verificación de la aptitud de las pruebas de recuento microbiano y pruebas de microorganismos ...

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VERIFICACIÓN DE LA APTITUD DE LAS PRUEBAS DE RECUENTO
MICROBIANO Y PRUEBAS DE MICROORGANISMOS ESPECIFICOS PARA
PRODUCTOS TERMINADOS ELABORADOS EN ANGLOPHARMA S.A
LAURA MARGARITA PERILLA JIMÉNEZ
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
2013
Artículo 23 de la Resolución No. 13 de Junio de 1946
"La universidad no se hace responsable de los conceptos emitidos por sus alumnos en
sus proyectos de grado.
Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma y la moral católica y
porque los trabajos no contengan ataques o polémicas puramente personales. Antes
bien, que se vea en ellos el anhelo de buscar la verdad y la justicia".
Reglamento de la Pontificia Universidad Javeriana
AGRADECIMIENTOS

Al finalizar el trabajo de grado lleno de momentos agradables y con muchas dificultades es
inevitable sentir que te invade un alivio al culminar satisfactoriamente un proyecto el cual fue
desarrollado con gran esfuerzo, dedicación, mucha paciencia y tolerancia frente a todas las
situaciones que jamás se te pasan por la cabeza que van a suceder. Debido a esto, para es muy
importante aprovechar este espacio para reconocer y agradecer a todos aquellos que hicieron
parte del desarrollo de este trabajo.

Debo agradecer de manera especial y sincera a la Dr. Angela María Jara por permitirme realizar
este trabajo a su lado el cual fue una verdadera enseñanza para mi vida, por su inmensa
paciencia y sobre todo por su lucha constante para poder llevar hasta el final el desarrollo de
este estudio, junto a ella debo agradecer a Katerine Riveros por su diaria colaboración y
preocupación para obtener siempre los mejores resultados. Por otro lado debo agradecer
Anglopharma S.A por abrirme las puertas de su empresa y darme la confianza para realizar un
trabajo que espero permita a la compañía ser cada vez mejor. A la Dr. Janeth Arias por su
colaboración y ser una excelente guía a lo largo del desempeño del trabajo.

Por último, y no por ello menos importantes, debo agradecer a mis padres, hermanos, amigas,
amigos y a Trufa por su paciencia, apoyo constante e incondicional al desarrollar este proyecto
y ser siempre los cimientos más fuertes en mi vida.
INDICE
1
INTRODUCCIÓN 2
RESUMEN

JRUESFTEIFRIECNATCEIÓSN C OY NPLCAENPTTEUAAMLEIESN –T MOA DRECLO P RTOEÓBLREICMOA 53
OBJETIVOS 6

METODOLOGÍA
1. MICROORGANISMOS 7
2. MEDIOS DE CULTIVO 8
3. REACTIVACIÓN DE LA CEPA 11
4. PRODUCTOS A EVALUAR 12
5. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 13
6. RECUENTO DE MESÓFILOS AEROBIOS 14
7. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS 14
8. PRUEBA PRESENCIA/AUSENCIA 15
9. CRIT ERIOS DE ACEPTACIÓN 1189
DISCUSIÓN DE RESULTADOS 20
RESULTADOS

CBOIBNLCILOUGSRIOANFIEAS 2232
ANEXO 1 25
1. ION K ELIXIR 31,2% 25
2. AMETREX JARABE 3% 26
3. NAPROXENO SUSPENSIÓN 3% 27
4. CALYMAG SUSPENSIÓN MENTA 29
5. TEOLIXIR ELIXIR 30

ANEXO 2 33
1. PIROXICAM GEL 0,5% 33
2. HIDROCORTISONA CREMA 1% 34

ANEXO 3 37
1. CLOTRIMAZOL TABLETA VAGINAL 100 MG% 37

ANEXO 4 40
1. VERAN D CÁPSULAS 20 MG 40

Verificación de la aptitud de las pruebas de recuento microbiano y pruebas de
microorganismos específicos para productos terminados elaborados en
Anglopharma S.A 1

