The First Phylogenetic Analysis of Palpigradi (Arachnida)

28 Pages·2014·0.57 MB·English

The First Phylogenetic Analysis of Palpigradi
(Arachnida)—The Most Enigmatic Arthropod Order
Citation
Gonzalo, Gilbert, McIntyre Erin, Christian Erhard, Espinasa Luis, Ferreira Rodrigo L., Francke
Óscar F., Harvey Mark S., Isaia Marco, Kováč Ĺubomír, McCutchen Lynn, Souza Maysa F. V. R.,
and Zagmajster Maja. 2014. "The First Phylogenetic Analysis of Palpigradi (Arachnida) – The
Most Enigmatic Arthropod Order." Invertebrate Systematics 28: 350–360. doi: 10.1071/IS13057
Published Version
doi:10.1071/IS13057
Permanent link
http://nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:12313557
Terms of Use
This article was downloaded from Harvard University’s DASH repository, and is made available
under the terms and conditions applicable to Open Access Policy Articles, as set forth at http://
nrs.harvard.edu/urn-3:HUL.InstRepos:dash.current.terms-of-use#OAP
Share Your Story
The Harvard community has made this article openly available.
Please share how this access benefits you. Submit a story .
Accessibility
1 The
 first
 phylogenetic
 analysis
 of
 Palpigradi
 (Arachnida)—the
 most

2 enigmatic
 arthropod
 order

3 Gonzalo
 GiribetA,K,
 Erin
 McIntyreA,
 Erhard
 ChristianB,
 Luis
 EspinasaC,
 Rodrigo
 L.
 FerreiraD,
 Óscar
 F.

4 FranckeE,
 Mark
 S.
 HarveyF,
 Marco
 IsaiaG,
 Ľubomīr
 KováčH,
 Lynn
 McCutchenI,
 Maysa
 F.
 V.
 R.

5 SouzaD
 and
 Maja
 ZagmajsterJ

6

7 AMuseum
 of
 Comparative
 Zoology,
 Department
 of
 Organismic
 and
 Evolutionary
 Biology,
 Harvard

8 University,
 26
 Oxford
 Street,
 Cambridge,
 MA
 02138,
 USA.

9 BInstitut
 für
 Zoologie,
 Universität
 für
 Bodenkultur,
 Gregor-­‐Mendel-­‐Straße
 33,
 1180
 Wien,
 Austria.

10 CSchool
 of
 Science,
 Marist
 College,
 3399
 North
 Road,
 Poughkeepsie,
 New
 York,
 USA.

11 D
 Centro
 de
 Estudos
 em
 Biologia
 Subterrânea,
 Departamento
 de
 Biologia,
 Universidade
 Federal

12 de
 Lavras,
 Lavras,
 MG.
 CEP
 37200-­‐000,
 Brazil.

13 EColección
 Nacional
 de
 Arácnidos,
 Instituto
 de
 Biologia,
 UNAM,
 Apartado
 Postal
 70-­‐153,
 C.
 P.

14 04510,
 Mexico,
 D.
 F.,
 Mexico.

15 FDepartment
 of
 Terrestrial
 Zoology,
 Western
 Australian
 Museum,
 Locked
 Bag
 49,
 Welshpool
 DC,

16 WA

 6986,
 Australia.

17 GDipartimento
 di
 Scienze
 della
 Vita
 e
 Biologia
 dei
 Sistemi,
 Università
 di
 Torino,
 Via
 Accademia

18 Albertina
 13,
 10123
 Torino,
 Italy.

19 HDepartment
 of
 Zoology,
 Institute
 of
 Biology
 and
 Ecology,
 Faculty
 of
 Science,
 P.
 J.
 Šafárik

20 University,
 Moyzesova
 11,
 040
 01
 Košice,
 Slovakia.

21 IDepartment
 of
 Biology,
 Kilgore
 College,
 1100
 Broadway,
 Kilgore,
 TX
 75662,
 USA.

22 JSubBioLab,
 Department
 of
 Biology,
 Biotechnical
 Faculty,
 University
 of
 Ljubljana,
 Večna
 pot
 111,

23 SI-­‐1000
 Ljubljana,
 Slovenia.

24 KCorresponding
 author.
 Email:
 [email protected]

1
25 Abstract.
  Palpigradi
 are
 a
 poorly
 understood
 group
 of
 delicate
 arachnids,
 often
 found
 in

26 caves
 or
 other
 subterranean
 habitats.
 Concomitantly,
 they
 have
 been
 neglected
 from
 a

