Untersuchungen über den Einfluß von Abwasser — Organismen auf Krankheitserreger PDF
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FORSCH U NGSB ER ICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN Herausgegeben durch das Kultusministerium Nr.856 Professor Dr. Heinrich Reploh Dr. Günther Gängel Dr. Alexander Nehrkorn Hygiene -Institut der Universität Münster Untersuchungen über den Einfluß von Abwasser -Organismen auf Krankheitserreger Als Manuskript gedruckt WESTDEUTSCHER VERLAG / KOLN UND OPLADEN 1960 ISBN 978-3-663-03830-6 ISBN 978-3-663-05019-3 (eBook) DOI 10.1007/978-3-663-05019-3 G 1 i e der u n g 1. Einleitung • S. 5 . . . . . 2. Methodik • S. 6 a) Isolierung von Mikroorganismen und Züchtung in zweigliedriger Reinkultur Fütterungsversuche mit Reinkulturen • • S. 6 b) Versuche mit Modellkläranlagen •• • S. 7 c) Fluoreszensmikroskopische Methoden • • S. 8 . . . . . 3. Ergebnisse • • S. 9 a) Fütterungsversuche mit Reinkulturen • • S. 9 b) Versuche mit Modellkläranlagen • S.15 4. Diskussion • • S.22 5. Zusammenfassung • S.24 6. Literaturverzeichnis • • s.26 Seite 3 1. Einleitung Zwischen dem steigenden Wasserbedarf und der laufend zunehmenden Abwas serbelastung unserer Vorfluter bestehen bedenkliche Wechselbeziehungen. In immer größerem Umfang muß zur Sicherstellung des Wasserbedarfs auf Oberflächenwasser zurückgegriffen werden. Der Kreislauf "Trinkwasser Abwasser-Trinkwasser" ist vielerorts schon Wirklichkeit geworden. Damit hat die Frage der Wirksamkeit von Kläranlagen in bakteriologischer Hinsicht heute auch erheblich an Interesse gewonnen. Mit neueren Unter suchungsmethoden hat sich der Nachweis von Krankheitserregern (Tuberkel bakterien, Salmonellen u.a.) im Kläranlagenablauf immer wieder erbringen lassen. Andererseits wird sich auch nicht bestreiten lassen, daß wenig stens die Häufigkeit des Vorhandenseins von Krankheitserregern Beziehun gen zur Art des Reinigungsverfahrens und zur Belastung der einzelnen Anlagen hat. Hingewiesen sei hier auf die Anreicherung von Krankheits erregern im Schlamm bei guter mechanischer Vorbehandlung. Ebenso kann die stoßweise Einleitung von Abwässern aus Krankenhäusern oder Schlacht höfen durch ausreichend große Absitzbecken einen gewissen Ausgleich finden. Damit verbessern sich aber die Aussichten für biologische Ein wirkungen auf die Krankheitserreger, wenn eine günstige Keimflora nicht nur zum Abbau der organischen Substanz, sondern auch zu einer Einwir kung auf Krankheitserreger führen kann. Aufgrund unterschiedlicher Beobachtungen an vielen Abwasser-Reinigungs anlagen schien es uns sinnvoll, die Einwirkung von Abwasserorganismen auf Krankheitserreger im Experiment unter genau übersehbaren Versuchs bedingungen zu untersuchen, um damit gewisse Grundlagen für die Beur teilung und vielleicht auch für die Verbesserung der Reinigungswirkung von Kläranlagen gerade bezgl. des Auftretens der Krankheitserreger zu gewinnen. Unsere Versuche zu dieser Frage basieren auf zwei gegensätzlichen An ordnungen. Einmal wurden bestimmte Protisten des Abwassers