tc süleyman demirel üniversitesi fen bilimleri enstitüsü makrolid kalıntılarının sütte analizi için sıvı kr

160 Pages·2009·2.03 MB·Turkish

by  Nurullah Þanlý

T.C.
SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

MAKROLİD KALINTILARININ SÜTTE ANALİZİ İÇİN SIVI
KROMATOGRAFİK YÖNTEMİN OPTİMİZASYONU

Senem ŞANLI

Danışman: Prof. Dr. Güleren ALSANCAK

II. Danışman: Doç. Dr. Zeynep SEYDİM

DOKTORA TEZİ
KİMYA ANABİLİM DALI
ISPARTA – 2009
İÇİNDEKİLER

Sayfa
İÇİNDEKİLER …………………………………………………………………….....i
ÖZET…………………………………………………………………………............v
ABSTRACT……………………………………………………………………........vi
TEŞEKKÜR………………………………………………………………………...vii
ŞEKİLLER DİZİNİ ………………………………………………………………..viii
ÇİZELGELER DİZİNİ …………………………………………………………....xv
KISALTMALAR .............…………………...…………………...…..............……xvii
1. GİRİŞ........……………………………...……………………….…...….................1
1.1. Makrolid Grubu Antibakteriyel İlaçlar…………………………….………....….2
1.2. Makrolidlerin Kimyasal Yapıları……………......…...……………………....…..3
1.3. Etki Mekanizmaları ve Direnç…………………………………………………...5
1.4. Farmakokinetik Özellikleri……………..………………………………………..5
1.5. Klinik Kullanımı…………………………………………………………………8
1.6. Yan Etkileri…………………...………………………………………………….8
1.7. İlaç Etkileşimleri………………...……………………………………………….8
1.8. Sütte Antibiyotik Kalıntılarının Tayini………………………...………………...9
1.9. Antibiyotik Kalıntısı İçeren Sütlerin Meydana Getirdiği Sorunlar……………..10
1.10. Makrolid Grubu Antibakteriyel İlaçların İyonlaşma Sabitleri………………...11
1.10.1. Su-Organik Çözücü İkili Karışımlarında İyonlaşma Sabitlerinin Tayininin
Önemi………………………………………………………………………..11
1.10.2. Spektroskopik Yöntemler ile İyonlaşma Sabiti Tayini ……………………..12
1.11. Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi……………………………………14
1.11.1. Sıvı Kromatografi Cihazları…………………………………………………16
1.11.2. Hareketli Faz Hazneleri ve Çözücü Sistemleri……………………………...17
1.11.3. Pompa……………………………………………………………………….18
1.11.3.1. Pistonlu Pompalar…………………………………………………………18
1.11.3.2. Şırınga Pompalar…………………………………………………………..19
1.11.3.3. Pnömatik Pompalar...……………………………………………………...19
1.11.4. Enjektör……………………………………………………………………...19
1.11.4.1. Manüel Enjeksiyon Valfleri……………………………………………….19
i
1.11.4.2. Otomatik Enjektör…………………………………………………………20
1.11.5. Kolon………………………………………………………………………...20
1.11.6. Dedektörler………………………………………………………………….24
1.11.6.1. Ultraviyole-Görünür Bölge Dedektörü……………………………………25
1.11.7. Kaydedici……………………………………………………………………27
1.11.8. Kromatografide Temel Parametreler………………………………………..27
1.11.8.1. Alıkonma Zamanı ve Kapasite Faktörü…………………………………...28
1.11.8.2. Seçicilik, α………………………………………………………………...29
1.11.8.3. Teorik Tabaka Sayısı (N)………………………………………………….29
1.11.8.4. Ayırma Gücü, R …………………………………………………………..30
s
1.11.9. Ters Faz Sıvı Kromatografide pH ve Seçicilik……………………………...32
1.11.10. İyonlaşma ve pH…………………………………………………………...32
1.11.11. Mobil Faz ve pH…………………………………………………………..33
1.11.12. Sıvı Kromatografide Mobil Faz Optimizasyonu…………………………...36
1.11.13. Mobil Fazda pH Standardizasyonu………………………………………..41
1.12. Analitik Yöntemin Validasyonu (Yöntem Geçerlik Testleri)…………………43
1.12.1. Validasyonun Genel İşlemleri……………………………………………….43
1.12.2. Tipik Validasyon Karakteristikleri………………………………………….44
1.12.2.1. Doğruluk (Geri Kazanım)…………………………………………………44
1.12.2.2. Referans Standart İle Karşılaştırmak……………………………………...44
1.12.2.3. Kör Matriks Ortamına Analizi Yapılan Maddeyi İlave Etmek……………45
1.12.2.4. Standart Ekleme Yöntemi İle Saf Madde İlavesi………………………….45
1.12.3. Kesinlik……………………………………………………………………...46
1.12.4. Tekrarlanabilirlik……………………………………………………………46
1.12.5. Orta-Kesinlik………………………………………………………………...46
1.12.6. Tekrar Elde Edilebilirlik…………………………………………………….47
1.12.7. Seçicilik……………………………………………………………………...47