27 phylogenetic
 point
 of
 view.
 Here
 we
 present
 the
 first
 molecular
 phylogeny
 of
 palpigrades
 based

28 on
 specimens
 collected
 in
 different
 subterranean
 habitats,
 both
 endogean
 (soil)
 and
 hypogean

29 (caves),
 from
 Australia,
 Africa,
 Europe,
 South
 America
 and
 North
 America.
 Analyses
 of
 two

30 nuclear
 ribosomal
 genes
 and
 COI
 under
 an
 array
 of
 methods
 and
 homology
 schemes
 found

31 monophyly
 of
 Palpigradi,
 Eukoeneniidae,
 and
 a
 division
 of
 Eukoeneniidae
 into
 four
 main
 clades,

32 three
 of
 which
 include
 samples
 from
 multiple
 continents.
 This
 supports
 either
 ancient
 vicariance

33 or
 long-­‐range
 dispersal,
 two
 alternatives
 we
 cannot
 distinguish
 with
 the
 data
 at
 hand.
 In

34 addition,
 we
 show
 that
 our
 results
 are
 robust
 to
 homology
 scheme
 and
 analytical
 method,

35 encouraging
 further
 use
 of
 the
 markers
 employed
 in
 this
 study
 to
 continue
 drawing
 a
 broader

36 picture
 of
 palpigrade
 relationships.

37

38

39 Additional
 keywords:
 Arachnida,
 micro-­‐whip
 scorpions,
 palpigrades,
 speleobiology,

40 biogeography.

2
41 Introduction

42 The
 arachnid
 order
 Palpigradi
 (micro-­‐whip
 scorpions
 or
 palpigrades)
 is
 one
 of
 the
 smallest,

43 rarest
 and
 most
 neglected
 groups
 of
 terrestrial
 arthropods,
 and
 one
 of
 the
 last
 arachnid
 orders

44 to
 be
 discovered—it
 was
 first
 reported
 only
 in
 1885
 (Grassi
 and
 Calandruccio
 1885).

 The
 first

45 photographs
 of
 living
 palpigrades
 did
 not
 appear
 published
 until
 the
 first
 decade
 of
 the
 21st

46 century
 (Kováč
 et
 al.
 2002;
 Beccaloni
 2009).
 Additionally,
 only
 a
 handful
 of
 DNA
 sequence
 data

47 are
 available
 in
 GenBank;
 with
 only
 64
 sequences,
 56
 are
 for
 Prokoenenia
 wheeleri
 (Rucker,

48 1901),
 a
 species
 that
 was
 part
 of
 a
 multi-­‐gene
 phylogeny
 of
 arthropods
 (Regier
 et
 al.
 2010),

49 while
 the
 remaining
 eight
 sequences
 are
 unidentified
 specimens
 from
 three
 studies
 on

50 chelicerate
 phylogenetics
 (Giribet
 et
 al.
 2002;
 Pepato
 et
 al.
 2010;
 Arabi
 et
 al.
 2012).
 Contrary
 to

51 this,
 one
 can
 find
 more
 DNA
 sequences
 for
 other
 small
 arachnid
 orders
 in
 GenBank:
 105
 for

52 Uropygi,
 200
 for
 Schizomida,
 200
 for
 Ricinulei,
 251
 for
 Amblypygi,
 and
 502
 for
 Pseudoscorpiones,

53 [checked
 on
 October
 25th,
 2013].
 In
 addition,
 there
 are
 only
 2
 sequences
 available
 in
 the

54 Barcode
 of
 Life
 website
 (http://www.barcodinglife.org).

55 Palpigrades
 are
 delicate
 animals
 that
 walk
 sensing
 the
 substrate
 with
 what
 seems
 a
 nervous

56 behaviour
 of
 the
 first
 pair
 of
 walking
 legs,
 and
 use
 their
 unmodified
 palps
 for
 walking,
 unlike
 all

57 other
 arachnids
 (Fig.
 1).
 While
 moving,
 most
 palpigrades
 keep
 the
 flagellum
 upward,
 moving
 it

58 laterally.
 Accordingly,
 it
 is
 possible
 that
 the
 uplifted
 flagellum
 is
 associated
 with
 perception
 of

59 the
 environment
 (Ferreira
 and
 Souza
 2012).
 These
 small,
 depigmented
 and
 highly
 translucent

60 arachnids
 range
 in
 size
 from
 0.65
 mm
 in
 Eukoenenia
 grassii
 (Hansen,
 1901)
 to
 2.4
 mm
 in
 the

61 “giant”
 E.
 draco
 (Peyerimhoff,
 1906)
 from
 caves
 on
 the
 island
 of
 Majorca
 (Mayoral
 and
 Barranco

62 2013).
 Eukoenenia
 spelaea
 (Peyerimhoff,
 1902)
 from
 Slovakia
 has
 recently
 been
 reported
 to

63 feed
 on
 heterotrophic
 Cyanobacteria
 (Smrž
 et
 al.
 2013).
 The
 mode
 of
 sperm
 transfer
 in
 these

64 arachnids
 remains
 unknown.

