u

197 Pages·2002·7.02 MB·Spanish

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES
EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS
TESIS DOCTORAL
ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA
MARZO 1999
23246
DIOLIOrECA
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA
MICROORGANISMOS RESPONSABLES DE ALTERACIONES
EN ALIMENTOS ALTAMENTE AZUCARADOS
Memoria presentada por
ESPERANZA CASAS ALCANTARILLA
para optar al grado de
1119DIIUHUU3U
Doctor en Ciencias Biológicas
s309 ssO7~
UNIVERSIDADCOMPLUTENSE
12- U*S2 11-o
)C
Esperanza Casas
0 B0 la Directora del trabajo
y
AAh
-Ni
Dra. M~ José Valderrama Conde
MARZO 1999
Este trabajo ha sido financiado gracias a la ayuda recibida de la Comisión Interministerial de
Ciencia y Tecnología, y los proyectos MR CT 93 08030 (europeo) y DGICYT UE 96-0018
(Comunidad de Madrid).
INDICE
Página
1.- INTRODUCCIÓN
1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos 2
1.2.- Alimentos altamente azucarados y microorganismos osmotolerantes 4
1.2.1.- Adaptación de las levaduras a altas concentacione~ de azúcar 7
1.3.- Los sorbatos como conservantes 10
1.3.1.- Mecanismos de actividad antimicrobiana del sorbato 11
1.3.1.1.- Alteraciones morfológicas 12
1.3.1.2.- Alteraciones en la función metabólica 12
1.3.2.- Resistencia de los microorganismos al sorbato 14
1.3.3.- Aplicaciones del sorbato 19
1.4.- Identificación de levaduras 20
1.4.1.- Esporulación 23
II.- OBJETIVOS DEL TRABAJO 27
30
III.- MATERIALY MÉTODOS
31
111.1.- Muestras y alteraciones
35
111.2.- Alsíamiento de microorganismos
38
111.3.- Mantenimiento de las cepas
38
111.4.- Identificación de levaduras
42
111.4.1.- Esporulación
“44
111.5.- Identificación de hongos filamentosos
45
111.5.1.- Identificación de Aspergillus
46
111.5.2.- Identificación de Penicilliunz
48
111.6.- Reproducción de las alteraciones
t 48
111.6.1.- Reproducción del olor a ‘petróleo
111.6.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 48
111.6.2.1.- Reproducción in siw 48
111.6.2.2.- Reproducción en medios experimentales 48
111.7.- Estudio del mecanismo de licuefacción 49
1
111.8.- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del ácido sórbico 50
111.9.- Caracterización del compuesto responsable del olor a
petróleo’ 51
111.9.1.- Identificación de 1,3-pentadieno 51
111.9.2.- Cuantificación de la producción de pentadieno a partirde sorbato 53
.
111.9.2.1.- Cuantificación de sorbato en los medios 54
111.9.2.1.1.- Extracción y preparación de las muestras 54
111.9.2.1.2.- Condiciones de HPLC 55
111.9.2.1.3.- Cuantificación de sorbato 56
111.9.2.1.4.- Estudio de recuperación 56
111.9.2.2.- Cuantificación de pentadieno en los medios 56
111.9.2.3.- Determinación de biomasa 58
111.10.- Prueba estandarizada para la reproducción del olor a “petróleo” 58
IV.- RESULTADOS 60
IV.1.- Microorganismos aislados e identificación 61
.. .
IV.1.1.- Levaduras 61
IV.l.2.- Hongos filamentosos 76
IV.2.- Esporulación en cepas representativas 86
IV.3.- Reproducción de las alteraciones 90
IV.3.l.- Reproducción del olor a ‘petróleo’ yio gas 90
IV.3.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 93
IV.3.2.1.- Reproducción iii situ 94
IV.3.2.2.- Reproducción en medios experimentales 94
IV.4.- CMI de ácido sórbico para cepas seleccionadas 97
t’petróleo” 97
IV.5.- Identificación del compuesto responsable del olor a
IV.6.- Cuantificación de pentadieno producido a partir de sorbato 105
IV.6.l.- Cuantificación de sorbato 105
IV.6.l.l.- Recuperación de sorbato en los medios sin inocular 106
IV.6.1.2.- Determinación de sorbato en los medios inóculados 108
IV.6.2.- Cuantificación de pentadieno 110
IV.6.3.- Recuentos celulares 112
11
V.- DISCUSIÓN 114
V.l.- Caracterización de microorganismos aislados 115
V.l.1.- Levaduras 115
V.1.2.- Hongos filamentosos 127
V.2.- Esporulación 131
V.3.- Reproducción de las alteraciones 138
V.3.1.- Reproducción del olor a petróleo’ y/o gas 138
V.3.2.- Reproducción de las licuefacciones puntuales 143
....
