Taxa de mutagênese em hortaliças de cultivo tradicional obtida através do uso da metodologia TRAD-MCN

2020·1.1 MB·

by  Santana, Bruna Caroline Ferreira

B. C. F. Santana, L. Bizeto, C. Moura, A. B. C. Rocha-Lima

Taxa de mutagênese em hortaliças de cultivo tradicional obtida através
do uso da metodologia TRAD-MCN

Bruna Caroline Ferreira Santana1, Luciana Bizeto1, Claudia de Moura1,
Ana Beatriz Carollo Rocha-Lima1*.

1Instituto de Ciências da Saúde – Universidade Paulista – UNIP, Jundiaí-SP, Brasil.
Endereço: Universidade Paulista - UNIP, campus Jundiaí, Instituto de Ciências da Saúde. Avenida
Armando Giassetti, 577 - Vila Hortolândia - Trevo Itu/Itatiba - Jundiaí – SP, CEP 13214-525, Tel.: (11)
4815-2333
*Autor de Correspondência: [email protected]
Os autores declaram não haver conflito de interesses.

Resumo
O presente bioensaio avaliou a genotoxicidade em hortaliças cultivadas
tradicionalmente (com agrotóxicos) e hortaliças orgânicas através do método Trad-
MCN, comparando os resultados de quatro grupos experimentais entre eles e com os
controles positivo, negativo e branco. Não foram identificadas diferenças
estatisticamente significativas entre as amostras de hortaliças de cultivo tradicional e
orgânicas; entretanto, foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre
as amostras com agrotóxicos em relação aos controles branco e negativo (p<0,05),
denotando que as hortaliças cultivadas tradicionalmente apresentaram maior taxa de
mutagênese em relação aos controles inócuos. Portanto, o presente bioensaio faz uso de
uma técnica amplamente difundida em análises de toxicidade ambiental para demonstrar
a capacidade que os agrotóxicos possuem de interagir com sistemas biológicos, que
pode ser atestada mesmo em experimentos de simples execução. O presente bioensaio
também ressalta a importância do monitoramento e da conscientização acerca do uso
excessivo dos defensivos agrícolas e propõe uma reflexão sobre os malefícios
comprovadamente causados pelos agrotóxicos.

Palavras-chave: Agrotóxicos, Genotoxicidade, Mutagênese, Tradescantia, Toxicologia,
Bioensaio.

Mutagenesis rate in traditional vegetable cultivation obtained using the TRAD-
MCN methodology

Abstract
This bioassay evaluated the genotoxicity in traditionally vegetables (with pesticides)
and organic vegetables through the Trad-MCN method, comparing the results of four
experimental groups between them and with the positive, negative and blank controls.
No statistically significant differences were identified between the samples of
traditionally and organic vegetables; however, statistically significant differences were
found between the samples with pesticides in relation to white and negative controls (p
<0.05), demonstrating that traditionally grown vegetables had a higher rate of
mutagenesis than innocuous controls. Therefore, the present bioassay makes use of a
widespread technique in environmental toxicity analysis to demonstrate the ability of
pesticides have to interact with biological systems, which can be demonstrated even in
easy-to-execute experiments. The present bioassay also highlights the importance of
monitoring and awareness of the overuse of pesticides and proposes a reflection on the
harmful effects caused by pesticides.

