stefano, Tizi e tanti altri che non ho scritto siete
tantissimi! GRAZIE A ME STESSA! nonostante tutto é finita.
Un Grazie pieno d’Amore all’uomo della vita miaRoberto Armerino grazie per avermi sopportato e
supportato sempre con un entusiasmo grandissimo, presente senza far rumore ma forte quando ne ho
avuto bisogno.
“A MIO PADRE “

SOMMAIRE
REMERCIEMENTS
LISTE DES ABREVIATIONS……………………………………………….…………………………………………………………………4
CHAPITRE I: INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE
I Les Alphavirus …………………………………………….………………………………………………………………….7
A Taxinomie…………………………………………………………………………………………………….………...9
B Distribution géographique……..………….………………………………………………………………….10
C Organisation du génome des Alphavirus………………………………………………………………...11
1. Les régions non traduites du génome………………………………………………………………….11
2. Les protéines non structurales………………………………………………………….……………...…12
a)nsP1
b) nsP2
c) nsP3
d) nsP4
3. Les protéines structurales………………………………………………………………….………………..14
a) La protéine de capside
b) Les glycoprotéines d’enveloppe
c) Protéine 6K
D Cycle réplicatif des Alphavirus………………………………………………………………………………...17
1. Mécanismes d’entrée dans la cellule hôte…………………………………………………………..18
a) Récepteurs viraux
b)Mécanismes d’attachement
c) Fusion
d) Décapsidation
2. La réplication……………………………………………………………………………………………………….20
a) La transcription de l’ARN (+)
b) Transcription de l’ARN subgénomique
II: Le virus CHIKUNGUNYA…………………………………………………………………………………..……………………….24
A Les épidémies de CHIKV……………………………………………………………………..……………………25
1. L’Afrique……………………………………………………………………………………………………………...25
2. L’Inde et Asie………………………...……………………………………………..………………………….....25
3. L’épidémie de 2005-2006…………………………………………………………………………………….25
4. Phylogenic du CHIKV………………………………………………….………………………………………..26
B. Les insectes vecteurs du CHIKV…………………………………………………………………….………….27
1 Vecteurs et cycles de transmission du CHIKV…………………………………..………….29
a) Les réservoirs du CHIKV
b) L’infection virale chez le moustique
c) La pathogenèse chez le moustique
2 Caractéristiques et distribution géographique du vecteur……………...31
C Aspects cliniques de l’infection……………….…………………………………………….…………….....34
1. Les formes classiques………………………………………………………………………………..…………34
a) Forme asymptomatique
b) Formeaiguëtypique
2. Effets secondaires………………………………………………………………………………………………..34
1
3. Formes atypiques…………………………….………………………………………………………….…......35
4. Forme létale…………………………………………………………………………………..…………………….35
D Physiopathologie de l’infection par leCHIKV………………………………………………………...…35
1. Tropisme…………………………………………………………………………………………….………...…….36
2. Sites de la réplication virale....................…………………….......................................36
3. Réponses immunitaires………………………………………………………….…………………………….37
a) Réponse innée
b) Réponse adaptative
E Diagnostic………………………………………………………………………………………………..………………38
1. Tests sérologiques………………………………………...…………………………………………………….38
2. RT-PCR………………………………………………………………………………………………………………...38
F. Les traitements………………………………………………………….………...…………………………………….…...39
1. Les vaccins………………………………………………………………………………………………….………..39
2. Les molécules antivirales……………………………………………………………..………………………39
III:Valorisation du travail bibliographique………………………………………………………..………………………..40
Article de revue: Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging
pathogens and progress towards their control.………………………………………………..………………….40
Article de phylogénie: Epidemiological and evolutionary aspects of the recent Chikungunya
virus epidemics.………………………………………………..………………….……………………………………………..54
CHAPITRE II: OBJECTIFS DU TRAVAIL ET STRATEGIES EXPERIMENTALES
I Le développement des antiviraux contrele CHIKV…………………………………………………………..60
A. Résumé……………………………………………..…………………………………………………………………………....62
1. Chloroquine…………………………………………………………………………………………………………62
2. Ribavirine…………….……………………………………………………………………………………………...62
3. Carbodine…………………………………………………………………………………………………………….63
B. Vaccin anti-CHIKV……………………………………………………………………………..……………………………..63
II Définition des modèles d’études…………………………………………………………………..………………...64
A Arbidol…………………………………………………………………………………………………………….………64
B Virus Chikungunya…………………………………………………………………………………...……………..64