RESUMEN

En este estudio se demostrara mediante las pruebas de enumeración y recuperación de
microorganismos especificos que el método, para análisis microbiológico de productos no
estériles, de la USP vigente, es apropiado para analizar los productos terminados de naturaleza
semisólida, líquida, productos de uso vaginal y cápsulas de gelatina dura elaborados en
Anglopharma S.A. Para evaluar la confiabilidad de las técnicas en los productos de naturaleza
semisólida (Piroxicam gel 0,5% y Hidrocortisona crema 1%), líquida (Ión K elixir 31,2%,
Calymag suspensión menta, Naproxeno suspensión 3%, Ametrex jarabe 3% y Teolixir elixir 80
mg/15 mL), productos vaginales (Clotrimazol tableta vaginal 100 mg) y cápsulas de gelatina
dura (Veran D cápsulas 20 mg) se realizaron recuentos de mesófilos aerobios, mohos,
levaduras y se realizaron pruebas de presencia/ausencia. Los recuentos y las pruebas de
presencia/ausencia se realizaron con cepas liofilizadas ATCC Accu-shot y Ez-CFU las cuales
son Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseuodomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus
brasiliensis y Salmonella Typhimurium, cada microorganismo se utilizo dependiendo lo
establecido, en la USP37 capítulo <61>, para cada producto. Para poder demostrar la aptitud
de las pruebas de recuento microbiano y de microorganismos especificos de cada lote de cada
producto se debía obtener un porcentaje de recuperación entre 50%-200%, siendo a partir del
70% un porcentaje de recuperación bueno y se debía observar la presencia de los
microorganismos inoculados verificando que las caracteristicas del microorganismo tanto
macroscópicamente como microscópicamente correspondían a la cepa desafiada. Los
resultados obtenidos fuerons conformes a los criterios de aceptación establecidos. De acuerdo
al estudio realizado, se pudo demostrar mediante las pruebas de enumeración y recuperación
de los microorganismos especificos, que el método para el análisis microbiológico de
productos no estériles de la USP vigente es apropiado para analizar los productos terminados
de naturaleza semisólida, líquida, vaginales y cápsulas de gelatina dura elaborados en
Anglopharma S.A.

Palabras claves: Liofilización, Recuentos, patógenos, mohos, levaduras, bacterias.
2

INTRODUCCIÓN

Anglopharma S.A es una compañía Colombiana que inicio su proceso de producción en el año
1984 y desde entonces se ha dedicado a fabricar, envasar y distribuir medicamentos para el
consumo humano (Anglopharma S.A.). Es una compañía que se encuentra certificada por ISO
9001:2008 y Buenas práticas de manufactura (BPM). Para el el desarrollo de sus protocolos se
rige a la USP (Convención de la Farmacopea de Estados Unidos).

La USP es una entidad fundada en 1820, que tiene como fin establecer ciertos parámetros para
asegurar la calidad, pureza y confiabilidad de productos como medicamentos, suplementos
dietarios e ingredientes alimenticios (USP). Estos parámetros establecidos por la USP son
controlados por la entidad Administración de Drogas y Alimentos, la cual esta encargada de
vigilar que estos se cumplan en Estados Unidos y 140 países más. (USP, 2013)

En Colombia los laboratorios farmaceuticos como Anglopharma S.A, deben seguir los
protocolos y normas establecidos en la USP y quien se encarga de verificar el cumpliento de
estas es el INVIMA. La compañia cumple con la normatividad establecida, con el fin de
continuar con su proceso operacional garantizando la calidad final de sus productos.

Esta compañía cuenta con un area de Control de Calidad a nivel fisico-químico y
microbiológico, las cuales se encargan de verificar el estado de las materias primas, productos
terminados, material de envase primario, entre otros y aprobarlos o rechazarlos garantizando
con los resultados obtenidos el cumplimiento de las normas ISO 9001:2008 y Buenas Practicas
de Manufactura (BPM).

Cada protocolo, tanto a nivel fisico-quÍmico como microbiológico, debe contar con unos
criterios de aceptación para aprobar o rechazar un producto y que a su vez el resultado
obtenido en el análisis diario sea confiable y garantizado, por lo cual Anglopharma S.A decidió
realizar el presente estudio con el objetivo de demostrar mediante pruebas de enumaración y
recuperación de los microorganimos especificos, que el método para analisís microbiológico de
productos no estériles, de la USP vigente son apropiados para analizar los productos
terminados de naturaleza semisólida, líquida, productos vaginales y cápsulas de gelatina dura
elaborados en Anglopharma S.A.
Verificación de la aptitud de las pruebas de recuento microbiano y pruebas de
microorganismos específicos para productos terminados elaborados en
Anglopharma S.A 3

JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los medicamentos no estériles son productos suceptibles a contaminación con
microorganismos como bacterias, mohos, levaduras, entre otros. La contaminación puede
producirse debido a materias primas en mal estado, una calidad higiénica deficiente en el
proceso de fabricación por operarios, ambientes, superficies, agua, en el proceso de envasado o
empaquetado (Gennaro, 2003).

