universidad austral de chile facultad de ciencias veterinarias instituto de patología animal anemia

38 Pages·2010·0.38 MB·English

UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS

INSTITUTO DE PATOLOGÍA ANIMAL

ANEMIA INFECCIOSA DEL SALMÓN (ISA): DETERMINACIÓN DE LOS
POSTULADOS DE KOCH EN SALMÓN DEL ATLÁNTICO (Salmo salar).

Memória de título presentada como parte
de los requisitos para optar al TÍTULO DE
MÉDICO VETERINARIO.

SUSAN HELLEN DUHALDE DELGADO

VALDIVIA – CHILE

2010
PROFESOR PATROCINANTE: Dr. Ricardo Enríquez S.
Nombre Firma

COLABORADOR: Sra. Mónica Monrás S.
Nombre Firma

PROFESORES CALIFICADORES: Dr. Alex Romero Z.
Nombre Firma

Dr. Rafael Tamayo C.
Nombre Firma

FECHA DE APROBACIÓN: 05 Mayo 2010
ÍNDICE

Capítulo Página

1. RESUMEN……………………………………………………………...............1

2. SUMMARY……………………………………………………………..............2

3. INTRODUCCIÓN……………………………………………………................3

4. MATERIAL Y MÉTODOS……………………………………………………..9

5. RESULTADOS………………………………………………………………....15

6. DISCUSIÓN…………………………………………………………................22

7. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………………….26

8. ANEXOS…………………………………………………………………….….32

9. AGRADECIMIENTOS………………………………………………………...35
1

1. RESUMEN

Con el objetivo de determinar los postulados de Koch aplicados a la Anemia Infecciosa
del Salmón (ISA), se utilizaron 80 juveniles de salmón del Atlántico (Salmo salar)
provenientes de una piscicultura sin antecedentes de enfermedades. Durante la semana de
aclimatación, fueron chequeados sanitariamente de acuerdo al protocolo de la OIE (2006).
Para la elaboración de los inóculos se utilizaron 10 salmones del Atlántico (Salmo salar) de 3
a 4 kg infectados naturalmente con ISAV (virus de la Anemia Infecciosa del Salmón).

Los peces fueron inoculados intraperitonealmente con 0,1 ml de homogenado filtrado
(HF) en 0,22 µm de órganos y 0,1 ml de sangre. Ambos inóculos provenientes de peces
adultos infectados naturalmente con ISAV. Luego de la inoculación, los peces permanecieron
durante 30 días en estanques rotulados, con 80 l de agua a una salinidad de 15‰. Los peces
muertos o moribundos fueron removidos y posteriormente chequeados sanitariamente. Se
utilizó la línea celular ASK (riñón de salmón del Atlántico) para el aislamiento viral y
titulación. La confirmación de la presencia del virus fue realizada por RT-PCR en ambos
grupos de peces (adultos y juveniles).

Los peces inoculados con HF de órganos y su duplicado, registraron mortalidad
durante el período que alcanzó al 85% y 75% respectivamente. El grupo inoculado con sangre
registró una mortalidad del 100%. El grupo de peces control no registró mortalidades.

En cuanto a la signología clínica, lo más frecuente fue branquias pálidas, exoftalmia y
equimosis periocular. Internamente se detectó ascitis, enteritis hemorrágica, hemorragia en los
ciegos pilóricos, hemorragias petequiales en grasa visceral, esplenomegalia e hígado oscuro.

Los títulos virales detectados en pool de órganos (corazón, riñón y bazo) de los peces
inoculados con HF de órganos fueron de 105,2 TCID /ml y 104,5TCID /ml. El título viral de
50 50
pool de órganos de los peces inoculados con sangre fue de 105,5 TCID /ml. Se logró
50
reproducir experimentalmente ISA en salmón del Atlántico (Salmo salar), confirmando los
postulados de Koch.

Palabras claves: ISA, salmón del Atlántico, postulados de Koch.
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2. SUMMARY

INFECTIOUS SALMON ANAEMIA (ISA): KOCH POSTULATES IN ATLANTIC
SALMON (Salmo salar).

