tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tıbbi biyoloji ve genetik ana bilim dalı hl-60 hücre hattın

159 Pages·2011·4.93 MB·Turkish

T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANA BİLİM DALI

HL-60 HÜCRE HATTINDA MEVASTATİN VE 5-AZA-2-DEOKSİSİTİDİNİN
APOPTOTİK VE EPİGENETİK ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ

DOKTORA TEZİ

Akın YILMAZ

Tez Danışmanı

Prof.Dr. Sevda MENEVŞE

ANKARA
OCAK 2011
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANA BİLİM DALI

HL-60 HÜCRE HATTINDA MEVASTATİN VE 5-AZA-2-DEOKSİSİTİDİNİN
APOPTOTİK VE EPİGENETİK ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ

DOKTORA TEZİ

Akın YILMAZ

Tez Danışmanı

Prof.Dr. Sevda MENEVŞE

Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından 01/2007-95 proje numarası
ile desteklenmiştir.

ANKARA
OCAK 2011
I
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
Kabul ve Onay I
İçindekiler II
Şekiller ve Grafikler VIII
Tablolar XIII
Semboller, Kısaltmalar XIV
1. GİRİŞ 1
2. GENEL BİLGİLER 3
2.1. Kanser 3
2.2. Lösemi ve Tipleri 3
2.3. Akut Lösemiler 4
2.4. Akut Miyeloid Lösemi (AML) 4
2.4.1. Akut Miyeloid Lösemilerin Görülme Sıklığı 5
2.4.2. AML Gelişiminde Etkili Olan Risk Faktörleri 6
2.4.3. AML Gelişime Yol Açan Moleküler Mekanizmalar 7
2.4.4. Akut Miyeloid Lösemilerin Sınıflandırılması 7
2.4.5. Akut Miyeloid Lösemilerin Tedavisi 8
2.4.6. HL-60 Hücre Hattı 9
2.5. Statinler 9
2.5.1. Statin Çeşitleri 10
2.6. Mevalonat Yolağı 11
2.6.1. Mevalonat Sentez Reaksiyonu 12
2.6.2. HMGR Enzim Aktivitesinin Kontrolü 12
2.6.3. HMGR Enzimine Statinlerin Etki Mekanizması 13
2.6.4. Mevalonat Sentezinin Engellenmesinin Sonuçları 13
II
2.7. Statinler ve Kanser 14
2.7.1. Tümör büyümesi Üzerine Statinlerin Etkilerinin Moleküler 16
Temeli
2.8. Epigenetik ve Kanser 17
2.8.1. DNA Metilasyonu 18
2.8.2. Epigenetik Tedavi 21
2.8.3. DNA Metilasyon İnhibitörleri 21
2.8.4. 5-aza-2'-deoksisitidin (Decitabine, DAC) 22
2.8.5. DAC’nin DNA Yapısına Katılması 22
2.8.6. DNA metilasyonu ve Lösemi 24
2.9. Programlanmış Hücre Ölümü (Apoptoz) 25
2.9.1 Dışsal Yolak 26
2.9.2. İçsel Yolak 27
2.9.3. Apoptozun Düzenlenmesi 29
2.9.4. DNA Metilasyonu ve Apoptoz İlişkisi 30
3. GEREÇ VE YÖNTEM 32
3.1. Kullanılan Araç ve Gereçler 32
3.1.1. HL60 Hücre Hattı 32
3.1.2. Kullanılan Cihazlar 32
3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeleri 33
3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler 33
3.1.5. Kullanılan Kitler 34
3.2. Besiyeri ve Çözeltilerin Hazırlanışı 35
3.2.1. % 10’luk RPMI-1640 Besiyerinin Hazırlanışı 35
3.2.2. % 1’lik RPMI-1640 Besiyerinin Hazırlanışı 35
3.2.3. XTT Karışımının Hazırlanması 35
3.2.4. 0.2 M Na2HPO4 Çözeltisinin Hazırlanışı 35
III
3.2.5. 0.1 M Sitrik Asit Çözeltisinin Hazırlanışı 36
3.2.6. Fosfat-Sitrat Çözeltisinin (pH: 7.8) Hazırlanışı 36
3.2.7. % 0.25 Nonidet P-40 (NP-40) Çözeltisinin Hazırlanışı 36
3.2.8. 1 mg/ml Proteinaz K Çözeltisinin Hazırlanışı 36
3.2.9. 1 mg/ml Ribonükleaz A (RNaz A) Çözeltisinin Hazırlanışı 36
3.2.10. 10X Tris Borat EDTA (TBE) Stok Çözeltisinin Hazırlanışı 37
3.2.11. 0.5 M EDTA Çözeltisinin Hazırlanışı 37
3.2.12. 1X Tris Borat EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanışı 37
3.2.13. Orange G Jel Yükleme Tamponu 37
3.2.14. Stok Etidyum Bromür Boyasının Hazırlanışı 37
3.2.15. Agaroz Jelin Hazırlanışı 38
3.2.16. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması 38
3.2.17. 12.8 mM Stok Mevastatin Çözeltisinin Hazırlanması 38
3.2.18. 10 mM Mevastatin Çözeltisinin Hazırlanması 38
3.2.19. 5 mM Stok Mevastatin Çözeltisinin Hazırlanması 39
3.2.20. 1 mM Stok Mevastatin Çözeltisinin Hazırlanması 39
3.2.21. 1 mM 5-aza-2'-deoksisitidin (DAC) Çözeltisinin Hazırlanması 39
3.3. Yöntemler 39
3.3.1. Hücre Kültürü 39
3.3.2. Mevastatin ve DAC Uygulanan HL60 hücrelerinde Etkin Dozun 39
XTT Yöntemi ile Belirlenmesi
3.3.3. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Ayrımının Floresan 41
Mikroskobunda İncelenmesi
3.3.4. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının 42
Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
3.3.5. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile Belirlenmesi 43
3.3.6. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi 44
IV
3.3.7. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi İle 45
Gösterilmesi
3.3.7.1 Agaroz Jel Elektroforezi 45
