UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E ...

246 Pages·2014·4.05 MB·Spanish

UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR E
INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Caracterización y mejora de levaduras de flor aisladas
en la Denominación de Origen Montilla-Moriles

TESIS DOCTORAL

MIRIAM MARÍN MENGUIANO, 2014.

El Dr. José Ignacio Ibeas Corcelles, Profesor Tilular del Área de Genética del
Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica de la Universidad Pablo
de Olavide, de Sevilla,

CERTIFICA:

Que el trabajo presentado por la licenciada Miriam Marín Menguiano titulado
‘Caracterización y mejora de levaduras de flor aisladas en la Denominación de
Origen Montilla-Moriles’ ha sido realizado íntegramente por ella bajo mi dirección,
reuniendo las condiciones de originalidad y calidad científica necesarias para constituir
una Tesis Doctoral y optar al grado de Doctora por la Universidad Pablo de Olavide, de
Sevilla.

Y para que así conste, expido el presente certificado.

Fdo. José Ignacio Ibeas Corcelles

Índice

Índice

INTRODUCCIÓN GENERAL…………………………………………15
1.- Los vinos de la Denominación de Origen Montilla-Moriles…………………….17
1.1.- D.O. Montilla-Moriles…………………………………………………………….…..17
1.2.- Breve reseña histórica…………………………………………………………….…..18
1.3.- Proceso de elaboración de los vinos generosos de la D.O. Montilla-Moriles……..21
1.3.1.- Etapa fermentativa……………………………………………………...22
1.3.2.- Envejecimiento…………………………………………………………..23
1.4.- Tipos de vino…………………………………………………………………………..25
1.4.1.- Vinos con crianza biológica……………………………………………………..25
1.4.1.1.- Vinos tipo Fino……………………………………………………..26
1.4.1.2.- Vinos tipo Amontillados…………………………………………...26
1.4.2.- Vinos con crianza físico-química…………………………………….…26
1.4.2.1.- Vinos tipo Oloroso………………………………………………….26
1.4.2.2.- Vinos tipo Dulce……………………………………………………27
2.- Levaduras responsables de la crianza biológica………………………………....27
OBJETIVOS…………………………………………………………..…29
MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………….33
1.- Organismos utilizados durante el trabajo……………………………………..…35
1.1.- Saccharomyces cerevisiae……………………………………………………………..35
1.2.- Escherichia coli…………………………………………………………………….…36
1.3.- Ustilago maydis…………………………………………………………………….….36
2.- Medios de cultivo y condiciones de crecimiento…………………………………36
2.1.- Medios para el crecimiento de S. cerevisiae y condiciones de cultivo….….37
2.2.- Medios para el crecimiento de U. maydis y condiciones de cultivo.…..…...38
2.3.- Medios para el crecimiento de E. coli y condiciones de cultivo……………39
3.- Recogida de muestras…………………………………………………………...…39
4.- Métodos genéticos……………………………………………………………….…40
Índice

4.1.- Deleción de genes…………………………………………………..…………40
4.2.- Transformación de microorganismos……………………………...………..41
4.2.1.- Transformación de S. cerevisiae………………………………..………41
4.2.2.- Transformación de U. maydis…………………………………………..41
4.2.3.- Transformación de E. coli………………………………………………42
4.3.- Extracción de ácidos nucleicos………………………………………...…….42
4.3.1.-Extracción de ADN genómico……………………………………….…..42
4.3.2.-Extracción de ADN plasmídico……………………………………….…43
4.3.3.- Extracción de ARN……………………………………………………..43
4.4.- Inducción de mutantes rho-………………………………………………….43
4.5.- Inducción de mutantes rho- con bromuro de etidio………………………..43
4.6.- Fusión de protoplastos……………………………………………………….43
4.7.- Ensayo de esporulación en S. cerevisiae……………………………………..44
4.8.- Conjugación…………………………………………………………………..44
5.- Métodos microbiológicos………………………………………………………….44
5.1.- Análisis de producción resistencia de factor killer…………………………44
5.2.-Fermentación y asimilación de azúcares…………………………………….45
5.3.- Tiempo de generación……………………………………………………..…45
5.4.- Velocidad de formación de flor……………………………………………...46
5.5.- Competencia entre levaduras de flor………………………………………..46
5.6.- Crianza biológica en laboratorio…………………………………………….46
6.- Métodos moleculares………………………………………………………………47
6.1.- Cariotipo electroforético de levaduras (CHEF)…………………………….47
6.2.- RFLP de ADN mitocondrial…………………………………………………47
6.3.- Análisis de microsatélites…………………………………………………….48
6.4.- Análisis del fragmento 5.8S-ITS……………………………………………..48
6.5.- Manipulación de ácidos nucleicos…………………………………………...49