Synthesis and biological testing of potential anti-tuberculosis drugs targeting the β-ketoacyl ACP

170 Pages·2016·2.08 MB·English

Synthesis and biological testing of potential
anti-tuberculosis drugs targeting
the β-ketoacyl ACP synthase

Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von
Diana Kešetovič
aus Příbram

Würzburg 2016

Synthesis and biological testing of potential
anti-tuberculosis drugs targeting
the β-ketoacyl ACP synthase

Dissertation zur Erlangung des
naturwissenschaftlichen Doktorgrades der
Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von
Diana Kešetovič
aus Příbram

Würzburg 2016
Eingereicht am:……………………………
bei der Fakultät für Chemie und Pharmazie

Gutachter der schriftlichen Arbeit
1. Gutachter: Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe
2. Gutachter: ……………………............

Prüfer des öffentlichen Promotionskolloquiums
1. Prüfer: Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe
2. Prüfer: …………………………………
3. Prüfer: ………………………………....

Datum des öffentlichen Promotionskolloquiums:……………………….

Doktorurkunde ausgehändigt am:………………………………………..
Die vorliegende Arbeit wurde am Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie der
Bayerischen Julius-Maximilians-Universität unter der Anleitung von
Frau Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe
angefertigt.

Danksagung
“Art is I, science is we“
– Claude Bernard

An dieser Stelle möchte ich meine Dankbarkeit ausdrücken, die letzten Worte in meiner
Arbeit schreiben zu dürfen. Daher möchte ich mich bei allen Personen, unter deren Einfluss
oder Mitwirkung ich diesen Punkt erreicht habe, bedanken.
Als Erstes möchte ich mich herzlich bei Frau Prof. Dr. Ulrike Holzgrabe für die freundliche
Aufnahme in ihren Arbeitskreis und das in mich gesetzte Vertrauen bedanken. Ihre
Anregungen, Unterstützung, Hinweise und Geduld habe ich sehr geschätzt.
Natürlich wäre meine Arbeit nicht ohne finanzielle Unterstützung machbar gewesen; ich bin
deshalb der Deutschen Forschungsgemeinschaft (SFB 630) sowie den Stipendienprogrammen
Erasmus und DAAD, die meinen Aufenthalt an der Universität Würzburg ermöglicht haben,
sehr verpflichtet. Dafür, dass ich gerade nach Würzburg kam, bin ich Herrn Prof. Dr. Martin
Doležal aus Hradec Králové in Tschechien dankbar, denn ohne den von ihm übermittelten
Kontakt wäre mein Weg ganz anders gewesen.
Da mein Dissertationsthema in einem mehr oder weniger engen Zusammenhang mit den
Arbeiten von Dr. Christine Topf, Dr. Benjamin Schaefer (AK Prof. Sotriffer), Dr. Johannes
Schiebel (AK Prof Kisker) und Vanessa Schlag stand, möchte ich mich bei ihnen für die von
ihnen erhaltenen Modellstrukturen (Christine, Benny), die ersten Aktivitätsmessungen meiner
Produkte (Christine) und die Bereitstellung des KasA-Enzyms (Christine, Johannes, Vanessa)
bedanken. Vanessa danke ich zusätzlich für die Zusammenarbeit an der Optimierung der
Fluoreszenz-Assay-Methode. Ein besonderer Dank gilt Dr. Kanishk Kapilashrami aus der
Stony Brook University, NY, für seine wertvollen Verbesserungstipps bezüglich des Assays
und für die Testung einiger unseren Verbindungen im Labor von Prof. Dr. Peter Tonge.
Weiterhin möchte ich mich bei Benjamin Merget (AK Prof. Sotriffer) für sein nettes
Engagement in der Erstellung der „R“-Software-Vorlage für meine Berechnungen und für die
Auswertung der mykobakteriellen Membrane-Gängigkeit von meinen Produkten mit Hilfe
des MycPermCheck Programms bedanken. Für die ergänzende Docking-Studie, durchgeführt
unter der Leitung von Prof. Dr. Christoph Sotriffer, danke ich Maximilian Kuhn, der mir
dabei zur Seite stand.
Im Rahmen des SFB 630 wurden auch die Aktivitäten auf den ganzen Zellen von
Mycobacterium tuberculosis bestimmt. Mein Dank gilt daher Frau Svetlana Sologub, die
meine Produkte im Labor von Dr. Tobias Ölschläger getestet hat. Für die Durchführung
weiterer antimikrobieller Testungen bedanke ich mich herzlich bei Frau Dr. Heike Bruhn und
ihrem Team.
Herrn Dr. Krzysztof Radacki und Dr. Alexander Damme danke ich sehr für die erhaltenen
Kristallstrukturen und ihre Hilfsbereitschaft bei deren Auswertung.
Für die NMR-spektroskopischen Messungen meiner Produkte möchte ich mich insbesondere
bei Ines Schmidt, Florian Seufert, Regina Messerer, Dr. Johannes Wiest, Dr. Christina Juli,
Dr. Christine Topf, Dr. Eberhard Heller, Dr. Georg Hiltensperger, Dr. Maximilian Tischer,
Dr. Christian Markl und Dr. Curd Schollmayer bedanken. Dr. Petra Kapková danke ich für
ihre Unterstützung bei den MS-Messungen.
Meinen AK-Kollegen bin ich vor allem dafür dankbar, dass sie sich für mich die Zeit
genommen haben, sei es wegen der Nutzung von sämtlichen Instrumenten oder wegen
entstandenen alltäglichen Laborproblemen. Mein besonderer Dank gilt Dr. Maximilian
Tischer, Dr. Eberhard Heller, Dr. Johannes Wiest und Dr. Georg Hiltensperger. Natürlich
möchte ich mich auch bei allen meinen damaligen Labor-Kollegen Christina, Christine, Max,
Michi, Georg, Christian, Ines und Flo, und bei unseren Laborantinnen Lina und Anna für ihre
Beiträge zu einem friedlichen Arbeitsklima herzlich bedanken. Für die ständige
Hilfsbereitschaft in Sachen der Bürokratie bedanke ich mich bei Frau Möhler und Frau Ebner
aus dem Sekretariat des Instituts. Für die Unterstützung bei sämtlichen technischen
Problemen danke ich Herrn Dr. Bernd Reyer und Dr. Jens Schmitz.
Dr. Max Kurlbaum, Dr. Klaus Uhlenhut, Dr. Maximilian Tischer, Dr. Stephanie Bank,
Dr. Frederic Vollmers, Melanie Mülek, Dr. David Ilko und Daniel Schuster, mit denen ich das
Praktikum vom 5. Semester (Biochemie) unter der Leitung von Frau Prof. Dr. Petra Högger
betreut habe, danke ich für die freundliche und entspannte Atmosphäre während und nach den
Arbeitszeiten. Ebenso dankbar bin ich für die schönen Wanderungen und netten Abende, die
ich im Arbeitskreis Holzgrabe erleben durfte.