1.12.8. Teşhis Sınırı, Gözlenebilirlik Sınırı (TS, LOD)……………………………..49
1.12.9. Tayin Alt Sınırı (TAS, LOQ)………………………………………………..49
1.12.10. Doğrusallık ………………………………………………………………...51
1.12.11. Kalibrasyon Doğrusu (Grafiği)…………………………………………….51
1.12.12. Çalışma Aralığı…………………………………………………………….52
ii
1.12.13. Kararlılık…………………………………………………………………...52
1.12.14. Tutarlılık…………………………………………………………………...52
2. KAYNAK ÖZETLERİ…………………………………………………………...53
2.1. Makrolidlerin İyonlaşma Sabitleri ve Oktanol – Su Dağılma Katsayıları..…….53
2.2. Makrolidlerin Sıvı Kromatografik Yöntemle Analizi…………………….….....54
3. MATERYAL VE YÖNTEM……………………………………………………..66
3.1. Genel Bilgi……………………………………………………………………...66
3.2. Kullanılan Cihazlar……………………………………………………………..66
3.2.1. Yüksek Performans Sıvı Kromatografisi Cihazı……………………………...66
3.2.2. pH / İyon Metre………………………………………………………………66
3.2.3. UV Spektrofotometresi……………………………………………………….67
3.3. Kullanılan Kimyasal Maddeler…………………………………………………67
3.4. Kullanılan Çözeltiler……………………………………………………………69
3.4.1. Spektroskopik Titrasyonlar…………………………………………………...69
3.4.1.1. %40 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı…………………………….……...69
3.4.1.2. %30 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı…………………………….……...69
3.4.1.3. İyonik Şiddet Ayarlayıcı…………………….……………………………...69
3.4.1.4. Asit Çözeltisi………………………………………………………………..69
3.4.1.5. Baz Çözeltisi………………………………………………………………..69
3.4.1.6. Potasyum Asit Fitalat Çözeltisi……………………………………………..70
3.4.1.7. Makrolid Çözeltileri………………………………………………………...70
3.4.2. Kromatografik Çalışmalar…………………………………………………....70
3.4.2.1. Makrolidlerin HPLC İle Ayırımında Kullanılan Çözeltileri………………..70
3.4.2.2. %26,6 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı………………………………….70
3.4.2.3. %30 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı…….……………………………...71
3.4.2.4. %32,5 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı………………………………….71
3.4.2.5. %35 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı……………………………………71
3.4.2.6. %37,5 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı………………………………….71
3.4.2.7. %40 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı……………………………………72
3.4.2.8. %43,41 (v/v) Asetonitril -Su İkili Karışımı………………………………...72
3.4.2.9. Potasyum Bromür Çözeltisi………………………………………………...72
3.4.2.10. Potasyum Hidrojen Fitalat Çözeltisi………………………………………72
iii
3.4.2.11. Süt Numunesinin Hazırlık Aşamasında Kullanılan Çözeltiler……………73
3.5. Yöntem………………………………………………………………………….73
3.5.1. Spektroskopik Titrasyonlar…………………………………………………...73
3.5.2. Sıvı Kromatografik Ayırmanın Optimizasyonu………………………………74
4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA………………………………….76
4.1. Makrolidlerin SPARC Programı ile Hesaplanan İyonlaşma Sabitleri……….....76
4.1.1. Eritromisinin İyonlaşma Sabiti……………………………………………….76
4.1.2. Roksitromisinin İyonlaşma Sabiti…………………………………………….76
4.1.3. Azitromisinin İyonlaşma Sabiti………………………………………………77
4.1.4. Tilmikosinin İyonlaşma Sabiti………………………………………………..78
4.1.5. Oleandomisinin İyonlaşma Sabiti…………………………………………….78
4.1.6. Spiramisinin İyonlaşma Sabiti………………………………………………..79
4.1.7. Josamisinin İyonlaşma Sabiti…………………………………………………80
4.1.8. Tylosinin İyonlaşma Sabiti…………………………………………………...80
4.2. Makrolidlerin Spektroskopik Yöntemle İyonlaşma Sabitlerinin Tayini………..81
4.2.1. % 40 ACN-su (v/v) Karışımında Titrasyonlar………………………………..81
4.2.2. % 30 ACN-su (v/v) Karışımında Titrasyonlar………………………………..91
4.3. Sıvı Kromatografi Yöntemi…………………………………………………….99
4.3.1. Kromatografik Ayırmanın Optimizasyonu…….……………………………..99
4.3.2. Sağlamlık (Robustness) Testleri…………………………………………….103
5. SONUÇ…………………………………………………………………………124
5.1. Makrolidlerin pKDeğerlerinin Spektroskopik Yöntemle Tayini……………..124

