The Kv10.1 voltage gated potassium ion channel modulates the cell adhesion and cell migration

128 Pages·2015·22.11 MB·English

by  Ioannis K. Alexopoulos

The K 10.1 voltage gated potassium ion channel
v
modulates the cell adhesion and cell migration
hallmarks of cancer
DoctoralThesis
Inpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegree“Doctorrerumnaturalium(Dr.
rer. nat.)”intheMolecularMedicineStudyProgramattheGeorg-AugustUniversity
Go¨ttingen
submittedby
IoannisK.Alexopoulos
bornin
Chania,Greece
Go¨ttingen
April2015

Members of the Thesis Committee
Prof. Dr. Walter Stu¨hmer, Department of Molecular Biology of Neuronal Signals, Max
PlanckInstituteofExperimentalMedicine,Go¨ttingen,Germany
Prof. Dr. Luis A. Pardo, Department of Molecular Biology of Neuronal Signals, Max-
PlanckInstituteofExperimentalMedicine,Go¨ttingen,Germany
Dr. DieterKlopfenstein,DepartmentofBiophysics,ThirdInstituteofPhysics,Go¨ttingen,
Germany
DateofDisputation: 15/06/2015

Declaration
Iherebydeclarethatthisdoctoralthesishasbeenwrittenindependentlywithnoother
sourcesandaidsthanquoted.
IoannisK.Alexopoulos
Go¨ttingen,April2015

List of Publications
1. A.M.Jime´nez-Gardun˜o,M.Mitkovski,I.K.Alexopoulos,A.Sa´nchez,W.Stu¨hmer,
L. A. Pardo, and A. Ortega, “K 10.1 K(+)-channel plasma membrane discrete do-
v
main partitioning and its functional correlation in neurons.,” Biochim. Biophys.
Acta,vol. 1838,no. 3,pp. 921–931,Nov. 2013.
2. SchanilaNawaz,PaulaSa´nchez,SebastianSchmitt,NicolasSnaidero,MisˇoMitkovski,
CarolineVelte,BastianRouvenBru¨ckner,IoannisAlexopoulos,TimCzopka,Sang
Yong Jung, Jeong Seop Rhee, Andreas Janshoff, Walter Witke, Iwan AT Schaap,
David A. Lyons, Mikael Simons, “Actin filament turnover drives leading edge
growth during myelin sheath formation in the central nervous system”, [Submit-
ted]
3. I. K. Alexopoulos, L. A. Pardo, W. Stu¨hmer, M. Mitkovski, “K 10.1 overexpres-
v
sion enhances cell migration, while reducing cell-cell and cell-surface adhesion”,
[WorkingTitle-UnderPreparation]
4. I. K. Alexopoulos, K. Bro¨king, L. A. Pardo, W. Stu¨hmer, M. Mitkovski, “Cell mi-
gration is affected by the level and the pattern of laser energy dosage”, [Working
Title-UnderPreparation]
5. I. K. Alexopoulos, W. Stu¨hmer, M. Mitkovski, “ProRet: A novel algorithm to
dynamically quantify surface adhesion ability from Interference Reflection Mi-
croscopydata”,[WorkingTitle-UnderPreparation]

Contents
Contents
Acknowledgments iv
Abstract v
ListofFigures vi
ListofTables viii
ListofAbbreviations ix
1 Introduction 1
1.1 Ionchannels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 K 10.1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
v
1.2.1 Classification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.2 Sequenceandstructure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2.3 Electrophysiologicalproperties . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
1.2.4 Role . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.3 Cellmigration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.1 Significance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.2 Typesofcellmigration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.3.3 Ionchannelsandcellmigration . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.3.4 Primarycilia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.4 Cell-celladhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Cell-surfaceadhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.6 Acquisitionsettingsandcellmigration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.7 Scratchassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.8 Interferencereflectionmicroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.8.1 IRMprinciple . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.8.2 Quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.9 TIRF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2 Materials&Methods 20
2.1 Celllinesmanipulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.1 Celllines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.2 Normalculture . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.1.3 Transfection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.1.4 CellSorting . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.2 Electrophysiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 Molecularbiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3.1 RNApurification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
2.3.2 ReversetranscriptasePCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.3.3 Real-timePCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
2.4 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.4.1 Proteinextraction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.4.2 Proteinquantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.4.3 SDS-PAGEproteinseparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
i
Contents
2.4.4 Fluorescentdetectionfromgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4.5 Immunoprecipitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.4.6 Westernblotdetection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
2.5 Immunocytochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.5.1 Primarycilia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.5.2 Focaladhesionkinase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.5.3 Phalloidinstaining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6 Interferencereflectionmicroscopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6.1 Acquisition . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
2.6.2 Quantification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.7 Scratchassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.7.1 Samplepreparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.7.2 Liveimagingconditions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.7.3 Microscopesettings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.8 Cellsurfaceadhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8.1 Samplepreparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8.2 Cell-surfaceadhesionability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8.3 Cell-surfaceadhesiondynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.8.4 TIRF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.9 Imageanalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.9.1 Scratchassay . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.9.2 ScratchassaywithIRM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.9.3 Individualcelltrackingmeasurements . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.9.4 Cell-surfaceadhesionability . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.9.5 Cell-surfaceadhesiondynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.10 Stimulation/acquisitionsettingseffect . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.10.1 Lasermeasurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.10.2 Samplepreparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.10.3 Microscopesettings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2.10.4 Imageanalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.11 Statisticalanalysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
3 Results 46
3.1 Electrophysiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.2 Molecularbiology . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.3 Biochemistry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.3.1 Fluorescentdetectionfromgel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
3.3.2 ImmunoprecipitationandWesternblot . . . . . . . . . . . . . . . 48
3.4 K 10.1localization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
v
3.5 Cellmigration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.5.1 Effectofstimulation/acquisitionsettingsonscratchclosurespeed 51
3.5.2 K 10.1increasesscratchclosurespeed . . . . . . . . . . . . . . 53
v
3.5.3 EffectofK 10.1onindividualcellmigration . . . . . . . . . . . 54
v
3.6 Ciliaformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
3.7 Cell-celladhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.8 Cell-surfaceadhesion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
3.8.1 Adhesiveareaatmigrationfront . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
ii