Keywords: Pesticides, Genotoxicity, Mutagenesis, Tradescantia, Toxicology, Bioassay.
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Introdução morrem por ano cerca de cinco mil
trabalhadores vítimas de agrotóxicos. A
O uso de agrotóxicos na maior parte dessas mortes poderia ser
agricultura brasileira aumentou muito evitada se houvesse o uso efetivo de
nos últimos anos: o Brasil encontrava-se EPIs por parte dos agricultores que
entre os oito maiores consumidores de manuseiam o produto9,10.
agrotóxicos do mundo, e em 2008 A exposição ocupacional de
passou a deter o 1° lugar do ranking1. trabalhadores rurais aos agrotóxicos tem
Segundo alerta feito pela Associação uma forte influência na saúde pública.
Brasileira de Saúde Coletiva Os efeitos mais bem documentados
(ABRASCO), um terço dos alimentos sobre a exposição envolvem o sistema
consumidos cotidianamente pelos nervoso, sobretudo as consequências
brasileiros está contaminado por neurotóxicas de uma exposição aguda
agrotóxicos2,3. de alto nível. Os sintomas neurológicos
Os agrotóxicos ou pesticidas são mais comuns incluem cefaleia, tontura,
divididos conforme sua função e seu náusea, vômito e suor excessivo. Já os
mecanismo de ação em herbicidas mais graves incluem o desenvolvimento
(48%), inseticidas (25%) e fungicidas de fraqueza muscular e
(22%), sendo os herbicidas os mais broncoespasmos, podendo evoluir para
utilizados no manejo de ervas daninhas, convulsões e coma, e em alguns casos
visando diminuir as perdas por para óbito11. A exposição a pesticidas
competição biológica e obter maiores pode ainda estar associada ao aumento
rendimentos4,5. O uso de agrotóxicos em de doenças e alterações como a Doença
hortaliças, sobretudo os fungicidas, de Parkinson, alterações do humor e
expõe de forma recorrente e perigosa a distúrbios do comportamento como
saúde do consumidor, o ambiente e os surtos psicótico, bem como à
trabalhadores à contaminação química diminuição das defesas imunológicas,
por uso de agrotóxicos1. anemia, impotência sexual masculina,
No atual sistema agrícola, é insônia e alterações da pressão
comum que ocorra a desestruturação arterial12,13. Um grande número de
ecológica do meio ambiente por meio agrotóxicos apresenta ainda atividades
da remoção química de plantas capazes de desregular o equilíbrio
competidoras, controle de pragas, hormonal (homeostase corporal),
seleção de linhagens, monocultura, desencadear tumores, causar
adubação química, irrigação, entre modificação na razão entre sexos ao
outros processos5. Vários insumos nascimento, infertilidade, más-
agrícolas apresentam efeitos nocivos ao formações congênitas no trato genital
meio ambiente como a presença de masculino, modificações na qualidade
resíduos no solo, na água, no ar, nas do sêmen e intoxicações em diferentes
plantas e nos animais, podendo esses graus. Em alguns casos, a ingestão de
resíduos chegarem ao homem através da agrotóxicos ocorre voluntariamente
cadeia alimentar6. como tentativa de suicídio e alguns
As intoxicações agudas por estudos mostram que a exposição aos
agrotóxicos atingem três milhões de inseticidas está relacionado a alguns
pessoas anualmente, sendo 2,1 milhões sintomas da depressão5,14.
de casos só nos países em No Brasil os casos de
desenvolvimento, e cerca de 193 mil intoxicação por defensivos agrícolas
pessoas no mundo perdem a vida todos apresentam grandes índices de
os anos por exposição a substâncias subnotificação e de dispersão de
químicas nocivas7,8; só no Brasil, informações decorrentes da dificuldade
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de locomoção e acesso às unidades de garantir a ausência total de resíduos de
saúde, da inexistência de centros de contaminantes químicos, devido à
saúde em regiões produtoras, da contaminação ambiental com produtos
dificuldade de diagnóstico e de persistentes e a mecanismos como
correlacionar os problemas de saúde derivação e proximidade de
com a exposição, da escassez de propriedades convencionais15.
laboratórios de monitoramento A metodologia de contagem de
biológico e da inexistência de micronúcleos (Trad-MCN) representa
biomarcadores precoces e/ou confiáveis. um índice a partir da determinação da
Está previsto que o número de mortes taxa de aberrações cromossômicas
deve crescer em decorrência dessas detectadas através da identificação e
intoxicações5. contagem de micronúcleos em uma
Os alimentos orgânicos são determinada população celular. Sua
definidos como alimentos in natura ou utilização tem sido proposta como teste
oriundos de um sistema orgânico de de curta duração para avaliação do
produção agropecuária e industrial, potencial genotóxico de agentes
baseado em técnicas que dispensam o químicos e físicos18.
uso de defensivos agrícolas (e.g. Este teste permite a detecção da
pesticidas sintéticos, fertilizantes exposição a compostos genotóxicos,
químicos, medicamentos de uso mas não possibilita a determinação do