Schließlich danke ich meiner Familie – vor allem meiner Mutti, Oma und Bruder – und
meinen Freunden für die liebevolle Unterstützung.
Table of contents
Table of contents
1 Introduction .................................................................................................................................. 1
1.1 Tuberculosis .................................................................................................................................. 1
1.1.1 Etiology and pathology of the disease .......................................................................................... 2
1.1.2 Tuberculosis worldwide ................................................................................................................ 3
1.2 The anti-tuberculosis therapy ...................................................................................................... 4
1.2.1 First-line anti-tuberculosis drugs................................................................................................... 4
1.2.2 Second-line antituberculosis drugs ............................................................................................... 6
1.2.3 Third-line antituberculosis drugs ................................................................................................ 10
1.2.4 Recently introduced novel drugs ................................................................................................. 10
1.2.5 Treatment regimens ..................................................................................................................... 11
1.3 The mycobacterial cell wall biosynthesis as an attractive drug target .................................. 13
1.3.1 The mycobacterial cell wall ........................................................................................................ 13
1.3.2 Fatty acids biosynthesis .............................................................................................................. 14
1.4 The β-ketoacyl-ACP synthase “KasA” ..................................................................................... 17
1.4.1 The catalytic mechanism of KasA .............................................................................................. 17
1.4.2 Inhibitors of the KasA catalytic activity ..................................................................................... 19
2 Aims & objectives ....................................................................................................................... 24
3 Synthesis ...................................................................................................................................... 26
3.1 Synthesis of the chromone derivatives ...................................................................................... 27
3.1.1 Synthesis of chromone-2-carboxylic acid ................................................................................... 27
3.1.2 Synthesis of chromone-2-carboxamides ..................................................................................... 28
3.1.3 Synthesis of 6-nitrochromone-2-carboxylic acid ........................................................................ 30
3.1.4 Synthesis of 6-nitrochromone-2-carboxamides .......................................................................... 31
3.1.5 Synthesis of the succinamic acids ............................................................................................... 32
3.1.6 Synthesis of 2-(4-hydroxy-3,5-dimethylbenzoyl)-4H-chromene-4-ones 13 and 14 ................... 34
3.1.7 Synthesis of 4-((2-(4-hydroxy-3,5-dimethylbenzoyl)-4-oxo-4H-chromen-6-yl)amino)-
4-oxobutanoic acid 16 ................................................................................................................. 34
3.1.8 Synthesis of N-benzyl-6-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)-4-oxobutanamido)-4-oxo-4H-
chromene-2-carboxamide 17 ....................................................................................................... 35
3.1.9 Synthesis of methyl malonyl ester-amides of chromone-2-carboxylic acid 18a and 18b ........... 36
3.1.10 Synthesis of 2-((2-bromophenyl)carbamoyl)-N,N,N-trimethyl-4-oxo-4H-chromene-
6-aminium triiodone 19 ............................................................................................................... 36
3.2 Synthesis of the pyrimidine derivatives .................................................................................... 37
3.2.1 Synthesis of pyrimidin-2-amines 21a-e ...................................................................................... 38
3.2.2 Synthesis of pyrimidin-2-ols 22a-e ............................................................................................. 39
3.2.3 Synthesis of ethyl 6-methyl-2-oxo-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-
5-carboxylate 23 .......................................................................................................................... 39
3.3 NMR Spectroscopy ..................................................................................................................... 40
3.3.1 NMR Spectroscopy of the chromone derivatives ....................................................................... 40
3.3.2 NMR Spectroscopy of the pyrimidine derivatives ...................................................................... 47
4 Biological testing ......................................................................................................................... 49
4.1 KasA direct binding assay ......................................................................................................... 49
Table of contents
