The study on the roles of algae-modulated host vesicular trafficking in Aiptasia-Symbiodinium ...

255 Pages·2013·10.68 MB·English

by  國立中山大學 海洋生物研究所 洪明昌

國立中山大學海洋生物研究所
博士論文
Institute of Marine Biology
National Sun Yat-sen University
Doctorate Dissertation
受藻類操控的宿主囊泡運輸系統在
Aiptasia-Symbiodinium 胞內共生上所扮演的角色之探
討
The study on the roles of algae-modulated host vesicular
trafficking in Aiptasia-Symbiodinium endosymbiosis
研究生：洪明昌
Ming-Chang Hong
指導教授：宋克義 博士
Dr. Keryea Soong
陳鳴泉 博士
Dr. Ming-Chyuan Chen
中華民國 102 年 7 月
July 2013
i
誌謝
首先要感謝我的家人，尤其是我的父母與姐姐。謝謝你們一直以來的支持與
鼓勵，更謝謝你們將自己的身體健康和經濟狀況都照顧的非常好，讓我可以任性
地朝自己的天賦與興趣去發展。也謝謝你們包容我沒能留給你們太多的相處時間，
謝謝你們沒有對我責難與怪罪，謝謝！再者，感謝中山大學海科院陳宏遠 院長與
指導教授宋克義 博士在我最需要的時候拉我一把，使我成為他的學生。更感謝指
導教授陳鳴泉 博士在這 9年的光陰中，不斷地給予指導，無論是進度會議上或是
私下的討論與建議，讓我從一個超級外行人不只有機會進入海洋分子生物領域中，
更在研究能力上精進不少。另外要特別感謝教授 劉莉蓮博士，總是在我低落時給
予人生道路上明確的指引；感謝所辦秘書劉惠敏 小姐，總是幫忙我解決行政上的
事務，叮嚀我各種條規要準備的項目；感謝長庚周安國 醫師與郭和昌 醫師在我
生活困頓時給予幫助及鼓勵，讓我得以安然度過危機；感謝高雄大學副教授黃永
森 博士幫忙我解決人生道路上的難題；感謝曾博宏先生及該公司服務團隊總是配
合我的需求，幫助我建立各種儀器設備，提供研究所需。最後更要感謝高海科大
助理教授邱國勛 博士，無論是生活上、人生旅途上、學業上都不吝給予大力幫助，
幫助我在最後畢業這幾年解決我無法解決的難題，謝謝。
感謝這九年來曾經進入陳鳴泉實驗室，相處過的英敏學姐、家綺、育銘、貞
慈、雅穗、元鳳、柏翔、義德、欣鷸、建脩、坤銅、鈺雯、承佑及以所有學弟妹
們，感謝你們和我一起經歷彼此生命中這一段珍貴且不會重來的時光。感謝我的
摯友大頭、蠻牛、文沛與靖怡給予我精神上的支持，讓我撐過人生的低潮。感謝
我長庚同事明詳、文惠、美蘭、明欣、嘉倩與辣媽陪伴我許多歡樂的時光，療癒
我身心。最後，我最感謝一位與我同生共死七年的博士班學弟柏青，謝謝你總是
請我吃大餐，謝謝你每年幫我慶祝生日，謝謝你總是讓我認清事實，雖然你嘴巴
總是講不出好話，但每一件大事小事依然都是你在幫忙我，謝謝你一萬遍！
我終於畢業了，謝謝妳們~
ii
國立中山大學海洋生物研究所博士論文摘要
受藻類操控的宿主囊泡運輸系統在 Aiptasia-Symbiodinium
胞內共生上所扮演的角色之探討
研 究 生：洪明昌
指導教授：宋克義 博士、陳鳴泉 博士
高生產力的珊瑚礁生態系建立於腔腸動物與 Symbiodinium 屬渦鞭毛藻胞內共
生現象的基礎上。然而，宿主和共生藻之間複雜的生物過程與未知的交互作用仍
尚未被澄清。在這裡，我以美麗海葵 Aiptasia pulchella 為模式生物，先對 Aprab11、
Aprab3 與Aprab4 的角色做探討，描述共生小體與宿主細胞囊泡系統之間的互動，
再提出兩種方法深究胞內共生的分子調控機制。一是對宿主 cathepsin（CTS）家族
蛋白酶的角色探討，另一個是利用扣減雜交技術（SSH）識別出共生／游離態具有
差異表達的 Symbiodinium 基因。結果指出共生小體上沒有 Aprab11 的分布，可能
代表慢速再循環途徑無法與共生小體互動。Aprab3 與Aprab4 的持續出現，則顯示
共生小體與快速再循環途徑及 TGN有交互作用。宿主細胞胞噬小體及共生小體的
lysotracker red 染色及 bafilomycin A1 處理結果，表明胞噬小體的酸化受到
ApV-ATPase 所調控且共生小體內腔的酸性較弱。這與免疫染色發現共生小體內，
只缺乏 ApCTSH 與 ApV-ATPase 外，尚包含其他的 ApCTSs 的結果有一致性。細
胞內 ApCTSH 蛋白酶也被發現累積在早期的胞噬小體及部分 Aprab5-positive 早期
胞飲小體內，且其活性可於pH 6.8下活化。但以DCMU處理健康的共生小體時，
同時誘使酸化產生及 ApCTSH 與 ApV-ATPase 回到共生小體上。這些結果顯示共
生藻主動排除 ApCTSH 與 ApV-ATPase 於共生小體上，維持共生小體內腔的 pH，
避免受到ApCTS蛋白酶的損害。另一方面，SSH技術的應用發現 216個共生與175
個非共生的共生藻差異表現基因。獲得的差異表現基因依照不同的生理功能共分
成細胞分裂、細胞訊息傳導／溝通、細胞結構／移動、細胞／生物防禦、RNA 合
iii
成、蛋白質合成、新陳代謝及未分類等組別。不幸地，無論是共生還是非共生態，
都約有30 %的差異表達基因屬於未知基因，代表我們對共生藻的了解甚為不足。
定量 PCR 分析描繪出共生態共生藻在囊泡運輸、細胞骨架、蛋白酶抑制子、逆境
反應及光合作用等相關基因的表現較為活躍。反之，游離態共生藻的高表達差異
基因則出現在鞭毛形成與運動、細胞分裂、氮源輸送、細胞壁等相關功能中。總
而言之，宿主 CTS 蛋白酶家族與共生差異表現基因的研究提供了更多有關胞內共
生調控機制的知識與線索。
關鍵字：胞內共生、cathepsin、共生小體酸化、rab、扣減雜交、共生藻、Aiptasia
pulcehlla。
iv
The study on the roles of algae-modulated host vesicular trafficking in
Aiptasia-Symbiodinium endosymbiosis
Ming-Chang Hong
Advisor: Dr. Keryea Soong and Dr. Ming-Chyuan Chen
Institute of Marine Biology, National Sun Yat-sen University,
Kaohsiung 80424, Taiwan R. O. C.
The highly productive coral reef ecosystem is based on the cnidarian-dinoflagellate
endosymbiosis. However, the complex biological processes and interactions between