veterinários, organismos geneticamente tempo exato da exposição, por isso é
modificados, conservantes, aditivos e considerado como um marcador de
irradiação)15. A produção de orgânicos exposição19. O bioensaio Trad-MCN
leva em conta o correto manuseio do vem se mostrando adequado para uma
solo e o uso de práticas de gestão de rápida averiguação de riscos impostos
acordo com as condições regionais, por substâncias mutagênicas aos
adaptando localmente os sistemas de sistemas biológicos. Além disso, esta
produção. As principais vantagens do técnica permite investigar o agente
consumo de orgânicos frente aos quando diluído em meio líquido, como
convencionais referem-se ao menor no caso dos agrotóxicos20.
índice de toxicidade e à manutenção do O uso da técnica de contagem de
equilíbrio ambiental16. micronúcleos (Trad-MCN), mais
As vantagens desse sistema para especificamente com a planta
o produtor estariam relacionadas a não Tradescantia pallida, pode colaborar
utilização dos produtos químicos, já que muito nos estudos de genotoxicidade;
boa parte dos agricultores não faz uso entretanto, a maior parte desses estudos
de equipamentos de proteção individual esses estão voltados à poluição
(EPIs), ou geralmente os produtos são atmosférica e da água, não sendo
utilizados de forma indiscriminada e comumente estudados a genotoxicidade
desordenada pelos mesmos. Além disso, de agrotóxicos21.
os agricultores se sentem pessoalmente O presente bioensaio teve como
satisfeitos em oferecer aos objetivo comparar a genotoxicidade de
consumidores produtos de melhor hortaliças cultivadas tradicionalmente
qualidade e que também proporcionam (com agrotóxicos) e hortaliças orgânicas
saúde para a população próxima aos através da obtenção da taxa de
locais de produção, diminuindo mutagênese, utilizando a técnica Trad-
consideravelmente a contaminação MCN.
ambiental17. Portanto, o presente bioensaio
É importante salientar que, faz uso de uma técnica amplamente
mesmo que a produção dos alimentos difundida em análises de toxicidade
orgânicos não se utilize de artifícios ambiental para ressaltar a importância
como os agrotóxicos, não é possível do monitoramento e da conscientização
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acerca do uso excessivo dos defensivos contendo inflorescências. A coleta foi
agrícolas. Pretende-se também que o realizada no Jardim Botânico de
presente estudo proponha uma reflexão Jundiaí, com a devida autorização dos
sobre os malefícios comprovadamente responsáveis pelo local. As hastes ou
causados pelos agrotóxicos e demonstre cuttings foram levadas ao Laboratório
a capacidade que os agrotóxicos de Análises Clínicas da Universidade
possuem de interagir com sistemas Paulista-UNIP, campus Jundiaí, onde
biológicos, que pode ser atestada foram separadas e transferidas para sete
mesmo em experimentos de simples béqueres contendo água de torneira por
execução. 24 horas (fase de adaptação).
Após a fase de adaptação das
Materiais e Métodos hastes, estas foram divididas entre os
grupos experimentais em sete béqueres
No presente bioensaio escolheu- para a fase de intoxicação. O primeiro
se utilizar o vegetal Tradescantia grupo experimental consistiu de um
pallida como bioindicador (método béquer com uma solução de cinco
Trad-MCN). A metodologia Trad-MCN folhas de chicória orgânica trituradas
consiste na exposição do vegetal em um mixer com 200 mL de água e um
Tradescantia pallida a agentes béquer com uma solução de cinco
genotóxicos, assim suas células folhas de chicória comprada em
reprodutoras (tétrades) desenvolvem supermercado, oriunda de cultivo
fragmentos do núcleo (micronúcleos) tradicional, também trituradas em um
formados a partir de quebras mixer com 200 mL de água; estas
cromossômicas e/ou perda de amostras experimentais foram
cromossomos. Os micronúcleos podem denominadas SO (solução orgânica) e
ser identificados através de leituras SP (solução pesticida).
microscópicas, contados e analisados A fim de minimizar a
estatisticamente22. possibilidade de metabólitos das
O objeto de estudo escolhido no hortaliças atuarem como substâncias
presente bioensaio foi a hortaliça genotóxicas nas soluções processadas
chicória oriunda de cultivo tradicional com mixer, outro grupo experimental
(com agrotóxicos), que foi adquirida em foi testado: cinco folhas levemente
um supermercado, e a hortaliça chicória picadas de chicória orgânica em 200 ml
oriunda de cultivo orgânico, comprada de água e cinco folhas de chicória
de produtores locais que não utilizam comprada em supermercado, oriunda de
agrotóxicos em seus produtos. cultivo tradicional, levemente picadas
No dia 04 de setembro de 2017, em 200 ml de água. Estas amostras
foram coletadas 104 hastes de experimentais foram denominadas IO
aproximadamente 10 cm da região (imersão orgânica) e IP (imersão
apical de Tradescantia pallida, pesticida) (Figura 1).