V.4.- CMI de ácido sórbico para cepas seleccionadas 146
V.5.- Identificación de pentadieno como compuesto responsable del olor
a ‘petróleo 148
u
V.5.1.- Cuantificación de sorbato 155
V.5.2.- Producción de pentadieno 156
¡ V.5.3.- Recuentos celulares 157
V.6.- Prueba estandarizada 159
u
VI.- CONCLUSIONES 160
¡
VII.-BIBLIOGRAFLA. 163
¡
VIII.- APÉNDICES 178
E
Apéndice 1.- Medios de cultivo 179
Apéndice II.- Nombres actuales de levaduras 188
¡
¡
3
¡
3
u
u
111
u
u
¡
¡
3
¡
u
¡
¡
¡
¡
¡
3
¡
3
¡
u
¡
¡
L- INTRODUCCiÓN
¡
u
u
L- Introducción
1.1.- Levaduras contaminantes de alimentos
Aunque las levaduras son conocidas fundamentalmente por sus beneficios, tales
como la tradicional aplicación en la fabricación del vino, la cerVeza o el pan, su papel
como agentes responsables del deterioro en alimentos ofrece en la actualidad un amplio
campo de estudio. Las levaduras soncapacesde creceren un variado conjunto de alimentos
bajo determinadas condiciones, lo que puede llegar a suponer importantes pérdidas
económicas en ciertos sectores industriales. Entre estas condiciones que favorecen -e
incluso seleccionan- el crecimiento de las levaduras, destacan cuatro factores que pueden
actuar de forma sinérgica: baja actividad de agua (a~) -es decir, cantidad de agua del
alimento disponible para la actividad metabólica de los microorganismos-, bajo pH, bajas
temperaturas y la presencia, normalmente por adición, de agentes antibacterianos (Tudor
y Board, 1993). De esta forma, aquellos alimentos que posean una o más de estas
características serán susceptiblesde contaminación y deterioro por levaduras.
Así, se conocen alteracionesdebidas a levaduras contaminantes en alimentos como
zumos defrutas y refrescos, bebidas alcohólicas, alimentos altamente azucarados, verduras,
alimentos fermentados o conservados en ácido, productos lácteos y de panadería, o carnes
y pescados (Fleet, 1992; Deak y Beuchat, 1996). Las principales especies de levadura
asociadas con el deterioro de estos productos se especifican en la Tabla 1.
Respecto ala alteración producida porlevaduras, una primeramanifestación puede
ser la formación de biomasa, que es especialmente evidente cuando la levadura es
pigmentada, como es el caso de Rhodotorula spp.; en líquidos, la aparición de biomasa se
detecta por la aparición de turbidez. Cuando la presencia de biomasa queda enmascarada
porel propio alimento, la alteración puede deberse a los productos del metabolismo de las
levaduras; entre éstos, cabe destacar la formación de gas -CO
2-, que distorsiona la forma
de los envases y/o los propios productos, y la aparición de diversos olores y sabores de
fondo, provocados por la formación de alcoholes, ácidos orgánicos y ésteres (Fleet, 1992;
Tudor y Board, 1993).
2
U Introducción
Tabla 1.- Principales especies de levaduras responsables de deterioro, por orden
alfabético, y alimentos de los que se han aislado
Especie de levadura Alimentos alterados
Salmueras, carnes fermentadas y curadas, zumo de
Debaryomyces hansenii
naranja, leche, helado, nata, queso, yogur, pan, marisco
Dekkera intermedia Cerveza, vino, refrescos, yogur
Issarchenkia orientalis Leche, queso, yogur, salsa de tomate
Kloeckera apiculata Tomates, higos, cerezas en lata, yogur
Pichia membranzfaciens Salmuera de aceitunas, conservas en vinagre, salsa de
tomate, queso, carnes
Rhodotorula spp. Frutas tratadas térmicamente, nata, mantequilla, helado,
yogur, pan, carnes, marisco
Saccharomyces cerevisiae Refrescos, zumos de frutas, queso, yogur, pan
Saccharomyces exiguus Refrescos, carnes, marisco, chucrut
Schizosaccharomyces pombe Jarabes de azúcar
Zygosaccharomyces bailii, Zumos concentrados y jarabes de fruta, vino, salsa de
Zygosaccharomyces bisporus tomate, mayonesa, pan
Zygosaccharomyces rouxii Jarabes concentrados, zumos de fruta, rellenos de
pastelería, mazapán, ciruelas e higos, mayonesa, marisco
Modificado de Tudor y Board (1993.
3
L- Introducción
¡.2.- Alimentosaltamente azucarados y microor2anismos osniotolerantes
Los productos altamente azucarados se incluyen dentro de un amplio grupo de
alimentos que se denominan de humedad intermedia, conocidos por sus siglas en inglés
como IMF’s (Intermediate Moisture Foods) (Tilbury, 1976; Deak y Beuchat, 1996). Se
consideran alimentos de humedad intermedia a aquéllos que poseen un contenido en agua
entre 15 y 20 y una a~ con valores entre 0,60 y 0,85. Este ténnino engloba a muchos
alimentos sometidos a la adición de azúcar o sal, secado o curado, tratamientos que
conducen auna mejor conservación de losproductos, debidoal hecho bien conocido de que
disminuyendo la a~ mediante secado o adición de solutos, se puede retardar e incluso
inhibir el crecimiento microbiano. La Tabla 2 muestra algunos grupos de alimentos
azucarados incluidos como alimentos de humedad intermedia atendiendo a las
características de humedad y a.~ previamente descritas.
Tabla 2.- Principales productos azucarados de humedad intermedia, junto con su
humedad y su actividad de agua
Actividad
Humedad
Tipo de producto Ejemplos
( p/p) de agua (av)
Azúcares, jarabes, Azúcar sin refinar 0,4-0,7 0,60-0,75
conservas Jarabes de azúcares;
azúcar invertido 20-36 0,70-0,86
Miel, compota, mermelada 20-35 0,63-0,80
Concentradosde zumos Zumo de frambuesa 35 0,79-0,80
de frutas Zumo de naranja 35 0,80-0,84
Zumo de manzana 0,71-0,75
Productos de confitería Caramelos y toifees 8 0,60-0,65
y repostería Mazapán 15-17 0,67-0,80
Cerezas glaseadas 30 0,75
Pasteles de frutas 20-28 0,73-0,83
Chocolate Relleno de chocolate 0,64
Frutas desecadas Ciruelas, higos 20 0,68
Dátiles 12-25 0,60-0,65
datos no especificados.
- —
Modificadode Tilbury (1976), Jermini et al. (1987) y Tudor y Board (1993).
4