With the purpose of determine the infectious salmon anaemia (ISA) Koch postulates,
80 juveniles of Atlantic salmon (Salmo salar) without illness were used. During the week of
acclimatization they were sanitary checked in accordance with the OIE Manual (2006). For the
elaboration of the infectious homogenate, 10 Atlantic salmon (Salmo salar) of 3 to 4 kg
naturally infected with ISAV were used.

The fishes were inoculated intra peritoneal with 0.1 ml of organs filtered homogenate
in 0.2µm and 0.1 ml of blood were used too. Both inoculums were from fish naturally infected
with ISA. After inoculation, the fishes remained in labelled water tanks, with 80 l of water
with 15‰ of salinity. The water tanks were controlled every day and death or dying fish were
removed and sanitary checked. The cell line ASK (Atlantic salmon kidney) was used for the
viral isolation and titration. Confirmation of the virus presence was made by RT-PCR in both
groups of fish (adults and juvenile).

Fish inoculated with organs filtered homogenate and its duplicate showed mortality
during the period that reached 85% and 75% respectively. The group inoculated with blood
showed a mortality of 100%, the control group showed no mortality.

Regarding the clinical symptoms, the most common was pale gills, exophthalmia, and
periocular ecchymosed. In the inside was detected ascites, hemorrhagic enteritis,
haemorrhagic caeca, petechiae in visceral fat, splenomegaly and dark liver.

The viral titles detected in the organs pool (heart, kidney and spleen) of fishes
inoculated with HF were of 105,2 TCID /ml and 104,5TCID /ml. The viral title in the organ
50 50
pools of fish inoculated with blood was of 105,5 TCID /ml. The experimental challenge of ISA
50
in Atlantic salmon (Salmo salar) was achieved confirming Koch postulates.

Key words: ISA, Atlantic salmon, Koch postulates.
3

3. INTRODUCCIÓN

Chile es un país privilegiado por su disponibilidad de agua: 4.300 kilómetros de
territorios colindantes con el Océano Pacífico lo confirman y hacen comprensible el gran
despliegue de actividades marítimas que se han desarrollado durante las últimas décadas del
siglo XX. Dentro de estas la salmonicultura ocupa un lugar destacado, logrado a través de un
intenso período de crecimiento económico y expansión territorial de las actividades de cultivo,
esfuerzos que han permitido ubicar a Chile como el segundo productor mundial de salmón
después de Noruega, superando a países como Escocia y Canadá (Buschmann 2002). Las
principales especies cultivadas son salmón del Atlántico (Salmo salar), salmón coho
(Oncorhynchus kisutch) y trucha arcoiris (O. mykiss) (Lozano 2001).

La intensificación alcanzada en el proceso de producción, así como la alta
concentración de la salmonicultura en la Décima Región, y el abastecimiento permanente de
ovas extranjeras, facilitan el riesgo de introducción permanente y diseminación de
enfermedades infectocontagiosas (Reyes 1983 y 1985, Méndez 1988, Bustos 1993). En
consecuencia Chile ha ido perdiendo paulatinamente la ventaja histórica de país poseedor de
un ambiente libre de enfermedades (Méndez y Vidal 1994). Estas enfermedades
infectocontagiosas y otras de etiología desconocida, causan altas mortalidades y grandes
pérdidas económicas cuando se establecen en los nuevos ecosistemas (Macchiavello 1992).

Una de las enfermedades virales de notable importancia económica dentro de la
salmonicultura es la Anemia Infecciosa del Salmón (ISA). Es una enfermedad transfronteriza,
altamente infecciosa que afecta al s. Atlántico, causada por un Orthomyxovirus, el virus de la
anemia infecciosa del salmón (ISAV) (Falk y col 1997). Afecta fundamentalmente a peces
cultivados en agua marina o expuestos a agua de mar. Sin embargo, también se han descrito
brotes en peces mantenidos en agua dulce (Nylund y col 1998). La enfermedad puede aparecer
con carácter sistémico y letal, caracterizado por anemia severa y hemorragias en diversos
órganos, con mortalidades diarias que varían desde 0,05% a 1% o más (OIE 2006), por lo cual
se deben tomar las medidas pertinentes para evitar su propagación (Salmón Chile 2008). La
mortalidad acumulada varía de moderada a alta, y puede sobrepasar el 90% en casos graves.
Normalmente la enfermedad se inicia en una unidad de producción y pueden pasar meses
antes de que se desarrolle en unidades vecinas (Raynard y col 2001a).