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Fonte: da autora, 2017
Figura 1. Intoxicação das hastes em soluções experimentais processadas e não
processadas.
.

Também foram realizados os histológico de ponta fina, estes foram
controles positivo, negativo e branco. macerados sobre lâminas e corados com
As hastes restantes foram divididas em uma mistura dos corantes Carmim e
três béqueres, um contendo 200 mL de Orceína acética. Os “debris” (restos de
água deionizada (controle branco), um sépalas que podem interferir na
contendo 200 ml de água de torneira visualização) foram descartados e a
(controle negativo) e um contendo 200 lamínula foi apoiada sobre o líquido
ml de uma solução de formol 1:1000ml obtido. A lâmina foi levemente
(controle positivo). aquecida sobre a chama de uma
A fase de intoxicação durou 8 espiriteira e foi então analisada ao
horas, e foi sucedida pela fase de microscópio para a visualização das
recuperação, em que foi repetido o tétrades.
mesmo processo da fase de adaptação Foi realizada a contagem de
(as hastes foram imersas em água de micronúcleo em 300 tétrades para cada
torneira durante 24h). Após a um dos sete grupos, totalizando 2100
recuperação, todos os botões das tétrades. Três quesitos foram
inflorescências foram colocados no considerados para a identificação dos
fixador (1 parte de ácido acético para 3 micronúcleos: estar nitidamente
partes de álcool etílico 98°INPM), no separado do núcleo e dentro do
qual permaneceram por mais de 48 citoplasma da tétrade, não estar
horas antes do início das análises. sobreposto ao núcleo e apresentar
Para a preparação das lâminas formato regularmente redondo (Figura
foram escolhidos os botões médios da 2).
inflorescência e, com o estile

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Fonte: da autora, 2017.
Figura 2. Tétrades com micronúcleo (aumento de 100x).

Os valores obtidos foram foram realizadas utilizando-se o
analisados estatisticamente através do software Excel, da Microsoft
teste qui-quadrado (X2), cujo princípio Corporation®.
básico é comparar proporções, isto é, as
possíveis divergências entre as Resultados
frequências observadas e esperadas para
certo evento23. Além disso, é um teste Na análise microscópica das
de probabilidade que se destina a tétrades para cada grupo analisado,
identificar um valor de dispersão para todas as amostras apresentaram
duas variantes nominais, verificando a micronúcleos, exceto o controle branco.
associação existente entre variantes Na tabela I encontram-se expressos os
qualitativas, levando-se em conta resultados absolutos e os percentuais
diferenças superiores a 95% entre as obtidos em relação ao total de 300
amostras, ou seja, com nível de tétrades por amostra.
significância (P<0,05). As análises

Tabela 1. Resultados amostrais absolutos e percentuais.
Amostra Valor absoluto % de micronúcleos
SO – Solução Orgânica 2 0,66%
SP – Solução Pesticida 8 2,66%
IO – Imersão Orgânica 5 1,66%
IP – Imersão Pesticida 11 3,66%
Controle Positivo 12 4%
Controle Negativo 2 0,66%
Controle Branco 0 0
Fonte: da autora, 2018.
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Nas tabelas 2 e 3 encontram-se expressos os resultados das análises estatísticas
realizadas.

Tabela 2. Valores de P e significância do teste X2. Os resultados estatisticamente
significativos estão sinalizados com um *.
SO – Solução SP – Solução IO – Imersão IP – Imersão
AMOSTRA
Orgânica Pesticida Orgânica Pesticida
Positivo 0,006 (P<0,05)* 0,36 (P>0,05) 0,02 (P<0,05)* 0,83 (P>0,05)
Negativo 0,15 (P>0,05) 0,055 (P>0,05) 0,25 (P>0,05) 0,01 (P<0,05)*
Branco 0,15 (P>0,05) 0,004 (P<0,05)* 0,02 (P<0,05)* 8,15-4 (P<0,05)*
Fonte: Própria, 2018.

Tabela 3. Valores de P e significância do teste X2.
AMOSTRA SP – Solução Pesticida IO – Imersão Orgânica
SO - Solução Orgânica 0,056 (P>0,05) 0,254 (P>0,05)
IP - Imersão Pesticida 0,484 (P>0,05) 0,128 (P>0,05)
Fonte: da autora, 2018.