65 The
 living
 members
 of
 the
 order
 are
 currently
 divided
 in
 two
 families,
 Eukoeneniidae

66 Petrunkevitch,
 1955,
 with
 4
 genera
 and
 85
 named
 species,
 and
 Prokoeneniidae
 Condé,
 1996,

67 with
 2
 genera
 and
 7
 named
 species
 (Harvey
 2002;
 Prendini
 2011;
 Souza
 and
 Ferreira
 2013).

68 Eukoeneniidae
 includes
 the
 genera
 Allokoenenia
 Silvestri,
 1913
 (1
 sp.
 from
 West
 Africa),

69 Eukoenenia
 Börner,
 1901
 (71
 spp.,
 on
 all
 continents
 under
 tropical
 and
 subtropical
 climate;
 in

70 temperate
 regions
 predominantly
 in
 caves),
 Koeneniodes
 Silvestri,
 1913
 (8
 Palaeotropical
 spp.)

71 and
 Leptokoenenia
 Condé,
 1965
 (5
 spp.
 in
 the
 Afrotropical,
 Neotropical
 and
 Palearctic
 regions).

3
72 Prokoeneniidae
 includes
 the
 genera
 Prokoenenia
 Börner,
 1901
 (6
 spp.
 in
 the
 Nearctic,

73 Neotropical
 and
 Oriental
 regions)
 and
 Triadokoenenia
 Condé,
 1991
 (1
 sp.
 from
 Madagascar).

74 Further
 unnamed
 new
 species
 are
 known
 to
 us
 from
 various
 parts
 of
 the
 world.

75 The
 position
 of
 Palpigradi
 among
 the
 arachnid
 orders
 remains
 highly
 debated.
 The
 largest
 set
 of

76 data
 analysed
 to
 date
 places
 them
 as
 the
 sister
 group
 to
 Acariformes
 mites
 in
 a
 basal
 position

77 within
 arachnids,
 although
 without
 support
 (Regier
 et
 al.
 2010).
 The
 most
 recent
 morphological

78 cladistic
 analysis
 of
 arachnid
 relationships
 leaves
 them
 mostly
 unresolved
 among
 the
 clades

79 Stomothecata,
 Haplocnemata,
 Pantetrapulmonata,
 and
 Acaromorpha
 (Shultz
 2007).
 Earlier

80 studies
 combining
 morphology
 and
 a
 small
 set
 of
 molecular
 data
 placed
 Palpigradi
 as
 the
 sister

81 group
 of
 Ricinulei
 +
 Tetrapulmonata
 or
 as
 sister
 to
 Pycnogonida
 when
 fossils
 were
 considered,

82 although
 again,
 without
 significant
 clade
 support
 (Giribet
 et
 al.
 2002);
 as
 sister
 to
 a
 clade

83 including
 Acari
 and
 Solifugae,
 based
 on
 the
 same
 two
 markers
 used
 in
 earlier
 studies
 (Pepato
 et

84 al.
 2010);
 or
 in
 an
 unresolved
 position
 within
 arachnids
 (Arabi
 et
 al.
 2012).
 Even
 less
 is
 known

85 about
 the
 internal
 relationships
 of
 the
 group,
 since
 no
 published
 study—molecular
 or

86 morphological—has
 yet
 incorporated
 information
 for
 more
 than
 one
 palpigrade
 species,
 and

87 only
 one
 unpublished
 masters
 thesis
 has
 explored
 palpigrade
 relationships
 cladistically,
 using

88 morphology
 (Montaño
 Moreno
 2008).

89 To
 bridge
 this
 important
 gap
 in
 the
 knowledge
 of
 this
 arachnid
 order,
 although
 acknowledging

90 the
 difficulties
 in
 sampling
 and
 identification
 of
 these
 elusive
 animals,
 we
 obtained
 samples
 for

91 as
 many
 species
 of
 palpigrades
 as
 possible
 and
 from
 as
 many
 localities
 as
 possible
 with
 the
 aim

92 to
 obtain
 molecular
 DNA
 sequence
 data
 to
 generate
 a
 first
 hypothesis
 of
 internal
 palpigrade

93 relationships.