La enfermedad fue observada por primera vez en Noruega el año 1984 y afecto a s.
Atlántico en fase de mar (Dannevig y Falk 1995). Posteriormente se registraron brotes en
Canadá en el año 1996 (Byrne y col 1998) y en Escocia el año 1998 (Rodger y col 1998).
Durante el año 2000 se describieron focos de la enfermedad en Nueva Escocia, Islas Faroe y
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Dinamarca (OIE 2006) y el 2001 en Estados Unidos (Moneke y col 2005). Se describe que
infecta a salmón del Atlántico y a trucha arcoiris, pero sólo salmón del Atlántico presentaría
signos clínicos de la enfermedad, en tanto las truchas arcoiris podrían ser reservorios. Durante
el año 1999 se aisló el agente desde poblaciones de salmón coho (Oncorhynchus kisutch) sin
enfermedad clínica en el sur de Chile (Kibenge y col 2001).

El ISAV se encontraba presente en Chile desde 1999 en salmón coho (, sin embargo,
en junio de 2007 un centro de engorda de s. Atlántico situado en la zona central de la isla de
Chiloé, presentó un marcado incremento de la mortalidad posterior a un brote de
Piscirickettsiosis. Por su sintomatología se confirmó como un brote ISA, el primero de
presentación clásica y en afectar a esta especie en Chile. A partir de julio de 2007 se manifestó
la enfermedad causando mortalidades en el s. Atlántico, en centros de cultivo de la zona de la
Isla Lemuy, Chiloé (Salmón Chile 2008).

El agente etiológico es un virus con envoltura, de 100 - 130 nm de diámetro, con un
genoma que consta de 8 segmentos monocatenarios de RNA con polaridad negativa, y
actividad hemoaglutinante (Dannevig y col 1995, Falk y col 1997, Mjaaland y col 1997,
Eliassen y col 2000, Falk y col 2004).

Las propiedades morfológicas, fisicoquímicas y genéticas del ISAV coinciden con las
de los Orthomyxoviridae (Rimstad y Majaaland 2002) y recientemente se ha clasificado a
ISAV como la especie tipo del nuevo género Isavirus dentro de esta familia de virus. Se ha
descrito la secuencia de nucleótidos de cada uno de los ocho segmentos genómicos (Clouthier
y col 2002). Se han identificado cuatro proteínas estructurales principales, incluyendo una
nucleoproteína de 68 kDa, una proteína de la matriz de 22 kDa, una hemaglutinina-esterasa de
42 kDa y una glicoproteína de superficie de 50 kDa con capacidad potencial de adsorción, que
están codificadas en los segmentos genómicos 3, 8, 6 y 5, respectivamente (Falk y col 2004).

Análisis de la secuencia del segmento 8 de varios aislados de ISAV, revelan dos
genotipos, designados como genotipo europeo (I) y genotipo norteamericano (II). Variaciones
en la secuencia de la región altamente polimórfica (HPR) de la glicoproteina HE, ha permitido
la separación de los aislados de virus ISA, en grupos diferentes de HPR, existiendo un grupo
HPR0 que consiste en una cepa no cultivable, no patógena y detectable solo por medio de RT-
PCR. Al secuenciar los aislados chilenos, se observa que ISAV presenta un inserto de 33
nucleótidos (11 aminoácidos) en el extremo 3’ del segmento 5 que codifica para la proteína F,
situación que le da un carácter único a este virus (Godoy y col 2008).

El agente etiológico es sensible al cloroformo, a altas temperaturas y a pH ácido. La
capacidad de infección de éste se pierde cuando se ve expuesto a temperatura sobre 56 ºC por
5

5 minutos y a pH 4 o más ácido. Alcanza su máxima replicación a una temperatura de 15 ºC
pero esta se anula a los 25 ºC (Falk y col 1997, Hellebo y col 2004).