isoliert, insbesondere solche, die als Bakterienvertilger bekannt sind. Durch Fütterungsversuche mit verschiedenen Bakterienarten wurde nach dem Vor bild von BAHR ihr Verhalten gegenüber pathogenen Keimen studiert. Die Lebendfärbung der Keime mit Acridinorgane und der fluoreszensoptische Nachweis der Bakterien im Zellinnern der Protisten bot die Möglichkeit, die Freßvorgänge im einzelnen zu verfolgen. Seite 5 In einem zweiten Ansatz verwendeten wir Modell-Kläranlagen in Labora toriumsgröße, die nach dem Schlammbelebungsverfahren arbeiten. Nach Zu satz von Aufschwemmungen pathogener Keime wurde der Ablauf und der be lebte Schlamm auf das Vorhandensein dieser Keime geprüft. Auch hier ver su~hten wir, durch Verwendung fluorochromierter Bakterienkulturen den Weg der Keime im Belebungsbecken näher zu verfolgen. 2. Methodik a) Isolierungen von Mikroorganismen und Züchtung in zweigliedriger Reinkultur. Fütterungsversuche mit Reinkulturen Als Versuchsobjekt wählten wir Paramaecium caudatum, das als Bakterien vernichter im Rahmen der biologischen Selbstreinigung wie im künstli chen Klärverfahren bekannt ist (Literatur bei BAHR). Um gleiches physio logisches Verhalten aller Ciliaten eines Versuchs zu garantieren, wur den ausgehend von einem Individuum die Versuchsstämme als Klone gezüch tet. Aus Abwasser isolierte Paramaecien wurden nach LOSINA-LOSINSKI mehrmals für 15 min in sterilem Teichwasser gewaschen, wobei die Nahrungs vakuolen mit früher aufgenommenen Fremdstoffen abgestoßen werden. Die Zucht erfolgte nach BAHR in einem 20prozentigen Salatblätterdekokt beim pH-Wert von 6,8 und bei 22°C in sterilen Erlenmeyerkolben mit jeweils 20 ml Nährlösung. Zur Fütterung dienten Aufschwemmungen von Reinkultu- ren von Bacillus subtilis. Für die Fütterungsversuche mußten größere Mengen von Ciliaten gewaschen werden, um sie weitgehend vom Futterkeim Bacillus subtilis zu befreien. Zu diesem Zweck wurden die Paramaecien - Suspensionen in Zentrifugen gläser gebracht, in denen ein Gummistempel gängig eingepaßt war. Der Stempel war durchlöchert und die Öffnung mit einem Stück Membranfilter verschlossen. Auf diese Weise gelang es, eine größere Anzahl von Cilia ten durch fünfmaliges jeweils zweiminütiges Zentrifugieren mit immer wieder erneuertem sterilen Teichwasser für die Fütterungsversuche zu %. reinigen. Die Verluste an Paramaecien waren dabei nicht größer als 10 Zählungen erfolgten in einer graduierten Kapillarpipette. Die Isolierung und Züchtung anderer Abwasser-Mikroorganismen stieß auf größere technische Schwierigkeiten, so daß wir uns im folgenden auf die mit Paramaecium caudatum gemachten Erfahrungen stützen. Die Fütterungsversuche wurden ebenfalls in sterilem Teichwasser mit einem pR-Wert von 6,8 und bei 220 C angesetzt. Wir verwendeten dabei Seite 6 Erlenmeyerkolben mit 20 ml Wasser. Als Testkeime wählten wir Salmonella typhi, Salmonella paratyphi-B und als Vergleichsobjekte Staphylococcos aureus haem. sowie Bacillus subtilis. Für Keimzählungen nach dem Plat tengußverfahren verwendeten wir keine