94

95 Materials
 and
 Methods

96 Taxon
 sampling

97 Palpigrades
 are
 difficult
 to
 obtain
 and
 identify,
 and
 success
 of
 field
 sampling
 differed
 among

98 regions
 included
 in
 the
 study.
 In
 Western
 Australia,
 many
 samples
 were
 collected
 indirectly
 in

99 caves
 and
 bore
 holes.
 In
 Brazil
 and
 Europe,
 they
 can
 be
 abundant
 in
 caves,
 where
 fresh

100 specimens
 have
 recently
 become
 available
 for
 inclusion
 in
 molecular
 studies.
 Additional
 samples

4
101 were
 from
 soil
 samples
 in
 Australia,
 Italy
 and
 the
 USA.
 In
 addition
 to
 fresh
 material
 collected
 for

102 this
 study,
 older
 specimens
 were
 used,
 especially
 from
 the
 diverse
 cave
 systems
 in
 Brazil,
 where

103 several
 new
 species
 have
 been
 recently
 described
 (Souza
 and
 Ferreira
 2010;
 Ferreira
 et
 al.
 2011;

104 Souza
 and
 Ferreira
 2011a;
 Souza
 and
 Ferreira
 2011b;
 Souza
 and
 Ferreira
 2012a;
 Souza
 and

105 Ferreira
 2012b).
 While
 a
 recently
 collected
 specimen
 of
 Eukoenenia
 ferratilis
 Souza
 &
 Ferreira,

106 2011
 amplified
 well
 for
 some
 of
 the
 studied
 markers,
 none
 of
 the
 six
 specimens
 of
 Allokoenenia

107 spp.
 and
 the
 two
 specimens
 of
 Leptokoenenia
 sp.
 collected
 from
 the
 caves
 yielded
 workable

108 DNA.
 We
 also
 obtained
 a
 relatively
 large
 collection
 of
 specimens
 from
 the
 Western
 Australian

109 bore
 holes
 from
 Barrow
 Island
 and
 the
 Pilbara,
 but
 these
 were
 collected
 from
 litter
 traps
 and

110 many
 specimens
 did
 not
 amplify
 or
 only
 yielded
 some
 amplicons.
 Some
 of
 these
 specimens
 are

111 probably
 related
 to
 the
 Western
 Australian
 endemic
 E.
 guzikae
 Barranco
 &
 Harvey,
 2008,
 but

112 unrelated
 to
 the
 more
 widespread
 species
 E.
 mirabilis
 (Grassi
 &
 Calandruccio,
 1885),
 also
 found

113 in
 Western
 Australia
 (Harvey
 et
 al.
 2006;
 Barranco
 and
 Harvey
 2008).
 A
 single
 specimen
 of

114 Prokoenenia
 wheeleri
 was
 obtained
 from
 the
 Austin
 area
 (Texas,
 USA),
 but
 amplified
 well
 for
 all

115 fragments
 attempted.
 In
 addition,
 we
 obtained
 samples
 of
 Eukoenenia
 mirabilis
 from
 Italy

116 (Christian
 et
 al.
 2010)
 and
 Australia
 (Harvey
 et
 al.
 2006),
 E.
 spelaea
 (Peyerimhoff,
 1902)
 from

117 multiple
 localities
 in
 Slovenia
 and
 Slovakia
 (Kováč
 et
 al.
 2002;
 Zagmajster
 and
 Kováč
 2006;
 Král
 et

118 al.
 2008).
 Italian
 samples
 also
 include
 E.
 bonadonai
 Condé,
 1979
 and
 E.
 strinatii
 Condé,
 1977,

119 collected
 in
 caves.
 We
 also
 included
 specimens
 from
 multiple
 localities
 from
 the
 hanseni-­‐
120 chilanga
 group
 of
 Eukoenenia
 from
 Mexico
 and
 the
 USA
 (Montaño-­‐Moreno
 2012).
 Additional

121 specimens
 come
 from
 Mexican
 caves
 and
 South
 Africa.
 Details
 on
 collecting
 localities
 are

122 available
 in
 Table
 1
 and
 in
 MCZBASE
 (http://mczbase.mcz.harvard.edu/SpecimenSearch.cfm).