III Stratégies expérimentales………………………………………………………………………………………….…...65
A Tests d’efficacité in vitro………………………………………………………………………………………….66
1. Matériels et méthodes…………………………………………………………………………………………66
a) Cellules et virus
b) Test de cytotoxicité d’Arbidol HZ2 sur les cellules MRC5 et VERO
c) Tests d’infection des cellules MRC5 par le CHIKV
d) Test de sensibilité du CHIKV-Opy1 à l’Arbidol
e) Test de sensibilité du CHIKV-Opy1 à l’Arbidol activé
f) Test de sensibilité du CHIKV-Opy1 aux métabolites de l’Arbidol
g) Test cinétique de l’activité de l’Arbidol sur le CHIKV-Opy1
B Effet direct de l’Arbidol sur le virus………………………………70
2
1. Obtention d’un CHIKV mutant Arbidol résistant (CHIKV-Opy1-ARB)…………………….70
2. Séquençage dugénomecompletdu CHIKV mutant résistant à l’Arbidol………………71
3. Constructiondel'IC Tonile……………………………………………………………………………..…….71
4. Insertion de la mutation G407R dans l’IC Tonile………………………………………..………...73
a) Construction de l’IC Tonile-ARB
b)Constructionde l’amplicon de 3833 pb
c) Assemblage
d) Ligation, Transformation et Transfection
e)Déterminationde l'IC en utilisantlaRT-PCR quantitative
50
CHAPITRE III: RESULTATS
Article 1……………………………………………………………………………………………………………………………………..….…77
Avant-propos…………………………………………….…………………………………………………………………………77
«In vitroantiviral activity of arbidol against Chikungunya virus and characteristics of a
selected resistant mutant»…………………………………………………………………………………………….………………...79
Discussion…………………………………………………………………………..………………………………………………..88
Article 2…………………………………………………………………………………………………………………………………………...90
Avant-propos……………………………………………………………………………………………………………………….90
«Chikungunya disease and chloroquine treatment»…………………………………………………..………..91
Discussion……………………………………………………………………………………..……………………………………..95
References Bibliographiques…………………………………………………………………………………………….………...……96
Annexe…………………………………………………………………………………………………………………………………………...124
3
LISTE DES ABREVIATIONS
6K:Protéine de 6kDa L, mL, µL, nL: litre, millilitre, microlitre,
ADN: Acide désoxyribonucléique nanolitre
ADNc: ADN complémentaire M, mM, µM, nM: molaire, millimolaire,
Ae.: Genre Aedes micromolaire, nanomolaire
ARN: Acide ribonucléique min: minute
ARN(+)/(-):ARN de polarité positive/ARN de MRC5: (fibroblastes humains)
polarité négative MS/MS:tandem mass spectrometry
ARNi:ARN intérence NLS:nuclear localization sequence
ARNm: ARN messager nm: nanometre
ATP: adénosine triphosphate nsP:Non structural protein
°C: degré Celsius NTP: nuléoside triphosphate
CDC:Center for Disease Control and NTPase: nucleoside triphosphatase
Prevention Nter:Amino-terminal
CMH: Complexe majeur d'histocompatibilité NTR: Non translated region
CSE:Conserved sequence element nts: Nucléotides
Cter:Carboxy-terminal ORF :Open-reading frame
Da, kDa: dalton, kilodalton PLO: phase de lecture ouverte
Db:Double brin pb: paire de bases
DEET; NNDB: N, N-diéthyl-m-toluamide, PBS:phosphate buffer saline
également appelé N, N'-diéthyl-3- pC:Protéine de capside
méthylbenzamide PM: poids moléculaire
DMSO:diméthylsulfoxyde polyA:Polyadénylé
E.coli:Escherichia coli q-PCR: Quantitative chain polymerization
ELISA:enzyme-linked immunosorbent assay reaction
g, mg, µg, ng: gramme, milligramme, RE: réticulum endoplasmique
microgramme, nanogramme RER: réticulum endoplasmique rugueux
GFP:green fluorescent protein RIG:retinoic acid inducible gene
h: heure RNC: région non-codante
HEK-293:Human Embryonic Kidney 293 cells RT-PCR:Real time chain polymerization
HZ1:(6-bromo-4-(diméthylamino)-5-hydroxy- reaction
1-méthyl-2-(phenylsulphonylmethyl)-1H- s: seconde
indole-3-carboxylate) SVF: sérum de veau fœtal
HZ2:Arbidol STAT:Signal transducers and activators of
HZ3:(6-bromo-4-diméthylamino)-5-hydroxy- transcription
1-méthyl-2-(methylphenylsulphoxyde)-1H- TATase:Terminal Adénylyltransférase
indole-3-carboxylate) TCID :Dose Tissue CultureInfectieuse
50 50
IC :clone infectieux TLR:Toll-like receptors
IFN: interferon VERO :Cellules rénales de singe vert africain
IF :Immunofluorescence Indirecte
Ig:Immunoglobuline
IL: interleukine
IMAC:immobilized-metal ion affinity
chromatography
IRF:interferon regulatory factor Virus:
KBR3023:icaridine également connu sous le
nom picaridine.
4