Upscaling en optimalisatie van een fermentatieproces aan de hand van Corynebacterium ...

67 Pages·2014·1.59 MB·Dutch

Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen

Academiejaar 2013 – 2014

Upscaling en optimalisatie van een fermentatieproces
aan de hand van Corynebacterium glutamicum

Quinten Christiaens

Promotor: MSc. Christophe Wille

Tutor: Dr. MSc. Ing. Imca Sampers

Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van
Master in de industriële wetenschappen: Biochemie

Auteursrecht

De auteur, de promotoren en de tutor geven de toelating deze masterproef voor
consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk
ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met de
verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze
masterproef.

Kortrijk, juni 2014

De auteur,
Quinten Christiaens

De promotor, De tutor,
Msc. Christophe Wille Dr. MSc. Ing. Imca Sampers

Woord vooraf:
Dit werk kon slechts tot stand komen dankzij de steun en hulp van vele mensen. Via deze
weg zou ik aan hen graag een woord van dank richten.
Eerst en vooral zou ik mijn promotor Christophe Wille ten zeerste willen bedanken om mij
te begeleiden tijdens het verloop van mijn masterproef. Ook wil ik hem bedanken voor de
uitgebreide uitleg over de complexe technische werking van de fermentoren. Bij deze wil
ik hem ook bedanken voor de goede raad en ondersteuning bij het schrijven van mijn
masterproef.
Verder gaat mijn dank ook uit naar alle andere docenten die mij geholpen hebben met
het realiseren van mijn praktisch werk. In het bijzonder wil ik hierbij Professor Katleen
Raes en Professor Imca Sampers bedanken bij wie ik altijd terecht kon met vragen. Ook
docente Caroline Vandenbussche en docent Yannick Verheust wil ik bedanken voor de
hulp bij respectievelijk de refluxopstelling en het HPLC-systeem.
Ook een woord van dank aan mijn medestudenten in het labo. Zij zorgden namelijk voor
een goede positieve werksfeer in het labo.
Een woord van dank gaat ook uit naar de onderhoudsstaf van de campus die mij wanneer
nodig 's morgens vroeg om 6u ontvingen met een vriendelijke glimlach en leuke babbel
en 's avond bereid waren te wachten tot 20u30 om de gebouwen af te sluiten zodat mijn
fermentaties lang genoeg konden doorgaan.
Tenslotte gaat, niet onbelangrijk, mijn oprechte dank uit naar mijn ouders die mij altijd
steunden in het verloop van mijn studies.
Quinten Christiaens
Juni 2014
I
Inhoudsopgave
Abstract .............................................................................................................................................. 1
Samenvatting ...................................................................................................................................... 2
Inleiding .............................................................................................................................................. 3
1. Literatuurstudie .......................................................................................................................... 4
1.1. Fermentaties ...................................................................................................................... 4
1.1.1. Fermentatie: Het begrip ............................................................................................. 4
1.1.2. Fermentoren ............................................................................................................... 5
1.1.3. Upscaling .................................................................................................................... 6
1.1.4. Enkele problemen bij de upscaling van een fermentatieproces ................................ 6
1.1.4.1. Upscaling van volumetrische massa-overdrachtscoëfficiënt ............................. 6
1.1.4.2. Upscaling van de pH ........................................................................................... 7
1.1.4.3. Upscaling van het sterilisatiesysteem ................................................................ 7
1.1.4.4. Regelen van de temperatuur bij upscaling ......................................................... 7
1.2. Lysine .................................................................................................................................. 8
1.2.1. Gebruik en toepassingen ............................................................................................ 8
1.2.2. Productie .................................................................................................................... 8
1.2.3. Pathway en metabolische engineering van C. glutamicum: ...................................... 9
1.2.3.1. Pathway .............................................................................................................. 9
1.2.3.2. Metabolische engineering ................................................................................ 11
1.2.4. Secretie: .................................................................................................................... 15
1.2.5. Opname: ................................................................................................................... 18
1.3. Maillard reactie ................................................................................................................ 19
1.4. Schuim en antischuim ...................................................................................................... 19
2. Materialen en methoden ......................................................................................................... 24
2.1. Werkomstandigheden ...................................................................................................... 24
2.2. Glycerolstock .................................................................................................................... 24
2.3. Startcultuur ...................................................................................................................... 25
2.4. Inoculum ........................................................................................................................... 25
2.5. Fermentatie ...................................................................................................................... 26
2.6. Staalname & verwerking .................................................................................................. 29
2.6.1. Zuurtegraad (=pH) .................................................................................................... 29
2.6.2. Optische densiteit (=OD) .......................................................................................... 30
2.6.3. Kolonievormende eenheden (=KVE) ........................................................................ 30
II
2.6.4. Partiële zuurstofdruk ................................................................................................ 31
2.7. Derivatisatie lysine ........................................................................................................... 31
2.8. Bepaling hoeveelheid lysine met HPLC ............................................................................ 33
2.9. Productenlijst ................................................................................................................... 35
3. Resultaten en discussie ............................................................................................................ 36
3.1. Fermentaties op erlenmeyerschaal ................................................................................. 36
3.1.1. Fermentatie met minimaal medium voor L-lysine productie .................................. 36
3.1.2. Fermentatie met minimaal medium voor L-lysine productie waarin de Maillard
reactie is doorgegaan tijdens steriliseren. ............................................................................... 38
3.1.3. Conclusie fermentaties in erlenmeyer ..................................................................... 40
3.2. Fermentaties in 2L fermentor .......................................................................................... 40
3.2.1. Fermentatie met minimaal medium voor L-lysine productie .................................. 40
3.2.2. Conclusie fermentaties in 2L fermentor .................................................................. 42
3.3. Experimenten in 5L fermentor ......................................................................................... 43
3.3.1. Fermentatie met lage beluchting (1,6 L/min - 30 rpm - 30°C) ................................. 43
3.3.2. Fermentatie met aangepaste beluchting en roersnelheid....................................... 45
3.3.3. Fermentatie met extra verhoging van de beluchting............................................... 48
3.4. Vergelijking fermentaties in erlenmeyer en fermentor ................................................... 50
3.5. Lysine bepaling ................................................................................................................. 51
4. Besluit ....................................................................................................................................... 52
Literatuurlijst .................................................................................................................................... 54