5.2. Makrolidlerin Sıvı Kromatografik Yöntemle Ayrılması……………………...125
5.3. Robutnus Testleri ve Yüzey Yanıt Metodu…………………………………...130
6. KAYNAKLAR………………………………………………………………….134
ÖZGEÇMİŞ………………………………………………………………………..141
iv
ÖZET

Doktora Tezi

MAKROLİD KALINTILARININ SÜTTE ANALİZİ İÇİN SIVI
KROMATOGRAFİK YÖNTEMİN OPTİMİZASYONU

Senem ŞANLI

Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Kimya Anabilim Dalı

Jüri: Prof. Dr. Güleren Alsancak (Danışman)
Prof. Dr. Mustafa Cengiz
Prof. Dr. A. Sibel Özkan
Doç. Dr. Zeynep Banu Seydim
Doç. Dr. Fatma Karipcin
Doç. Dr. Atıf Can Seydim
Yrd. Doç. Dr. Yüksel Altun

Makrolid antibiyotikler yapılarında lakton halkası bulunduran lipofilik moleküllerdir.
Veteriner hekimlikte mikrobiyal enfeksiyonları önlemeleri yanı sıra hayvansal
gıdalara hayvan gelişimini sağlamak için kullanılan bileşiklerdir. Avrupa Birliği
veteriner hekimlikte kullanılan makrolidlerin maksimum kalıntı sınırlarını(MRLs)
düzenleyen yönetmelikte hazırlamıştır. Bu nedenle sütte tayinleri ile ilgili
kromatografik çalışmalar son yıllarda önem kazanmıştır.

Ancak literatür kaynakları ve yapılan tezler incelendiğinde makrolidlerin sıvı
kromatografik ayırmalarının optimizasyonu ve optimum şartların süt numunesine
uygulanmasında yeterince çalışma olmadığı anlaşılmıştır.

Yapılan bu çalışma ile seçilen makrolid türü bileşiklerden tylosin, roksitromisin,
eritromisin, tilmikosin, josamisinin sıvı kromatografik yöntemle tayini için metot
optimizasyonu yapılmıştır. Sağlamlık çalışmaları yapılmıştır. Sütte tylosinin analizi
için metot geliştirilmiştir.

Anahtar Kelimeler: Makrolidler, HPLC, Sağlamlılık Testleri, pK.