Spezialnährböden, sondern einfachen Nähragar, damit nennenswerten Verunreinigungen nicht zu rechnen war. b) Versuche mit Modellkläranlagen Eine zweite Versuchsreihe galt der Beobachtung von Versuchskläranlagen bei Zusatz pathogener Keime. Die verwendeten Schlammbelebungsbecken gehörten zwei verschiedenen Typen an, beide entwickelt von Prof.Dr. KEHR (Institut für Siedlungswasserwirtschaft der Techn. Hochschule Hannover). Becken Nr. 1 faßte 3 1 Abwasser, das mittels Kieselgurausströmer belüf tet wurde (Abb. 1). Die vorgeschlagene Aufenthaltszeit des Abwassers betrug 12 Stunden. Die Becken Nr.2a und 2b hatten ein Volumen von jeweils 5 1 und wurden auf die gleiche Weise belüftet (Abb.2). Die Konstruktion dieser Becken vermied bestimmte Fehler, die beim Becken Nr. 1 in Erscheinung getreten waren. A 8 I -1-- N N A B o N -&--- -------- N 0 0 0 0 0 0 0 I 00. 0 I I / 0001 0 0 I I / o 100 I I •I / 001 0 t ; 00 0 + o 100 :0i0 g L L A b b i 1 d u n g A b b i 1 dun g 2 Versuchsklärbecken Nr. 1 Versuchsklärbecken Nr. 2 und 3 schematischer Aufriß schematischer Aufriß N N: Wasserspiegel, A:Schlammabsitzraum mit Ablaufrinne B:Be lüftungsraum, L:Luftzufuhr. Strömung in Pfeilrichtung' Sei te 7 Die Versuchsanlagen wurden mit einem mechanisch durch Emscherbrunnen vorgeklärten Gemeindeabwasser einer Vorortsiedlung (PETZELT) gespeist. Die Dosierung erfolgte aus 25-I-Vorratsflaschen mit Hilfe eines Zeit relais, das in bestimmten Abständen die erforderlichen Abwassermengen in die Becken entließ. Nach einigen Tagen Einlaafzeit wurde die Klär wirkung der Anlage regelmäßig kontrolliert und mikroskopisch (Phasen konstrast) die sich entwickelnde Organismengesellschaft beobachtet. Bei befriedigender Arbeitsweise wurden dann die Aufschwemmungen pathogener Keime direkt in die Belebungsbecken gegeben. Für die Keimzahlbestimmungen der pathogenen Keime verwendeten wir speziel le Diagnostikmedien, um eine Abgrenzung gegen saprophytäre Mikroorganis men zu ermöglichen. Dabei bewährte sich neben dem Wismut-Sulfit-Nähr boden nach WILSON-BLAIR besonders der Fuchsin-Laktose-Agarnach ENDO zur Anzüchtung von Salmonellen. c) Fluöreszensmikroskopische Methoden Mit Hilfe der von STRUGGER entwickelten Methodik der Vitalfärbung von Bakterien mit Acridin-Orange versuchten wir, das Schicksal der pathoge nen Keime bei den Fütterungsversuchen und beim Passieren der Modell kläranlage genauer zu verfolgen. Vorher war zu prüfen, ob der gewählte Farbstoff weder die Bakterien in ihrem Gesamtverhalten (insbesondere Vermehrung, Pathogenität und Antigeneigenschaft) noch die Abwasserorga nismen in irgendeiner Weise schädigt. Die von uns ausgewählten Keime (Salmonellen, Staphylokokken und Heuba zillen) wurden nach den Angaben von STRUGGER auf Agar-Nährsubstraten gezüchtet, die Acridin-Orange in einer Konzentration von 1 : 20 000 enthielten. Die Keime zeigten gutes Wachstum, ihre Antigeneigenschaften bleiben voll erhalten, und die fluoreszensmikroskopische Untersuchung ergab, daß alle Zellen gut fluorochromiert waren (grüne Fluoreszens des lebenden Plasmas). Ein