4.1.1 Introduction ................................................................................................................................. 49
4.1.2 Methods ....................................................................................................................................... 50
4.1.3 Results ......................................................................................................................................... 52
4.1.4 Discussion and prospects ............................................................................................................ 59
4.2 Inhibition activity testing on the whole cells of M. tuberculosis .............................................. 61
4.2.1 Results ......................................................................................................................................... 62
4.2.2 Discussion ................................................................................................................................... 64
4.3 Anti-infective screening .............................................................................................................. 66
4.4 The assay interference potential of chromones ........................................................................ 67
4.5 Solubility problems ..................................................................................................................... 70
4.5.1 Introduction ................................................................................................................................. 70
4.5.2 Crystal structure and packing of selected chromone derivatives ................................................ 71
4.5.3 Solubilization assays ................................................................................................................... 79
4.6 Docking of compound 9i into the KasA binding pocket .......................................................... 86
4.6.1 Introduction ................................................................................................................................. 86
4.6.2 Docking results ........................................................................................................................... 87
4.6.3 Discussion ................................................................................................................................... 89
5 Summary ..................................................................................................................................... 91
6 Zusammenfassung ...................................................................................................................... 95
7 Experimental section .................................................................................................................. 99
7.1 General Methods ......................................................................................................................... 99
7.1.1 Measuring devices ....................................................................................................................... 99
7.1.2 Chromatography ........................................................................................................................ 100
7.1.3 Chemicals .................................................................................................................................. 100
7.1.4 Software .................................................................................................................................... 101
7.2 Synthesis .................................................................................................................................... 101
7.2.1 Synthesis of 4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid 2 ............................................................. 101
7.2.2 Synthesis of 4-oxo-4H-chromene-2-carboxamides 3a–p and 4a– k ......................................... 102
7.2.3 Synthesis of 4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid amides 7a-c ............................................ 113
7.2.4 Synthesis of 6-nitro-4-oxo-4H-chromene-2-carboxylic acid 8 ................................................. 115
7.2.5 Synthesis of 6-nitro-4-oxo-4H-chromene-2-carboxamides 9a-j ............................................... 115
7.2.6 Synthesis of 4-oxo-4H-chromen-6-yl-aminobutanoic acids 12a-i ............................................ 121
7.2.7 Synthesis of 2-(4-hydroxy-3,5-dimethylbenzoyl)-4H-chromen-4-ones 13 and 14 ................... 126
7.2.8 Synthesis of 4-((2-(4-hydroxy-3,5-dimethylbenzoyl)-4-oxo-4H-chromen-6-yl)amino)-
4-oxobutanoic acid 16 ............................................................................................................... 127
7.2.9 Synthesis of N-benzyl-6-(4-(4-methylpiperazin-1-yl)-4-oxobutanamido)-4-oxo-
4H-chromene-2-carboxamide 17 .............................................................................................. 128
7.2.10 Synthesis of methyl 3-((-4-oxo-4H-chromen-6-yl)amino)-3-oxopropanoates 18a and 18b ..... 129
7.2.11 Synthesis of 2-((2-bromophenyl)carbamoyl)-N,N,N-trimethyl-4-oxo-4H-chromen-
6-aminium triiodone 19 ............................................................................................................. 131
7.2.12 Synthesis of ethyl 6-methyl-2-oxo-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-
5-carboxylate 23 ........................................................................................................................ 131
7.2.13 Synthesis of pyrimidin-2-amines 21a-e ..................................................................................... 132
7.2.14 Synthesis of pyrimidine-2-ols 22a-e .......................................................................................... 134