Discussão possível atestar que a maioria das
amostras é significativamente mais
Foram encontradas diferenças tóxica do que os controles inócuos.
estatisticamente significativas na Estes resultados corroboram com o
quantidade de micronúcleos das estudo de Ansoar-Rodríguez e
amostras orgânicas em relação ao colaboradores24, que obtiveram
controle positivo, o que demonstra que resultados semelhantes com o pesticida
ambas as soluções experimentais que imidacloprida em diferentes
não possuem pesticidas são concentrações, tendo um aumento
significativamente menos tóxicas do significativo da frequência de
que a solução de formol 1:1000, micronúcleos conforme a dose do
comprovadamente mutagênica e pesticida que foi utilizada.
genotóxica. Todas as amostras Os efeitos mutagênicos dos
orgânicas não apresentaram diferenças agrotóxicos já são bem conhecidos há
estatisticamente significativas em muito tempo. Em 1972, os
relação aos controles inócuos (negativo, pesquisadores Tomkins e Grant25 já
água da torneira, e branco, água alertaram a comunidade acadêmica
deionizada), exceto a amostra IO, que sobre os efeitos mutagênicos dos
apresentou diferenças estatisticamente pesticidas sobre os sistemas biológicos:
significativas com o controle branco. um estudo comparou os efeitos
Portanto, a maioria das amostras não se citológicos dos pesticidas menazon
mostrou mais tóxica do que os controles (MEN), metobromuron (PAT) e
inócuos. tetracloroisoftalonitrilos (DAC)
Também foram encontradas utilizando a o bioensaio Trad-MCN.
diferenças estatisticamente Um dos pesticidas gerou efeitos
significativas entre as amostras de estatisticamente significativos nos
cultivo tradicional em relação aos bioindicadores.
controles negativo e branco, exceto a O bioensaio Trad-MCN não foi
amostra SP, que não apresentou suficientemente sensível para avaliação
diferença estatisticamente significativa de toxicidade da maioria dos pesticidas
com o controle negativo; dessa forma, é testados no estudo de Fadic et al,
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entretanto o bioensaio foi capaz de metodologias distintas de Trad-MCN
demonstrar o efeito clastogênico do comparem hortaliças de cultivo
pesticidas tais como dimetoato, carbaril tradicional com hortaliças orgânicas
e produto de quebra de DDT, DDE26. O para que seus resultados possam
composto organoclorado DDE induziu a evidenciar de forma mais conclusiva os
formação de micronúcleos. danos que os agrotóxicos residuais em
Porém, não foram identificadas alimentos podem causar.
diferenças estatisticamente
significativas entre nenhuma das
amostras de hortaliças cultivadas com Considerações finais
agrotóxicos em relação às hortaliças
orgânicas, resultado que poderia O uso indiscriminado de
reforçar as diferenças estatísticas agrotóxicos e pesticidas tem sido um
encontradas entre as amostras e os problema recorrente no país. O uso de
controles. agrotóxicos comprovadamente traz
Também não foram identificadas inúmeros riscos para a saúde humana e
diferenças estatisticamente para o ambiente.
significativas entre os dois métodos de Embora os resultados do
intoxicação experimentados a fim de presente bioensaio tenham indicado
evitar que os metabólitos presentes nas parcialmente uma maior toxicidade das
hortaliças não interferissem no resultado amostras de cultivo tradicional quando
final do estudo, de maneira que estas foram comparadas aos controles,
qualquer um dos métodos pode ser os resultados não foram conclusivos,
utilizado por estudos posteriores para indicando que possivelmente Trad-
avaliar a genotoxicidade de agrotóxicos MCN não seja o método mais eficaz
residuais, se utilizadas as mesmas para estudos envolvendo
hortaliças. genotoxicidade de agrotóxicos.
O presente estudo apresentou, Ainda assim, o presente
em sua maioria, resultados bioensaio ressalta a importância do
significativos na comparação entre as monitoramento e da conscientização
amostras experimentais em relação aos acerca do uso excessivo dos defensivos
controles, mas não demonstrou agrícolas e propõe uma reflexão sobre
diferenças entre os grupos os malefícios comprovadamente
experimentais. Dessa forma, causados pelos agrotóxicos.
interpretamos que o bioensaio Trad-
MCN talvez não seja uma metodologia
eficaz para identificar o grau de Agradecimentos
toxicidade e de mutagênese em
agrotóxicos, possivelmente pelo fato de Os autores agradecem ao
os agrotóxicos serem planejados para Programa de Iniciação Científica da
causar danos às pragas agrícolas e não Vice-Reitoria de Pós-Graduação e
aos vegetais. Pesquisa da Universidade Paulista –
Foi possível ainda concluir que, UNIP pela bolsa concedida, ao 18º
embora Trad-MCN seja um excelente Congresso Nacional de Iniciação
indicador de genotoxicidade, Científica (CONIC-SEMESP) pela
possivelmente não foi mais eficaz neste publicação da íntegra do relatório de
bioensaio pelo fato de que os pesquisa e ao Laboratório de Poluição
agrotóxicos são planejados para causar Atmosférica Experimental do
danos às pragas agrícolas e não aos Departamento de Patologia da
vegetais. Faculdade de Medicina da Universidade
Portanto, a partir dos resultados de São Paulo (FMUSP), na figura do
obtidos, sugere-se que estudos com prof. Dr. Paulo Hilário do Nascimento
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UNISANTA Bioscience Vol. 9 nº 3 (2020) p. 213 - 223 Página 222