123 Vouchers
 or
 additional
 specimens
 are
 deposited
 in
 the
 Museum
 of
 Comparative
 Zoology,

124 Harvard
 University
 (MCZ),
 and
 in
 the
 Western
 Australian
 Museum
 (WAM).

125 We
 included
 three
 species
 available
 in
 GenBank,
 one
 from
 South
 Africa
 sequenced
 by

126 Giribet
 et
 al.
 (2002),
 one
 from
 Brazil
 from
 Pepato
 et
 al.
 (2010),
 and
 one
 of
 unknown
 origin

127 published
 by
 Arabi
 et
 al.
 (2012).
 Here
 we
 added
 sequences
 from
 an
 additional
 South
 African

128 specimen
 from
 the
 same
 collection
 of
 that
 from
 Giribet
 et
 al.
 (2002),
 and
 a
 specimen
 of
 E.

129 ferratilis
 from
 Brazil,
 which
 was
 identical
 to
 the
 specimen
 reported
 by
 Pepato
 et
 al.
 (2010)
 as

130 Eukoenenia
 sp.,
 and
 to
 which
 we
 refer
 to
 as
 E.
 cf.
 ferratilis
 in
 the
 present
 study.
 Outgroup
 taxa

131 were
 selected
 from
 GenBank
 (Table
 2),
 mostly
 from
 previous
 studies
 on
 arthropod
 or
 arachnid

132 phylogeny
 using
 nuclear
 ribosomal
 genes
 (Giribet
 et
 al.
 2002;
 Mallatt
 and
 Giribet
 2006).

5
133

134 Molecular
 methods

135 Although
 we
 attempted
 to
 amplify
 and
 sequence
 five
 molecular
 markers
 typically
 used
 in
 other

136 analyses
 of
 arachnid
 systematics
 (e.g.,
 Dimitrov
 et
 al.
 2012;
 Giribet
 et
 al.
 2012),
 the

137 mitochondrial
 16S
 rRNA
 gene
 only
 amplified
 for
 Prokoenenia
 wheeleri
 and
 the
 nuclear
 protein-­‐
138 encoding
 gene
 histone
 H3,
 although
 amplified
 for
 several
 samples,
 did
 not
 produce
 clean
 reads.

139 We
 thus
 restricted
 our
 study
 to
 the
 two
 broadly
 available
 nuclear
 ribosomal
 genes,
 the

140 complete
 18S
 rRNA
 and
 ca.
 2.2
 Kb
 of
 28S
 rRNA,
 and
 the
 mitochondrial
 protein-­‐encoding

141 cytochrome
 c
 oxidase
 subunit
 I
 (COI
 hereafter)
 (as
 in
 Murienne
 et
 al.
 2008),
 although
 the
 latter

142 gene
 only
 amplified
 for
 about
 a
 third
 of
 the
 specimens
 (Table
 1).
 For
 two
 of
 the
 bore-­‐hole

143 Western
 Australian
 specimens,
 poorly
 preserved,
 only
 the
 middle
 amplicon
 of
 28S
 rRNA
 worked.

144 Total
 DNA
 was
 extracted
 from
 whole
 specimens
 or
 from
 the
 opisthosomal
 region
 using

145 Qiagen’s
 DNEasy®
 tissue
 kit
 (Valencia,
 CA,
 USA).
 Although
 we
 were
 aiming
 to
 preserve
 the

146 digested
 carcass
 as
 a
 morphological
 voucher,
 it
 was
 completely
 digested
 and
 not
 recoverable.

147 Purified
 genomic
 DNA
 was
 used
 as
 a
 template
 for
 Polymerase
 chain
 reactions
 (PCR)

148 amplification.
 PCR,
 visualization
 by
 agarose
 gel
 electrophoresis,
 and
 direct
 sequencing
 were

149 conducted
 for
 most
 specimens
 as
 described
 in
 earlier
 work,
 e.g.,
 Edgecombe
 and
 Giribet
 (2009).

150 Chromatograms
 obtained
 from
 the
 automatic
 sequencer
 were
 read
 and
 sequences
 assembled

151 using
 the
 sequence
 editing
 software
 Sequencher™
 (Gene
 Codes
 Corporation,
 Ann
 Arbor,
 MI,

152 USA).
 Sequence
 data
 were
 edited
 in
 MacGDE
 (Linton
 2005).
 The
 three
 genes
 were
 analysed
 as

153 follows:

154 18S
 rRNA:
 This
 marker
 was
 amplified
 in
 three
 amplicons
 (a,
 b,
 c),
 as
 in
 previous
 studies

155 (Edgecombe
 and
 Giribet
 2009;
 Giribet
 et
 al.
 2010;
 Giribet
 et
 al.
 2012).
 In
 the
 present
 study
 we

