Towards a modified hydantoinase process for the chemoenzymatic production of chiral β-amino

122 Pages·2013·3.89 MB·English

by  Ulrike Engel

Towards a modified hydantoinase process for
the chemoenzymatic production of chiral
β-amino acids
Substrate synthesis, screening, and characterization of
novel biocatalysts
zur Erlangung des akademischen Grades eines
DOKTORS DER INGENIEURWISSENSCHAFTEN (Dr.-Ing.)
der Fakultät für Chemieingenieurwesen und Verfahrenstechnik
des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT)
genehmigte
DISSERTATION
von
Dipl.-Nat. Ulrike Engel
(geb. Bretschneider)
aus Chemnitz
Referent: Prof. Dr. C. Syldatk
Koreferent: Prof. Dr. J. Hubbuch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.10.2012

Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe und keine
anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet wurden. Wörtlich oder in-
haltlich übernommene Textpassagen wurden als solche kenntlich gemacht sowie die Satzung
des Karlsruher Instituts für Technologie (KIT) zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis
in der gültigen Fassung beachtet.
Karlsruhe, 29. März 2012
Ulrike Engel

Danksagung
Für ihre Unterstützung während meiner Promotion möchte ich folgenden Personen danken:
Herrn Professor Syldatk danke ich für die Überlassung des spannenden Themas und die
Möglichkeit zwei Monate lang in Südafrika zu forschen und zu leben.
Herrn Professor Hubbuch danke ich für die freundliche Übernahme des Koreferats
Herrn Dr. Jens Rudat danke ich für das Fördern und Forden, die stetige Motivation, kon-
struktive Diskussionen und überhaupt die gute Betreuung.
Birgit danke ich für ihre Unterstützung bei Fragen zum Thema HPLC.
Ein Dankeschön auch an Werner, der stets eine große Hilfe war, wenn die HPLC mal wieder
streikte.
Großen Dank auch an Sandra, Harald und Michaela, die für alle praktischen Belange im
Laboralltag immer ein offenes Ohr hatten.
Auch allen Studenten, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben, möchte ich danken:
Angélique Grawitter, Sebastian Ellinger und Ina Hein.
Meinen Kollegen am Tebi danke ich für die gute Arbeitsatmosphäre und die tolle Zeit auch
außerhalb des Labors bzw. nach Feierabend.
Katrin danke ich für die ausführliche Beratung bei molekularbiologischen Fragestellung, die
netten Teepausen und ihre Freundschaft.
Christian danke ich für seine Geduld und Unterstützung und für seine Liebe.
Schließlich danke ich dem BMBF für die finanzielle Unterstützung dieser Arbeit, die ein
Teilvorhaben des Verbundprojektes BioSysPro war.

Contents
Nomenclature ii
Abstract 1
Zusammenfassung 5
I Introduction 9
1 β-amino acids 11
1.1 Characteristics, occurrence in nature and applications . . . . . . . . . . . . . 11
1.2 Synthesis of chiral β-amino acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.1 Chemical routes to chiral β-amino acids . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.2.2 Biocatalytic routes to chiral β-amino acids . . . . . . . . . . . . . . . 14
2 The hydantoinase process and the enzymes involved 19
2.1 The hydantoinase process – Biocatalytic production of chiral α-amino acids . 19
2.2 Hydantoin cleaving enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.1 Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.2.2 Hydantoinases and dihydropyrimidinases . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 N-Carbamoyl amino acid cleaving enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3.1 β-ureidopropionases and -carbamoylases . . . . . . . . . . . . . . . . 24
L
2.3.2 -carbamoylases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
D
2.4 Hydantoin racemases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.5 Natural function of hydantoin cleaving enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . 27
2.6 Enzyme engineering for the “hydantoinase process” . . . . . . . . . . . . . . 28
3 Research Proposal 29
II Results published in or submitted to journals 31
4 Synthese aromatischer β-Aminosäuren mit neuen cyclischen Amidasen 33
5 Stereoselective hydrolysis of aryl-substituted dihydropyrimidines
by hydantoinases 41
6 Novel amidases of two Aminobacter sp. strains: Biotransformation
experiments and elucidation of gene sequences 61
Contents i
III Unpublished results 85
7 Putative pyrimidine degradation genes of Alternaria brassicicola 87
IV Final remarks 93
8 Concluding remarks and outlook 95
8.1 Concluding remarks . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
8.2 Outlook . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Bibliography 112
Nomenclature
βPhe ........... β-phenylalanine
CH -IMH ...... -5-(3-Indolylmethyl)-3-N-methylhydantoin
3 D,L
DMSO ......... Dimethyl sulfoxide
DSMZ .......... German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
ee .............. enantiomeric excess
HPLC .......... High-Performance Liquid Chromatography
IMH ........... Indolylmethyl hydantoin
IUPAC ......... International Union of Pure and Applied Chemistry
NCβPhe ....... N-Carbamoyl-β-phenylalanine
NCTrp ......... N-Carbamoyl-α-tryptophan
NMR ........... Nuclear Magnetic Resonance (spectroscopy)
ORF ........... Open Reading Frame
pClNCβPhe .... para-Chloro-N-carbamoyl-β-phenylalanin
pClPheDU ..... para-Chlor- -6-phenyl-5,6-dihydrouracil
D,L
PCR ........... Polymerase Chain Reaction
PheDU ......... 6-Phenyl-5,6-dihydrouracil
PheHyd ........ Phenylhydantoin
ii