Université de Sherbrooke Le photomarquage en fonction de la température du récepteur d ...

228 Pages·2012·7.98 MB·French

S 3^û
La chance ne sourit qu'aux esprits bien préparés.
-Louis Pasteur
Comprendre c'est avant tout unifier.
-Albert Camus
The joy of life consists in the exercise of one's energies, continuai growth, constant
change, the enjoyment of every new experience. To stop means simply to die. The
etemal mistake of mankind is to set up an attainable idéal.
-Aleister Crowley
Week das feuer in mir
-anonymer Philosoph
Université de Sherbrooke
Le photomarquage en fonction de la température du récepteur d'angiotensine II de
type 1 mène à une meilleure compréhension du mécanisme d'activation.
Par Jason Arsenault
Département de Pharmacologie
Thèse présentée à la Faculté de médecine et des sciences de la santé en vue de
l'obtention du grade philosophiae doctor (Ph. D.) en Pharmacologie
Juin 2010
Cette thèse a été évaluée par Dr. Emanuel Escher, Dr. Pierre Lavigne, Dr. Guylain
Boulay et Dr. Martin Bisaillon à l'Université de Sherbrooke et par Dr. Hans H. Zingg
de l'Université de McGill
Table des Matières
Publications ^
Liste des illustrations
Liste des tableaux *
Liste des sigles, abréviations et symboles
Résumé
1. Introduction :
1.1 RCPG - 1
1.1.1 Introduction 1
1.1.2 Génétique 2
1.1.3 Fonction 5
1.1.4 Structure et méthodes d'analyse strucmrale 11
1.1.5 Théorème d'activation 16
1.1.6 Perspectives 18
1.2 Système Rénine-Angiotensine-Aldostérone 19
1.2.1 Physiologie 19
1.2.2 Pathologie 23
1.2.3 Pharmacologie 24
1.3 Récepteurs d'angiotensine 11 26
1.3.1 hATi ; 26
1.3.2 hAT2 27
1.3.3 Protéine liant l'angiotensine 11 29
1.4 hAT, 30
u
1.4.1 Séquence codante 30
1.4.2 Structure 31
1.4.3 Activation 36
1.4.4 Mutants constitutivement actifs et inactifs 39
1.4.5 Signalisation pléiotropique 43
1.5 Photomarquage 45
1.5.1 Bpa 45
1.5.2 MPA 50
1.5.3 Variation, Reproductibilité et Problématique 55
1.5.4 Thermodynamique et nouvelle méthodologie 58
1.5.5 Quantification des points de contact 65
2. Article publié 1 : Température dépendant photolabelling variation in hATi 68
2.1 Avant propos 68
2.2 Résumé ' ' 69
2.3 Article 1 70
3. Article accepté 2: Température dépendant photolabelling of methionine mutants
enables a hierarchal ligand-receptor contact point accessibilities of the human
Angiotensin 11 type 1 receptor and its Activation mechanisms 92
3.1 Avant propos 92
3.2 Résumé 93
3.3 Article 3 94
4. Annexe 1 141
4.1 Matériels et Méthodes 142
4.2 Résultats 146
5: Discussion 157
iii
6. Conclusion et Perspectives 181
7. Remerciements 182
8. Listes des Références 184
IV
Publications
Reliées à cette thèse :
Arsenault, J., Renaud, M. P., Clement, M., Fillion, D., Guillemette, G., Leduc,
R., Lavigne, P. et Escher, E. "Temperature-dependent variations of ligand-
receptor contact points in hAT(l)." Journal of Peptide Science 13(9): 575-
80(2007).
Arsenault, J., Cabana, J., Fillion, D., Leduc, R., Guillemette, G., Escher, E. et
Lavigne, P. 'Température dépendant photolabeling of the human Angiotensin
II type I receptor reveals insights into its conformational landscape and its
Activation mechanism." Accepté le 7 juin 2010 dans Journal Biochemical
Pharmacology, in press, Ms. No. BCP-D-10-00412R1
Autres travaux :
Arsenault, J., Renaud, M. P., Clement, M., Fillion, D., Guillemette, G., Leduc,
R., Lavigne, P. et Escher, E. "Temperature-induced ligand contact point
variations of the hATi receptor and of the constitutively active mutant NI 1IG-
hATl." Adv Exp Med Biol 611: 339-40(2009).