156 include
 27
 palpigrade
 specimens
 plus
 8
 outgroups,
 for
 a
 total
 of
 1760-­‐1771
 bp
 per
 complete

157 sequence
 (up
 to
 1805
 bp
 for
 one
 of
 the
 outgroups).
 From
 the
 27
 palpigrade
 sequences
 all
 but

158 three
 were
 complete;
 E.
 spelaea
 is
 missing
 fragment
 a
 and
 the
 sample
 of
 Eukoenenia
 from
 South

159 Africa
 (DNA100456.2)
 is
 missing
 fragment
 b.
 For
 the
 direct
 optimization
 analyses
 the
 three

160 amplicons
 were
 treated
 as
 a
 single
 input
 file,
 containing
 23
 sequences,
 and
 divided
 into
 six

161 fragments.
 The
 three
 amplicons
 were
 concatenated
 for
 the
 static
 alignment
 analyses.

6
162 28S
 rRNA:
 This
 nuclear
 gene
 was
 amplified
 in
 three
 amplicons
 (a,
 b,
 c),
 as
 described
 in

163 Giribet
 and
 Shear
 (2010).
 The
 data
 set
 includes
 29
 palpigrade
 specimens
 plus
 8
 outgroups,
 for
 a

164 total
 of
 2,150
 to
 2,204
 bp,
 with
 some
 length
 variation
 among
 species.
 These
 three
 fragments

165 correspond
 to
 primer
 pairs
 28S
 rd1a—28D
 rd4b,
 28Sa—28S
 rd5b,
 and
 28S
 rd4.8a—28S
 rd7b1.

166 Some
 of
 the
 published
 sequences
 were
 amplified
 with
 a
 shorter
 fragment
 b,
 generated
 with

167 primers
 28Sa—28Sb
 (Whiting
 et
 al.
 1997),
 and
 therefore
 fragment
 b
 was
 divided
 into
 fragments

168 b1
 and
 b2
 to
 accommodate
 these
 two
 amplicons.
 Fragment
 a
 was
 available
 for
 22
 palpigrades

169 and
 divided
 into
 three
 fragments,
 fragment
 b
 for
 29
 palpigrades
 and
 three
 fragments,
 and

170 fragment
 c
 for
 25
 palpigrades
 and
 analysed
 as
 a
 single
 fragment.
 These
 were
 treated
 as
 three

171 different
 amplicons
 for
 the
 dynamic
 homology
 analyses,
 but
 aligned
 together
 for
 the
 static

172 homology
 approaches.

173 COI:
 This
 widely
 used
 mitochondrial
 marker
 amplified
 for
 ten
 palpigrade
 terminals
 in
 a

174 single
 amplicon
 using
 primers
 LCO—HCO,
 showing
 no
 length
 variation
 (654
 bp
 analysed),
 plus

175 one
 was
 available
 in
 GenBank.
 COI
 did
 not
 amplify
 for
 many
 individuals,
 perhaps
 due
 to
 major

176 changes
 in
 this
 marker,
 as
 evidenced
 by
 the
 deletion
 of
 one
 amino
 acid
 with
 respect
 to
 the

177 outgroups.
 Five
 outgroup
 sequences
 were
 obtained
 from
 GenBank,
 but
 these
 were
 3
 bp
 longer

178 in
 all
 cases
 except
 for
 the
 pseudoscorpion.
 It
 was
 analysed
 as
 a
 single
 fragment;
 not
 pre-­‐aligned

179 due
 to
 the
 length
 difference
 with
 some
 outgroups.

180

181 Phylogenetic
 analyses

182 Parsimony
 analyses
 were
 based
 on
 a
 direct
 optimization
 (DO)
 approach
 (Wheeler
 1996)
 using

183 POY
 v.
 5.0
 (Varón
 et
 al.
 2012).
 Tree
 searches
 were
 performed
 using
 the
 timed
 search
 function
 in

184 POY,
 i.e.,
 multiple
 cycles
 of
 (a)
 building
 Wagner
 trees,
 (b)
 subtree
 pruning
 and
 regrafting
 (SPR),

185 and
 (c)
 tree
 bisection
 and
 reconnection
 (TBR),
 (d)
 ratcheting
 (Nixon
 1999),
 and
 (e)
 tree-­‐fusing