Productos contaminados con microorganismos pueden acarrear daños a la industria generando
altos costos debido a que los microorganismos pueden degradar el principio activo del
producto o los excipientes alterando la composición del medicamento; lo cual puede generar
que se realicen devoluciones, reprocesos o destruccion del medicamento, donde se ve afectado
el nombre de la empresa generando desconfianza en el consumidor y en algunas ocasiones
hasta procedimientos legales. (Fjeld, 2011) Al consumidor puede generar enfermedades o
intoxicaciones al estar presente un microorganismo patógeno.

Este estudio debe garantizar que la técnica junto con los medios de cultivo son capaces de
permitir el crecimiento y recuperación de los microorganismos, y así mismo que los medios de
cutltivo especificos recuperen microorganismos especificos, de lo contrario no puede ser
utilizada para realizar el control de calidad microbiológico de producto terminado. (Fjeld,
2011)

Para garantizar la calidad microbiológica de un producto no estéril en este caso de naturaleza
semisólida, líquida, cápsulas de gelatina dura y de uso vaginal, se requieren de especificaciones
detalladas donde se especifiquen los límites y criterios de aceptación del producto final
(Gennaro, 2003).
4

REFERENTES CONCEPTUALES-MARCO TEORICO

Evaluación de la confiabilidad de las técnicas microbiológicas

La confibialidad de una técnica es cuando los datos están exentos de un error y son
consistentes. Esta se puede asegurar con una prueba, una prueba repetida, formas equivalentes
y consistencia interna. (McDaniel et all 2005)

Recuento de microorganismos

Para realizar el estudio se debe trabajar con microorganismos de una concentración conocida
inferior a 100 UFC/mL en 0,1 mL, para lo cual se pueden obtener cepas de referencia ATCC o
se puede realizar una curva de calibración para cada microorganismo.

Las cepas de referencia certificadas garantizan que son cultivos puros indicando que no
presentan contaminación, que los microorganismos no mutaron ya que no se han alterado las
caracteristicas de cada microorganismo, por otro lado se han realizado pruebas bioquímicas y
pruebas moleculares para cada microorganismo (Montoya M). Para garantizar que el
microorganismo siga cumpliendo con estas caracteristicas, no se deben realizar más de cuatro
pases a partir de la cepa de referencia. (Montoya M)

Por el contrario, al realizar una curva de calibración con un Patrón de McFarland o por
espectrofotometria, su preparación va a ocupar mas tiempo para realizar el estudio y no va
garantizar la concentración del microorganismo, por otro lado por este método no se garantiza
un cultivo libre de contaminación y el uso de este debe ser en menos tiempo (Fjeld, 2011).

Debido a esto de se decidio utilizar cepas ATCC, obtenidas de Microbiologics, donde se
trabajaron los siguientes productos:

• EZ-ACCU SHOT : Es una preparación de cepas liofilizadas las cuales se utilizan para
pruebas cuantitativas para verificar el crecimiento del microorganismo en diferentes
medios de cutlivo. Cada pellet esta diseñado para arrojar un recuento de 10-100 UFC
por 0,1 mL y tiene una estabilidad de ocho horas. (Microbiologics, 2010)

• EZ-CFU: Son cepas liofilizadas las cuales se utilizan para pruebas cuantitativas con el
fin de verificar el crecimiento del microorganismo. Se requiere realizar dilución en
Buffer fosfato pH 7,2 antes de utilizar la cepa, con el fin de que en 0,1 mL de inoculo
se encuentran de 10-100 UFC. (Microbiologics, 2010)

Recuento de mesófilos aerobios: Son microorganismos que tienen la capacidad de crecer en
condiciones aerobias y temperaturas de 20 a 40 ºC, los cuales pueden incluir tanto especies
patógenas como no patógenas. Este recuento se realiza con el fin de determinar la carga
bacteriana en una muestra determinada, la calidad del producto, condiciones higiénicas y
manipulación del producto durante la elaboración. El recuento se puede realizar en superficie y
en profundidad. (Ellner, 2000) (Pascual et all 2000)
Verificación de la aptitud de las pruebas de recuento microbiano y pruebas de
microorganismos específicos para productos terminados elaborados en
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Recuento de mohos y levaduras: Este recuento se realiza debido a que microorganismos
como los mohos no solo generan el deterioro de los productos sino que pueden producir
toxinas que al ser ingeridas por el humano y animales generan toxicidad, por otro lado las
levaduras no generan daño en si al consumidor pero si al producto. El recuento se realiza con
el fin de poder determinar la carga microbiológica de mohos y levaduras en el producto a
investigar con una muestra representativa y así verificar la calidad del producto. (Pascual et all
2000)