2009, 143 sayfa

v
ABSTRACT

Ph.D. Thesis

THE OPTIMIZATION OF LC METHOD FOR THE ANALYSES OF SOME
MACROLİDE RESİDUES İN MİLK

Senem ŞANLI

Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences
Department of Chemistry
Thesis Committee: Prof. Dr. Güleren Alsancak (Supervisor)
Prof. Dr. Mustafa Cengiz
Prof. Dr. A. Sibel Özkan
Assoc. Prof. Zeynep Banu Seydim
Assoc. Prof. Fatma Karipcin
Assoc. Prof. Atıf Can Seydim
Asst. Prof. Yüksel Altun

Macrolide antibiotics are lipophilic molecules with a central 12–16 carbon atom
lactone ring to which several amino and/or neutral sugars are bound. They are widely
used in human and veterinary medicine to prevent and treat microbial infections.
Some macrolides are permanently used as feed additives to promote animal growth.
The European Union has established regulations for most of the drugs used in
veterinary medicine, including macrolide antibiotics and has set out maximum
residues levels (MRLs) for them.
But there is no enough study about macrolide for method optimization and
determination in milk sample.
In this study the method optimization and robustness study by HPLC for tylosini
roxithromycin, erythromycin, tilmicosin and josamycin were performed.
Determination of tylosin in milk was also studied.
Key Words: Macrolides, HPLC, Robustness study, pK.
2009, 143 pages
vi
TEŞEKKÜR

Bu tez için çalışmalarımı yönlendiren, akademik çalışmalarımda ve hayatımın her
aşamasında maddi-manevi destek olan, emeklerini esirgemeyen, değerli Danışman
Hocam sayın Prof. Dr. Güleren ALSANCAK’a teşekkürlerimi sunarım. Tezimde
desteğini esirgemeyen eş danışmanım sayın Doç. Dr. Zeynep Seydim’e; Tez İzleme
Komitemdeki hocalarım sayın Doç. Dr. Fatma Karipcin ve sayın Yrd. Doç. Dr.
Yüksel Altun’a; Bölüm Başkanımız sayın Prof. Dr. Mustafa Cengiz’e şükranlarımı
sunarım.

1447-D-06 No`lu Doktora Tez Projesi ile çalışmamı maddi olarak destekleyen
Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi’ne
teşekkür ederim.

Tezimde ve hayatımda bana sonuna kadar destek olan hayat arkadaşım Nurullah’a;
yoğun akademik çalışmalarımı sabırla izleyen oğlum Furkan’a ve beni bugünlere
getiren anne ve babama teşekkür etmeyi borç bilirim.