186 (Goloboff
 1999,
 2002)
 [command:

search (max_time:00:01:00, min_time:00:00:10,
187 ].
 For
 the
 individual
 partitions,
 timed
 searches
 of
 1
 hour
 were
 run
 on

hits:20, memory:gb:2)
188 4
 processors
 under
 six
 parameter
 sets,
 as
 in
 Giribet
 et
 al.
 (2012)
 (see
 Table
 3).
 For
 the
 combined

189 analysis
 of
 the
 three
 markers
 we
 started
 with
 the
 same
 search
 strategy,
 giving
 the
 28S
 rRNA

190 trees
 as
 input—as
 these
 contained
 all
 the
 taxa
 in
 the
 combined
 data
 set—,
 and
 the
 resulting

191 trees
 were
 given
 as
 input
 for
 a
 second
 round
 of
 analyses
 (sensitivity
 analysis
 tree
 fusing;
 SATF),

7
192 as
 described
 by
 Giribet
 (2007),
 and
 continued
 until
 the
 tree
 lengths
 stabilised
 (Giribet
 et
 al.

193 2012).
 The
 optimal
 parameter
 set
 was
 estimated
 using
 the
 modified
  ILD
 metrics
 (Wheeler

W
194 1995;
 Sharma
 et
 al.
 2011),
 as
 a
 proxy
 for
 the
 parameter
 set
 that
 minimizes
 overall
 incongruence

195 among
 data
 partitions
 (Table
 4).

 Nodal
 support
 for
 the
 optimal
 parameter
 set
 was
 estimated
 via

196 jackknifing
 (250
 replicates)
 with
 a
 probability
 of
 deletion
 of
 e-­‐1
 (Farris
 et
 al.
 1996)
 using

197 ,
 as
 discussed
 in
 earlier
 work
 (Giribet
 et
 al.
 2012).

auto_sequence_partition
198
  Maximum
 likelihood
 (ML)
 analyses
 were
 conducted
 on
 static
 multiple
 sequence

199 alignments
 (MSA)
 inferred
 in
 MUSCLE
 v.
 3.6
 (Edgar
 2004)
 through
 the
 EMBL-­‐EBI
 server

200 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/).
 We
 also
 used
 an
 implied
 alignment
 (IA)
 generated

201 in
 POY
 (Wheeler
 2003;
 Giribet
 2005)
 for
 subsequent
 analyses
 based
 on
 static
 alignments,
 as

202 recently
 explored
 by
 Giribet
 and
 Edgecombe
 (2013b)
 for
 a
 centipede
 data
 set.
 The
 MUSCLE

203 alignments
 were
 conducted
 for
 each
 gene
 independently.
 The
 IA
 and
 MSA
 therefore
 were
 based

204 on
 the
 same
 data
 (see
 length
 for
 each
 gene
 in
 Table
 5).
 In
 order
 to
 evaluate
 the
 impact
 of
 the

205 hypervariable
 regions
 in
 the
 data
 set,
 MSAs
 and
 IAs
 were
 subsequently
 trimmed
 with
 Gblocks
 v.

206 0.91b
 (Castresana
 2000;
 Talavera
 and
 Castresana
 2007)
 to
 cull
 positions
 of
 ambiguous
 homology

207 (see
 length
 for
 each
 trimmed
 gene
 in
 Table
 5).
 In
 the
 case
 of
 28S,
 fragments
 a
 and
 bc
 were

208 Gblocked
 separately,
 due
 to
 the
 larger
 proportion
 of
 missing
 data
 in
 the
 a
 fragment,
 which

209 otherwise
 would
 be
 deleted
 from
 the
 final
 28S
 alignment.
 These
 data
 sets
 are
 thus
 based
 on

210 different
 data
 from
 their
 original
 sources
 and
 from
 each
 other,
 but
 the
 remaining
 data
 use
 the

211 same
 homology
 scheme
 as
 the
 source.
 Data
 sets
 were
 concatenated
 with
 SequenceMatrix

212 (Vaidya
 et
 al.
 2011).

213
  Maximum
 likelihood
 analyses
 were
 conducted
 using
 RAxML
 ver.
 7.2.7
 (Stamatakis
 et
 al.

214 2008b)
 in
 the
 CIPRES
 server
 (Miller
 et
 al.
 2010).
 For
 the
 searches,
 a
 unique
 General
 Time

215 Reversible
 (GTR)
 model
 of
 sequence
 evolution
 with
 corrections
 for
 a
 discrete
 gamma

216 distribution
 (GTR
 +
 Γ)
 was
 specified
 for
 each
 data
 partition,
 and
 100
 independent
 searches
 were

217 conducted.
 Nodal
 support
 was
 estimated
 via
 the
 rapid
 bootstrap
 algorithm
 (1000
 replicates)

218 using
 the
 GTR-­‐CAT
 model
 (Stamatakis
 et
 al.
 2008a).
 Bootstrap
 resampling
 frequencies
 were

219 thereafter
 mapped
 onto
 the
 optimal
 tree
 from
 the
 independent
 searches.