3.3.8. Aktif CASP3 miktarının Sandwich ELISA yöntemi ile 46
Belirlenmesi
3.3.9. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi 47
3.3.10. Komplementer DNA (cDNA) sentezi 48
3.3.10.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı 49
3.3.11. Gen İfadesinin Real-Time PCR İle Belirlenmesi 49
3.3.11.1. CASP3 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 49
3.3.11.2. CASP8 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 50
3.3.11.3. CASP9 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 51
3.3.11.4. GADPH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi 51
3.3.11.5. CASP3, CASP8 CASP9 ve GAPDH Genleri için Real Time 52
PCR tepkime karışımları
3.3.11.6. Light Cycler (LC) Deney Programı 53
3.3.12. BAX, XIAP, BCL2 Genlerinin İfade Düzeylerinin Semikantitatif 54
RT-PCR ile Analizi
3.3.12.1. BAX Geninin İfade Düzeyinin Semikantitatif RT-PCR 55
Yöntemiyle Analizi
3.3.12.2. XIAP Geninin İfade Düzeyinin Semikantitatif RT-PCR 55
Yöntemiyle Analizi
3.3.12.3. BCL2 Geninin İfade Düzeyinin Semikantitatif RT-PCR 56
Yöntemiyle Analizi
3.3.12.4. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Semikantitatif RT-PCR 57
Yöntemiyle Analizi
3.3.12.5. BAX, XIAP, BCL2 ve GAPDH genlerinin semikantitatif 57
analizi için PCR tepkimesinin hazırlanması
V
3.3.12.6. BAX, XIAP, BCL2 ve GAPDH genlerinin cDNA’larının 58
Çoğaltılması İçin Kullanılan Tepkime Koşulları
3.3.12.7. Agaroz Jel Elektroforezi 59
3.3.13. CASP3 ve CASP8 Genlerinin Metilasyon Durumunun 59
Araştırılması
3.3.13.1 Hücrelerden DNA İzolasyonu 59
3.3.13.2. İn vitro Metillenmiş DNA Örneğinin Hazırlanması 60
3.3.13.3. DNA’nın Sodyum Bisülfit İle Modifikasyonu 61
3.3.13.4. Metilasyona Özgül PCR (MS-PCR) Tepkimesi İle CASP3 ve 62
CASP8 Genlerinin Metilasyon Durumlarının Araştırılması
3.3.13.5 Agaroz Jel Elektroforezi 64
3.4. İstatistiksel Analiz Yöntemleri 64
4. BULGULAR 66
4.1. HL60 Hücrelerinin Mevastatin ve DAC Duyarlılığının XTT Hücre 66
Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi
4.2. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Dağılımının Floresan 68
Mikroskobunda İncelemesi
4.3. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının 74
Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
4.4. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile Belirlenmesi 75
4.5. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi 77
4.6. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile 79
Gösterilmesi
4.7. Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi 80
4.8. Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi 82
4.9. Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırması 85
4.9.1. Mevastatinin CASP3, CASP8 ve CASP9 Genlerinin İfade 85
Düzeylerine 24, 48 ve 72. Saatlerdeki Etkisi
VI
4.9.2. DAC uygulanması sonrasında Mevastatinin CASP3, CASP8 ve 86
CASP9 Genlerinin İfade Düzeylerine 24, 48 ve 72. Saatlerdeki Etkisi
4.10. BAX, BCL2 ve XIAP mRNA’larının semikantitatif RT-PCR analiz 88
sonuçları
4.11. CASP3 ve CASP8 Genlerinin Metilasyon Durumları 90
5. TARTIŞMA 92
6. SONUÇ 103
7. ÖZET 105
8. SUMMARY 106
9. KAYNAKLAR 107
10. EKLER 137
11. ÖZGEÇMİŞ 138
VII
ŞEKİLLER ve GRAFİKLER

Sayfa No
Şekil 1: Tip 1 ve Tip 2 statinler ile HMG-KoA’nın yapısal 10
formülleri
Şekil 2: Statinlerin etkilediği mevalonat yolağı 11
Şekil 3: HMG-KoA’dan mevalonat sentez reaksiyonu 12
Şekil 4: Epigenetik mekanizmaların kanser gelişimindeki rolü 18
Şekil 5: Normal ve kanser hücresi arasındaki DNA metilasyon 20
kalıbındaki farklılık
Şekil 6: Sitidin, 5-metil sitidin, 5-aza sitidin ve 5-aza-2'- 22
deoksisitidinin kimyasal yapıları
Şekil 7: DAC ve 5-Azasitidinin DNA ve RNA yapısına katılması 23
Şekil 8: İçsel ve dışsal apoptotik yolaklar 28
Şekil 9: CASP3 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 50
primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 10: CASP8 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 50
primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 11: CASP9 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 51
primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 12: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 52
primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 13: BAX mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 55
primerlerin cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
VIII