the host and symbionts were still unclarified. Here, I firstly investigated the roles of
Aprab11, Aprab3 and Aprab4 to describe the interaction between the symbiosomes and
vesicles in host cell, which based on a sea anemone model organism, Aiptasia pulchella.
Additionally, I also presented two approaches to dissect the molecular regulatory
mechanism of the endosymbiosis. One was the characterization of host cathepsin family
proteases, and the other was the identification of differentially expressed Symbiodinium
genes during the symbiosis/free-living stages by surppressive subtractive hybridization
(SSH). The results showed most of zooxanthellae-harbored symbiosomes were absent
of Aprab11 but were abundant of Aprab3 and Aprab4 that indicated the TGN-derived
vesicles and fast recycling routes were interacted with symbiosomes, but slow recycling
routes were not. Lysotracker red staining and bafilomycin A1 treatment with
phagosomes/symbisosomes in host cells indicated that the acidification of phagosomes
was mainly mediated by ApV-ATPase and the symbiosomal lumen was mildly acidic.
That’s consistent with the findings of immunostaining which the symbiosome were
filled with many Apcathepsins except Apcathepsin H and ApV-ATPase. Additionally,
the intracellular Apcathepsin H protease also accumulated in the early phagosmes and
part of Aprab5-positive early endosomes and its proteolytic acivity could be activated at
v
pH 6.8. But DCMU treatment of healthy symbiosomes could simultaneously induce the
acidification and re-contribution of Apcathepsin H and ApV-ATPase to symbiosomes.
Consequently, these results revealed that the Apcathepsin H and ApV-ATPase were
actively excluded from symbiosome by the zooxanthellae to maintain the pH of
symbiosomal lumen which were able to prevent damages from Apcathepsin proteases.
On the other hand, the application of SSH technique produced 216 symbiosis and 175
nonsymbiosis differentially expressed zooxanthellae genes. These
differentially-expressed genes were classified with different biological processes into
cell division, cell signaling/communication, cell structure/motility, cell/organism
defense, RNA synthesis, proten synthesis, metabolism and unclassified. Unfortunately,
~ 30 % differentially-expressed genes were belonged to unknown genes whether
symbiosis or nonsymbiosis that implicated the understanding to zooxanthellae was still
less than clear. Quantitative PCR assay revealed that the zooxanthellal genes related
with vesicle trafficking, cytoskeleton, protease inhibitor, stress response and
photosynthesis were more active during symbiotic phase. Conversely, the zooxanthellal
genes highly expressed at the nonsymbiotic phase were involved with flagellate
formation and motility, nitrogen transporter, cell division, cell wall-associated process…
and so on. Together, the current investigation of host cathepsin family and symbiosis
differentially-expressed zooxanthellal genes provided new knowledge and insights of
endosymbiosis regulatory mechanism.