Senem ŞANLI
ISPARTA, 2009

vii
ŞEKİLLER DİZİNİ
Şekil 1.1. Eritromisinin kimyasal yapısı…………………………………….………..4
Şekil 1.2. Spektroskopik bir çalışmada log absorbans farkı - pH grafikleri (A’:
moleküler türün absorbansı; A’’: iyonik türün absorbansı)……..…...……12
Şekil 1.3. Sıvı-sıvı dağılım (partisyon) kromatografisinde çözünmüş maddenin
ayırımı…………………………………………………………………...….14
Şekil 1.4. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi cihazının şematik görünüşü (Perkin-
Elmer Corporation, Norwalk, CT)……………………………………..........16
Şekil 1.5. HPLC için bir pistonlu pompa…………………………………...………....18
Şekil 1.6. Rheodyne 7125 model enjeksiyon valfi ……………………………………20
Şekil 1.7. Bağlı faz dolgu maddelerinin elde edilmesi. a) Yüzey silanolünün
klorodimetilsilanla reaksiyonu, b) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel
klorosilanla reaksiyonu, c) Yüzey silanollerinin trifonksiyonel
alkoksisilanla reaksiyonu…………………………………………….........22
Şekil 1.8. HPLC’ de kullanılan bir UV dedektörü…………………………………..25
Şekil 1.9. Dedektörlerin % kullanımları……………………………………………....27
Şekil 1.10. Sıvı kromatografide bir kromatogram…………………………………….28
Şekil 1.11. Ayırma gücü (Rs) değerinin piklerin birbirinden ayrılmasına etkisi…....31
Şekil 1.12. Mobil faz pH’ sı ile asidik, bazik ve zwitter türlerin alıkonma
faktörlerinin değişimi…………………………………………………...…34
Şekil 1.13. Asetat tamponunun çeşitli derişimlerdeki tampon kapasitesi ………...35
Şekil 1.14. Metanol-su ikili karışımlarında çeşitli tamponların pK değerleri: ∆ fosfat
(sulu pH 2 ve 7), ◊ format, (cid:0) asetat, × amonyum tamponları………...…...36
Şekil 1.15. Asetonitril-su ikili karışımlarında çeşitli tamponların pK değerleri: (cid:0)■
fosfat (sulu pH 2 ve 7), ◊♦asetat (sulu pH 4 ve 5), ∆▲ borat, ×
hidrojenkarbonat tamponları…………………………...……………….....36
Şekil 1.16. ET-30 molekülü; a) temel halde b) uyarılmış formda……………….…38
Şekil 1.17 . Teşhis sınırının hesaplanmasında kullanılan sinyal/gürültü oranı şekli..49
Şekil 1.18. Tayin alt sınırı hesaplanmasında kullanılan sinyal/gürültü oranı şekli…50
Şekil 1.19. Kalibrasyon doğrusu (grafiği) ve eşitliği……………………………….51
Şekil 2.1. Tylosin tartaratın titrasyon eğrisi………………………………………...54
viii
Şekil 2.2. Makrolid standartlarının karışımı. Pikler: 1, Spiramisin; 2, Tilmikosin; 3,
Oleandomisin, 4, Eritromisin; 5, Tylosin; 6, Kitasamisin; 7, Josamisin….58
Şekil 2.3. 210, 231, 254 ve 287 nm de makrolidlerin standart karışımları. Pikler; 1,
Oleandomisin; 2, Eritromisin; 3, Roksitromisin; 4, Spiramisin; 5,
Josamisin; 6, İvermektin; 7, Tylosin………………………………………63
Şekil 2.4. Her bir makrolidden 200µg/kg katkılı böbrek ekstraktının LC–DAD
kromatogramları 210 (a), 231 (b) ve 287 nm (c). Pikler (1), spiramisin; (2),
tilmikosin; (3), eritromisin; (4), tylosin; (5), roksitromisin; (6),
troleandomisin ve (7), josamisin…………………...……………………...64
Şekil 4.1. Protonlanmış eritromisinin iyonlaşma şeması (SPARC)…………………76
Şekil 4.2. Protonlanmış roksitromisinin iyonlaşma şeması (SPARC)…………...….77
Şekil 4.3. Protonlanmış azitromisinin iyonlaşma şemaları (SPARC)……………….77
Şekil 4.4. Protonlamış tilmikosinin iyonlaşma şemaları (SPARC)………………..78
Şekil 4.5. Protonlanmış oleandomisinin iyonlaşma şeması (SPARC)……………...79
Şekil 4.6. Protonlanmış spiramisinin iyonlaşma şeması (SPARC)………………….79
Şekil 4.7. Protonlanmış josamisinin iyonlaşma şeması (SPARC)…………………..80
Şekil 4.8. Protonlanmış tylosinin iyonlaşma şeması (SPARC)……………………..80
Şekil 4.9. % 40 ACN-su ortamında HCl-KOH titrasyonu için çizilen pH-mV
grafiği……………………………………………………………………...81
Şekil 4.10. % 40 ACN-su (v/v) ortamında eritromisin için çizilen pH-log I
grafiği…………………………………………………………...…………83
Şekil 4.11. % 40 ACN-su (v/v) ortamında eritromisin için elde edilen STAR
grafiği...........................................................................................................83
Şekil 4.12. % 40 ACN-su (v/v) ortamında roksitromisin için çizilen pH-log I
grafiği………………………………………………………………...……84
Şekil 4.13. % 40 ACN-su (v/v) ortamında roksitromisin için elde edilen STAR
grafiği...........................................................................................................84
Şekil 4.14. % 40 ACN-su (v/v) ortamında azitromisin için çizilen pH-log I grafiği..85
Şekil 4.15. % 40 ACN-su (v/v) ortamında azitromisin için elde edilen STAR
grafiği……………………………………………...………………………85
Şekil 4.16. % 40 ACN-su (v/v) ortamında tilmikosin için çizilen pH-log I
grafikleri…………………………………………………………………...86
ix