El mecanismo de acción del virus está basado primero en reconocimiento del
hospedador y la unión a los receptores de membrana del eritrocito, seguido de la entrada a la
célula huésped. Para la primera función utiliza a la Hemoaglutinina-esterasa (HE),
glicoproteina de superficie, que cumple dos funciones: la primera es el reconocimiento de la
célula hospedadora por medio de la unión al receptor celular compuesto de ácido sialico para
inducir infección. Esta función es cumplida por la porción Hemoaglutinina, mientras que la
porción esterasa es una enzima destructora de receptor (RDE), que disuelve la conexión de
hemoaglutinina y por consiguiente permite la liberación de nuevas partículas virales desde
células infectadas (Workenhe y col 2007).

La principal ruta de infección es probablemente a través de las branquias (Totland y col
1996, Mikalsen y col 2001) pero no se puede excluir la infección intestinal. Se ha demostrado
que las células endoteliales parecen ser las primeras células objetivo de ISAV (Hovland y col
1994, Koren y Nylund 1997). También se ha comprobado la replicación del virus en
leucocitos (Dannevig y Falk 1994, Hovland y col 1994, Sommer y Mennen 1996). Como las
células endoteliales son las células diana, la replicación del virus puede tener lugar en varios
órganos.

El virus se transmite de manera horizontal, a través de contacto directo entre peces
susceptibles e infectados, material biológico, heridas, sangre, contenido visceral, orina, fecas y
mucus. La sangre y mucus contienen grandes cantidades de virus y transmiten más
efectivamente el virus que la orina y fecas. Los peces que sobreviven a la enfermedad pueden
diseminar partículas virales por más de un mes en el agua circundante (Cipriano 2002).
Además, se describe la transmisión del virus por desechos derivados de las actividades de
cosecha, sean éstas realizadas en mar o en plantas de proceso, cuando no existe tratamiento de
los efluentes o por el uso compartido de equipamientos y materiales entre centros de cultivo o
entre jaulas con distinto estatus sanitario, sin mediar procedimientos de desinfección capaces
de eliminar el virus (Vagsholm y col 1994, Rolland y Nylund 1998, USDA 2002).

Si bien sólo se han descrito brotes naturales de ISA en s. Atlántico cultivado, se han
identificado con infección subclínica la trucha común y marina (Salmo trutta) (Raynard y col
2001a). ISAV se ha detectado asimismo en dos especies marinas, el carbonero (Pollachius
virens) y el bacalao del Atlántico (Gadus morhua), pero sólo en peces colectados en la
proximidad de jaulas con s. Atlántico que manifestaban ISA (McClean y col 2003). Mediante
infección experimental, se ha demostrado la replicación de ISAV en varias especies de peces,
incluyendo la trucha común, la trucha marina, la trucha arco iris, la trucha alpina (Salvelinus
alpinus) y el arenque (Clupea harengus) (Nylund y col 1995, Nylund y col 1997, Nylund y col
2002). Se ha demostrado que especies de piojo de mar, Caligus elongatus y Lepeophtheirus
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salmonis, pueden actuar como vectores del virus ISA, pudiendo potenciar el contagio y
diseminación de la enfermedad durante brotes epidémicos y en situaciones endémicas (Nylund
y col 1994).

Externamente los peces con ISA presentan letargia, hemorragia en la cámara ocular y
exoftalmia, puede ocurrir hemorragia en el abdomen y edema epidérmico. Entre las lesiones
macroscópicas más características se incluye, branquias pálidas, hemorragias petequiales en
grasa visceral y ciegos pilóricos, ascitis que va desde color amarillento a sanguinolento,
enteritis hemorrágica, esplenomegalia, coloración oscura y aumento de tamaño del hígado,
ocasionalmente se presentan hemorragias petequiales en músculo esquelético (Bruno y Poppe
1996, OIE 2006).