Zusatz von Acridin-Orange zu den Paramaecien-Kulturen in Mengen von 1 : 5000, 1 : 10 000 und 1 : 20 000 ergab keine Differenz zu den Ansätzen ohne Farbstoffzusatz. Die Paramaecien fluoreszierten von Grün (Plasma) bis Orange (Vakuolen). Für unsere Versuche sind weiterhin von Bedeutung die von STRUGGER ange gebenen Zusammenhänge zwischen Farbton und Farbstoffkonzentration (Tab. 1). Die beobachtete Art der Fluoreszens erlaubt damit Rückschlüsse auf die Menge des aufgenommenen Farbstoffes. Seite 8 Tabelle 1 Der Konzentrationseffekt bei Acridin-Orange (n~ch STRUGGER) Konzentration von Fluoreszens- Acridin-Orange farbe 1 ·· 100 kupferrot 1 ·· 1000 orangerot 1 : 10 000 gelbgrün 1 ·· 100 000 grün Zur Vermeidung photodynamischer Wirkungen des Fluorechroms wurden alle Kultur- und Versuchsgefäße im Dunkeln gehalten. Präparate wurden entweder als Frischpräparat direkt oder bei Paramaecien und anderen Einzelobjekten nach Lufttrocknung auf dem Objektträger fluores zensmikroskopisch untersucht. 3. Ergebnisse a) Fütterungsversuche mit Reinkulturen Die erste Versuchsreihe umfaßt acht Ansätze (Tab. 2). Tab e 1 1 e 2 Versuchsansätze zur Fütterung von Reinkulturen von Paramaecium caudatum mit Reinkulturen verschiedener Bakterien Kölbchen Paramaecium Futterkeime Anfangskeim- Nr. caudatum gehalt (AKG) Anzahl/ml K 1 60 Salmonella 5,8 x 105 K 2 0 typhi K 3 60 Salmonella 6 3,8 x 10 K 4 0 paratyphi-B K 5 60 Staphyloc. 4,7 x 107 K 6 0 aureus K 7 60 Bacillus 7,2 x 105 K 8 0 subtilis Seite 9 Die Keimzahlen der einzelnen Kölbchen wurde über acht Tage regelmäßig kontrolliert. Das Ergebnis dieser Zählungen ist in der Tabelle 3 und den Abbildungen 3 bis 6 dargestellt. 108 ...... -0- ......0 __ -0- K2 107 ---o- .__-- 0--- --- _-0 106 _-.0-- 0 ::c:: t7 ~ .§ CI> ::l(: 104 e e K7 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Tag A b b i 1 dun g 3 Keimzahlveränderung in Suspensionen von Salmonella typhi K bei Anwesenheit von Paramaecien K 2 ohne Zusatz von Ciliaten --0- _-0- o 0----- _O- ---- 1<4 107 _--6--_o_~-- 0 .. e_e-.----~e---K3 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Tag A b b i 1 dun g 4 Keimzahlveränderung in Suspensionen von Salmonella paratyphi-B K 3 bei Anwesenheit von Paramaecien 4 K ohne Zusatz von Ciliaten Seite 10 i I 2 7 4 7 5 7 2 7 g 0 0 0 0 0 0 0 0 a 1 1 1 1 1 1 1 1 T x x x x x x x x 8. 2 2 1 9 0 4 7 8 2, 5, 1 , 9, 9, 5, 4, 7, 2 7 3 8 6 7 2 7 g 0 0 0 0 0 0 0 0 a 1 1 1 1 1 1 1 1 T x x x x x x x x s 7. 7 2 6 0 2 0 0 6 li 6, 3, 4, 1, 1, 6, 3, 9, bti 8 6. Tag 2 7,0 x 10 7 1,Ox10 3 4,8 x 10 7 7,5 x 10 6 2,9 x 10 7 8,6 x 10 2 4,8 x 10 7 4,0 x 10 acillus su aramaecien Paramaecien K B P - g 2 0 6 0 3 0 7 0 6 08 0 2 0 6 0 mit mit hne 1 Ta 1 1 1 1 1 1 1 1 o K x x x x x x x x e 5. 4,8 8,0 1,7 3,9 1,3 3,0 9,1 9,8 /7 /8 z 5 6 nsät ag 2 10 6 10 3 10 6 10 6 108 10 5 10 7 10 7/8 1/3/ 2/4/ a T 3 s x x x x x x x x K K K h c 4. 8 9 0 2 0 9 2 9 e su 9, 7, 1, 8, 1 , 2, 3, 1, B r e Il V g 3 0 6 0 3 0 6 0 6 08 0 5 0 6 0 i - us e r a 1 1 1 1 1 1 1 1 h e Tab gen de 3. 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