220 In
 total
 we
 analysed
 five
 data
 sets
 accounting
 for
 different
 optimality
 criteria,
 homology

221 schemes,
 and/or
 amount
 of
 data,
 as
 follows:

8
222 (cid:1) Analysis
 1.
 Direct
 optimization/dynamic
 homology
 under
 parsimony
 (full
 sensitivity

223 analysis
 of
 6
 parameter
 sets)
 analysed
 in
 POY

224 (cid:1) Analysis
 2.
 Static
 homology
 from
 the
 implied
 alignment
 for
 the
 optimal
 parameter

225 set
 under
 ML
 (analysed
 in
 RAxML)

226 (cid:1) Analysis
 3.
 Static
 homology
 from
 the
 implied
 alignment
 for
 the
 optimal
 parameter

227 set
 trimmed
 with
 Gblocks
 under
 ML
 (analysed
 in
 RAxML)

228 (cid:1) Analysis
 4.
 Static
 homology
 based
 on
 MUSCLE
 multiple
 sequence
 alignment

229 (analysed
 in
 RAxML)

230 (cid:1) Analysis
 5.
 Static
 homology
 based
 on
 MUSCLE/Gblocks
 (analysed
 in
 RAxML)

231

232 Results
 and
 Discussion

233 All
 phylogenetic
 analyses
 yielded
 very
 similar
 results
 with
 respect
 to
 the
 ingroup
 relationships,

234 while
 the
 outgroup
 relationships
 were
 incongruent
 from
 analysis
 to
 analysis
 and
 unsupported

235 for
 the
 most
 part
 (Figs.
 2
 and
 3).
 The
 latter
 was
 expected
 given
 the
 small
 amount
 of
 data
 and

236 outgroup
 taxa
 and
 the
 poor
 resolution
 in
 deep
 arachnid
 relationships
 in
 other
 studies
 (e.g.,

237 Wheeler
 and
 Hayashi
 1998;
 Giribet
 et
 al.
 2002;
 Pepato
 et
 al.
 2010;
 Regier
 et
 al.
 2010).
 The

238 optimal
 parameter
 set
 under
 parsimony
 direct
 optimization
 was
 3211
 (where
 indel
 opening

239 costs
 3,
 indel
 extension
 1,
 transversions
 cost
 2
 and
 transitions
 cost
 1;
  ILD
 =
 0.00913),
 with
 a

W
240 cost
 of
 10,408
 weighted
 steps
 (Fig.
 2).
 Nearly
 all
 examined
 parameter
 sets
 concurred
 on
 the

241 topology
 of
 the
 optimal
 parameter
 set,
 with
 the
 exception
 of
 Eukoenenia
 spelaea
 IZ-­‐19346
 from

242 Slovenia,
 and
 the
 resolution
 of
 one
 of
 the
 Eukoenenia
 clades
 (see
 below).
 Likewise,
 the
 analyses

243 of
 the
 four
 data
 sets
 analysed
 under
 maximum
 likelihood
 were
 nearly
 identical,
 except
 for
 some

244 of
 the
 shallowest
 relationships.
 One
 of
 these
 trees,
 the
 one
 for
 the
 multiple
 sequence
 alignment

245 trimmed
 with
 Gblocks—the
 one
 that
 could
 be
 potentially
 the
 most
 different
 from
 the
 POY

246 analysis—is
 presented
 in
 Fig.
 3,
 and
 it
 is
 virtually
 identical
 to
 the
 direct
 optimization
 tree.
 From

247 the
 10
 nodes
 depicted
 in
 Fig.
 2
 summarizing
 the
 six
 direct
 optimization
 and
 the
 four
 maximum

248 likelihood
 analyses,
 5
 were
 recovered
 in
 all
 analyses.
 Support
 values
 for
 these
 five
 nodes
 is
 high

249 for
 most
 analyses
 (jackknife
 values
 are
 lower
 by
 definition),
 with
 the
 exception
 of
 clades
 III
 and

250 IV
 in
 the
 DO
 analysis.
 Basically,
 nearly
 all
 analyses
 concur
 on
 the
 overall
 topology
 of
 the

251 palpigrade
 tree.

9