Arsenault, J.,Lehoux, J.,Lantier, L.,Cabana, J.,Guillemette, G.,Lavigne,
P.,Leduc, R. et Escher, E. "A single nucleotide polymorphism of alanine to
threonine at position 163 of the human angiotensin II type 1 receptor impairs
Losartan affinity." Pharmacogenetics and genomics 20( 6): 377-388. 2010.
Karamyan, V.T., Arsenault, J., Escher, E., Speth, R., "Preliminary biochemical
characterization of the novel, non-ATl, non-AT2 angiotensin binding site
from the rat brain." Endocrine: accepté le 25 mars 2010, in press.
VI
Liste des Illustrations
Figure 1.1 : Résidus hautement conservés dans la famille rhodopsine 4
Figure 1.2 : Activation de la protéine G 6
Figure 1.3 : Sélectivité fonctionnelle d'un ligand 10
Figure 1.4 : Modèle tndimensionnel du p2-adrénergique 12
Figure 1.5 : Alignement de séquence entre hATi et les autres RCPG dont la
structure fut résolue par diffraction au rayon X 14
Figure 1.6 : Théorèmes d'activations 17
Figure 1.7 : Le système rénine-Angiotensine-Aldostérone 21
Figure 1.8 : Représentation schématique du type «Snake plot» du récepteur de
l'Angiotensine II de type 1 28
Figure 1.9 : Diagramme d'énergie libre entre le WT et NI 1IG hATi 42
Figure 1.10 : Stmcture et mécanisme de photolyse du Bpa 47
Figure 1.11 : Mécanisme radicalaire entre le Bpa et une 49
Figure 1.12 : Digestion au CNBr de la protéine contenant des méthionines
marquées au '^^l-[Sar'Bpa^] Angll 52
Figure 1.13 : Représentation schématique de hATi suivant une digestion au CNBr
avec les résidus et la taille (en kDa)d es fragments impliqués 54
Figure 1.14 : Matériel de photolyse des expériences de MPA 57
Figure 1.15 : Théorème énergétique des conformations 61
Figure 1.16 : Nouvelle appareil de photomarquage 64
Figure 2.1: Time-dependant photoreaction at 25''C 80
Figure 2.2: Incorporation yields as a fonction of température 81
vii
Figure 2.3: hATi and mutants photolabelled at différent températures and digested
with CNBr 83
Figure 2.4: Schematic représentation of the possible fragment sizes obtained by
CNBr digestion after photo-incorporation of the radioactive ligand into the
receptor 85
Figure 3.SI : Corrélation coefficient between the densitometric analysis and
the direct gel y counting of the most fluctuating mutant H256M 103
Figure 3.1 : Température dépendant photolabeling of hATi 107
Figure 3.S2 : Quantification of photolabeled régions of WT and NlllG hATi....l09
Figure 3.53 : Autoradiogram of the TM2,3 and 5 mutants 113
Figure 3.2 : Histograms of TM2 and 3 115
Figure 3.3 : Histograms of TM5 119
Figure 3.S4 : Autoradiogram of TM6 mutants 120
Figure 3.4 : Histograms of TM6 122
Figure 3.5 : The range of action of Bpa 125
Figure 3.55 : The complété ratios of ail tested mutants 128
Figure 3.6 : Molecular modeling of WT and CAM hATi ; 131
Figure 3.7 : Molecular modeling of[ Bpa^] Angll WT and CAM hATi 132
Figure 4.1 : Photomarquage température dépendant des mutants H256M,
NI 11G/H256M et NI 11W/H256M 148
Figure 4.2 : Photomarquage en fonction de la température où le pH .a été
contrôlé 150
Figure 4.3 : Photomarquage en fonction de la température suivie de différentes
conditions de digestion au CNBr 151
Figure 4.4 : Production d'inositols Phosphate en fonction de la température 152
vin
Figure 4.5 : Distribution des longueurs d'onde des lampes UV 154
Figure 4.6 : Les ratios e/y de tous les mutants 156
Figure 5.1 : Activation de la rhodopsine 162
Figure 5.2 : Activation de la rhodopsine par dynamisme moléculaire 163
Figure 5.3 : Changement conformationnelle pouvant affecter le ratio de
photomarquage ; 166
Figure 5.4 : Modélisation moléculaire du résidu NI 1IW 178
IX