III
Lijst met symbolen en afkortingen
AEC S-2-aminoethyl L-cysteine
ASA L-aspartaat semialdehyde
ASD L-aspartaat semialdehyde dehydrogenase
ASK Aspartokinase
ASP L-aspartaat
AZ Aminozuur / Aminozuren
CoA Co-enzym A
DAP Diaminopimelate
dapA Gen voor dihydrodipicolinaat synthase
DAPDH Diaminopimelate dehydrogenase
DHPR Dihydrodipicolinaat reductase
DHPS Dihydrodipicolinaat synthase
FDNB Fluorodinitrobenzeen
HPLC High-Performance liquid chromatography
K Michaelisconstante
M
k a Volumetrische massa overbrengingscoëfficiënt
L
KVE Kolonievormende eenheden
NADPH Gereduceerd Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat
NADP+ Nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat
NB Nutrient Broth
OD Optische Densiteit
pO Partiële zuurstofdruk
2
SEM Scanning Electron Micrograph
V Maximale snelheid
max
vvm Volume lucht per volume medium per minuut

IV
Lijst van tabellen
Tabel 1.1 De overexpressie van dapA en de gevolgen voor de flux naar L-threonine en L-lysine (De
Graaf et al., 2001) ............................................................................................................................. 12
Tabel 2.1 Productenlijst ................................................................................................................... 35

V
Lijst van figuren
Figuur 1.1 Principe fermentatie ......................................................................................................... 5
Figuur 1.2 Pathway (2 weergaves) van L-lysine productie en regulatie in Corynebacterium
glutamicum (terugkerende pijlen naar boven = feedback inhibitie) (Sahm et al., 1995, De Graaf et
al., 2001) ........................................................................................................................................... 10
Figuur 1.3 Een nieuwe strategie ter verhoging van de lysine productie door fluxkoppeling van
twee pathways (Kind et al., 2013) .................................................................................................... 14
Figuur 1.4 Intracellulaire en extracellulaire lysine concentratie en opname van het dipeptide Lys-
Ala (Erdmann et al., 1993) ................................................................................................................ 16
Figuur 1.5 Lysine exporter over het membraan (Erdmann et al., 1993) .......................................... 17
Figuur 1.6 Overzicht van de regulatie van opname en secretie van lysine (Erdmann et al., 1993) . 18
Figuur 1.7 Maillard reactie (Fennema, 1996) ................................................................................... 19
Figuur 1.8 SEM van cellen bij: (a) gewone omstandigheden; (b) hoge agitatie; (c) hoge aëratie ... 20
Figuur 2.1 De drukval over de kolom in functie van de tijd bij het stapsgewijs verhogen van de
snelheid van de mobiele fase ........................................................................................................... 34
Figuur 3.1 OD in functie van tijd ....................................................................................................... 37
Figuur 3.2 pH in functie van tijd ....................................................................................................... 37
Figuur 3.3 Log(KVE) in functie van tijd ............................................................................................. 37
Figuur 3.4 OD in functie van tijd ....................................................................................................... 39
Figuur 3.5 pH in functie van tijd ....................................................................................................... 39
Figuur 3.6 log(KVE) in functie van tijd .............................................................................................. 39
Figuur 3.7 OD in functie van tijd ....................................................................................................... 41
Figuur 3.8 pH in functie van tijd ....................................................................................................... 41
Figuur 3.9 Log (KVE) in functie van tijd ............................................................................................ 42
Figuur 3.10 OD in functie van tijd ..................................................................................................... 43
Figuur 3.11 pH in functie van tijd ..................................................................................................... 43
Figuur 3.12 log(KVE) in functie van tijd ............................................................................................ 44
Figuur 3.13 OD in functie van tijd ..................................................................................................... 46
Figuur 3.14 pH in functie van tijd ..................................................................................................... 46
Figuur 3.15 pO in functie van tijd .................................................................................................... 47
2
Figuur 3.16 log(KVE) in functie van tijd ............................................................................................ 47
Figuur 3.17 OD in functie van tijd ..................................................................................................... 49
Figuur 3.18 pH in functie van tijd ..................................................................................................... 49
Figuur 3.19 pO2 in functie van tijd ................................................................................................... 49
Figuur 3.20 log(KVE) in functie van tijd ............................................................................................ 50

VI