Key words: endosymbiosis, cathepsin, symbiosome acidification, rab, SSH,
zooxanthellae, Aiptasia pulcehlla.
vi
目錄
論文審定書．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．i
誌謝．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．ii
中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． iii
英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．． v
目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．vii
圖表目錄．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．xii
縮寫字對照表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．xv
第一章 總論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
壹、研究背景．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．2
一、胞內共生對珊瑚礁的意義．．．．．．．．．．．．．．．．2
二、共生藻的分類與形態特徵．．．．．．．．．．．．．．．．3
三、共生小體是經由共生藻修飾過的胞噬小體而演變來的．．．．4
貳、本論文研究方向與實驗架構．．．．．．．．．．．．．．．．．6
参、參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7
第二章 rab蛋白於共生小體形成時所扮演的角色之探討．．．．．．．．．．10
壹、中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11
貳、英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12
参、著作發表．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13
第三章 V-ATPase 與共生小體內腔 pH 值調控機制之相關性探討．．．．．．14
壹、中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15
貳、英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．16
参、文獻回顧．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17
一、胞噬小體的形成與成熟．．．．．．．．．．．．．．．．17
二、胞噬小體的酸化主要由 V-ATPase 促成．．．．．．．．．．17
vii
三、藉由V-ATPase 探討共生小體無法酸化之機制．．．．．．．19
肆、材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20
一、實驗生物的取得與飼養．．．．．．．．．．．．．．．．20
二、實驗生物的 RNA抽取與 cDNA基因庫製作．．．．．．．．21
三、ApCTSs與 ApVHD 的基因選殖序列分析．．．．．．．．．22
四、ApCTSs 與 ApVHD 重組蛋白的建構、表現與純化．．．．．23
五、哺乳動物細胞之 EGFP reporter 分析．．．．．．．．．．．25
六、抗體．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26
七、西方墨點法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26
八、免疫螢光染色技術．．．．．．．．．．．．．．．．．．27
九、胞噬作用分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．28
十、細胞內酸性囊泡的測定．．．．．．．．．．．．．．．．28
十一、 DCMU 光合作用抑制劑與 bafilomycin A1 抑制劑處理．29
伍、結果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．31
一、ApVHD 基因序列及推演的氨基酸序列．．．．．．．．．．31
二、ApVHD 無法在哺乳動物細胞株系統有正常的細胞內分布．．32
三、辨認ApVHD 的抗體具有相當程度的專一性．．．．．．．．33
四、絕大部分的共生小體上缺乏 ApVHD 蛋白的存在．．．．．．33
五、ApVHD 會隨著胞噬小體的成熟而逐漸累積其上．．．．．．33
六、海葵宿主細胞內的胞噬小體酸化與 ApVHD 的累積呈正相關關
係並且可以被 bafilomycin A1所抑制．．．．．．．．．．．34
七、DCMU處理後，ApVHD會再分布於共生小體上．．．．．．34
八、酸性共生小體的族群個數隨著 DCMU的處理而增加，但可以被
bafilomycin A1 有效地抑制．．．．．．．．．．．．．．．35
陸、結論．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37
viii
柒、參考文獻．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．38
第四章 共生藻避開宿主 cathepsin 蛋白酶的機制之探討．．．．．．．．．．43
壹、中文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．44
貳、英文摘要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．45
参、文獻回顧．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46
一、在胞噬小體成熟過程中會活化 cathepsin 蛋白酶的活性．．．46
二、共生藻存活於胞噬小體內的策略．．．．．．．．．．．．47
三、藉由cathepsin 蛋白酶來探討 Aiptasia pulchella-Symbiodinium胞
內共生．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50
肆、材料與方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52
一、實驗生物的取得與飼養．．．．．．．．．．．．．．．．52
二、實驗生物的 RNA 抽取與 cDNA 基因庫製作．．．．．．．52
三、ApCTSs與 ApVHD 的基因選殖序列分析．．．．．．．．．52
四、ApCTSs與 ApVHD 重組蛋白的建構、表現與純化．．．．．53
五、哺乳動物細胞之 EGFP reporter 分析．．．．．．．．．．．55
六、抗體．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．56
七、西方墨點法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．57
八、免疫螢光染色技術．．．．．．．．．．．．．．．．．．57
九、胞噬作用分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．57
十、DCMU 光合作用抑制劑處理．．．．．．．．．．．．．．57
十一、 次細胞分層技術．．．．．．．．．．．．．．．．．57
十二、 蛋白酶酵素活性分析．．．．．．．．．．．．．．．59
伍、結果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．60
一、ApCTS 基因序列以及推演的氨基酸序列．．．．．．．．．60
二、ApCTSL無法在哺乳動物細胞株系統有正常的細胞內分布．．62
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