Dentro de las lesiones microscópicas más características de la enfermedad se incluye
congestión y necrosis de intestino y ciegos pilóricos, vasculitis, inflamación perivascular del
hígado, congestión y dilatación focal de los sinusoides hepáticos, necrosis hepática
hemorrágica multifocal, hemorragias intersticiales en los riñones y puede haber una necrosis
tubular (Cipriano 2002, Moneke y col 2005). Los hallazgos hematológicos más significativos
son: hematocrito inferior a 10% en estadios finales y en casos menos severos 25 - 30%, frotis
sanguíneos con eritrocitos vacuolizados o degenerados y presencia de eritroblastos con
núcleos de forma irregular (OIE 2006).

ISA está considerada como una enfermedad importante en los países donde se ha
descrito. En consecuencia, la mayoría de los países han iniciado medidas legislativas generales
y/o programas de control para combatir la enfermedad. El impacto económico y productivo
sobre la industria de la acuicultura se debe principalmente a las pérdidas causadas por la
enfermedad misma y a la aplicación de medidas gubernamentales como planes de erradicación
y programas de control (OIE 2006).

El diagnóstico de ISA se basa en hallazgos clínicos y patológicos, en combinación con
pruebas de laboratorio que confirman la presencia del virus. Estos incluyen el aislamiento del
virus en cultivo celular seguido por su identificación inmunológica, RT-PCR e IFAT (Woo y
Bruno 1999). En el caso del cultivo celular los órganos utilizados son bazo, corazón y riñón.
Las líneas celulares más utilizadas son ASK (riñón de salmón del Atlántico) y SHK-1 (riñón
anterior de salmón Atlántico) u otras líneas celulares susceptibles como TO y CHSE-214. Se
debe tener en cuenta la variabilidad de la cepa y la capacidad para replicarse en las diferentes
líneas celulares. Las células SHK-1 y ASK parecen permitir más efectivamente, el crecimiento
de los aislados de virus conocidos hasta la fecha y en células ASK puede aparecer un efecto
citopático (CPE) característico. Los cultivos celulares inoculados son incubados a 15 ºC,
observados periódicamente y en caso de presencia del virus se observa un efecto citopático
(CPE) característico, que consiste en células vacuolizadas que se redondean y separan de la
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superficie de crecimiento. Luego de esto se realiza un subcultivo a modo de confirmación
(OIE 2006).

La reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) detecta
pequeñas cantidades de RNA genómico viral, material genético de ISAV que está presente en
los tejidos de peces infectados. Los partidores FA y RA derivados del segmento 8 del RNA
son utilizados para la detección de ISA. El test de RT-PCR es positivo cuando se detecta un
producto específico de PCR de un tamaño molecular de 211pb. Las muestras utilizadas para
este examen son riñón y corazón (OIE 2006).

La incidencia de ISA puede reducirse notablemente aplicando medidas legislativas o
prácticas generales de manejo en lo que respecta al movimiento de peces, controles sanitarios
obligatorios y regulaciones de sacrificio y transporte. También pueden contribuir a reducir la
incidencia de la enfermedad las medidas específicas que incluyan restricciones sobre centros
afectados, sospechosos o próximos, el sacrificio sanitario obligatorio, la segregación
generacional, así como la desinfección de los desechos y el agua residual de los centros y las
plantas de procesamiento de peces (OIE 2006).

Para que una enfermedad sea considerada transmisible debe cumplir ciertos requisitos.
Estos requisitos fueron enunciados por el bacteriólogo alemán Robert Koch en 1884 basados
en sus experimentos con Bacillus anthracis. A través de estos estudios formuló los
denominados “Postulados de Koch”. Estos postulados se han tomado como referencia para
describir la etiología de los agentes causantes de una enfermedad infecciosa.

Los postulados indican que:

1. El agente debe estar presente en todos los individuos con la misma enfermedad.

2. El agente ha de ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la
enfermedad.

3. El agente aislado debe causar la enfermedad en un animal susceptible de ser
inoculado.

4. El agente debe ser reaislado de los animales experimentalmente infectados.

En consecuencia la hipótesis de este estudio es que la Anemia Infecciosa del Salmón
(ISA) es fácilmente reproducible a partir de homogenado de órganos, y sangre de peces
naturalmente infectados en juveniles de s. Atlántico (S. salar).