syntese af 3,7-disubstituerede imipraminer via buchwald-hartwig cyklisering og studier af disses ...

166 Pages·2010·11.01 MB·Danish

SYNTESE AF 3,7-DISUBSTITUEREDE
IMIPRAMINER VIA
BUCHWALD-HARTWIG CYKLISERING
OG STUDIER AF DISSES INHIBERING
AF DEN HUMANE

SEROTONIN-TRANSPORTER

Speciale af
Helle Christensen
20041209
Januar 2010
Vejleder: Henrik Helligsø Jensen
Bioorganisk Gruppe
Kemisk Institut
Aarhus Universitet

Indhold
Indhold
Forord .................................................................................................................................................. iii
Forkortelsesliste ................................................................................................................................... iv
Resumé ................................................................................................................................................ vi
Summary ............................................................................................................................................. vii
1. Introduktion .............................................................................................................................................1
1.1 Depression ........................................................................................................................................ 1
1.2 Biologiske årsager til depression ...................................................................................................... 3
1.3 Neurotransmission ............................................................................................................................ 4
1.4 Serotonin og det serotonerge system ................................................................................................ 5
1.5 Antidepressiva .................................................................................................................................. 6
1.6 Serotonin-transporteren .................................................................................................................... 9
1.7 Bindingsmodel af imipramin i hSERT ........................................................................................... 11
1.8 Projektidé ....................................................................................................................................... 14
2. Modellering ............................................................................................................................................15
2.1 Molekylær docking......................................................................................................................... 15
2.1.1 Glide .................................................................................................................................... 16
2.1.2 Prime ................................................................................................................................... 17
2.1.3 Induced Fit Docking ............................................................................................................ 17
2.2 Analyse af IFD resultater ............................................................................................................... 18
3. Resultater og diskussion ........................................................................................................................22
3.1 Intro ................................................................................................................................................ 22
3.2 Buchwald-Hartwig kobling ............................................................................................................ 23
3.2.1 Mekanisme .......................................................................................................................... 23
3.2.2 Ligander ............................................................................................................................... 26
3.2.3 Base og solvent .................................................................................................................... 27
3.2.4 Cyklisering af imipramin ..................................................................................................... 28
3.3 Testsystem for Buchwald-Hartwig koblingen ................................................................................ 28
3.3.1 Testsystem 1: C-N kobling med methyl 3-bromo-4-methylbenzoat (30) ............................ 29
3.3.2 Syntese af prækatalysatorerne med SPhos (34) ................................................................... 31
3.3.3 Testsystem 2: C-N kobling af methyl 3-bromo-4-methylbenzoat (30) med prækatalysator
med XPhos (35) .................................................................................................................................. 31
3.3.4 Testsystem 3: Kobling med ethyl 3-bromo-4-methylbenzoat (40) ...................................... 33
3.4 Syntese af symmetrisk udgangsstof 43 og 44 til Buchwald-Hartwig koblingen ............................ 35
3.4.1 Fremstilling af ethyl 4-iodobenzoat (46) ............................................................................. 36
3.4.2 Sonogashira krydskobling ................................................................................................... 37
3.4.3 Reduktion ............................................................................................................................ 39
3.4.4 Bromering ............................................................................................................................ 39
3.4.5 Omdannelse af dimethylester 43 til diethylester 44 ............................................................ 41
3.5 Optimering af C-N kobling med diethylesteren 44 ........................................................................ 42
3.5.1 C-N kobling med 44 under mikrobølgebetingelser ............................................................. 43
i
Helle Christensen
Indhold
3.6 Mislykkedes syntese af 3,7-dihydroxymethylimipramin (9) .......................................................... 45
3.7 Mislykkedes syntese af 3,7-dimethoxymethylimipramin (10) ....................................................... 46
3.8 Syntese af 3,7-dicyanoimipramin (4) ............................................................................................. 47
3.9 Syntese af usymmetriske 3,7-disubstituerede imipraminer ............................................................ 49
3.9.1 Syntese af 2,2,2-trichloroethyl 4-iodobenzoat (63) ............................................................. 50
3.9.2 Syntese af usymmetrisk udgangsstof 74 og 75 til Buchwald-Hartwig koblingen ............... 52
3.9.3 Mislykket syntese af imipramin analog 76 .......................................................................... 53
3.9.4 Mislykket syntese af det usymmetriske udgangsstof 84 til Buchwald-Hartwig kobling..... 54
3.9.5 Mislykket syntese af 3-ethoxycarbonyl, 7-carboxamidimipramin (17)............................... 56
3.10 Syntese af 3,7-ditertbutoxycarbonylimipramin (7) ..................................................................... 57
3.11 Syntese af 3,7-dihydroxymethylimipramin (9), 3,7-dimethoxymethylimipramin (10),
3,7-dimethylimipramin (12) og 3,7-dicarboxyimipramin (8) .................................................................. 59
3.12 Mislykkedes syntese af 3,7-dicarboxamidimipramin (11) .......................................................... 60
3.13 Syntese af 3-tertbutoxycarbonyl, 7-ethoxycarbonylimipramin (18) og 3-tertbutylester,
7-hydroxymethylimipramin (19) ............................................................................................................. 61
3.14 Mislykkedes syntese af 3,7-diaminoimipramin (22) ................................................................... 62
3.15 Opsummering .............................................................................................................................. 64
3.16 Biologiske test ............................................................................................................................. 64
3.17 Resultater af biologiske test ......................................................................................................... 66
3.17.1 Affinitet af 3,7-disubstituerede imipraminer for hSERT, hNET og hDAT. ........................ 66
3.17.2 Mutagenese studier .............................................................................................................. 67
4. Konklusion .............................................................................................................................................71
5. Experimental ..........................................................................................................................................73
5.1 Experimental procedure for computer modeling ............................................................................ 73
5.1.1 Ligand preparation ............................................................................................................... 73
5.1.2 Protein preparation .............................................................................................................. 73
5.1.3 Induced Fit Docking simulations ......................................................................................... 73
5.2 General ........................................................................................................................................... 75
5.3 General NMR characterization ....................................................................................................... 76
5.4 Experimental data ........................................................................................................................... 77
6. Appendiks .............................................................................................................................................118

ii
Helle Christensen
Forord
Forord
Denne afhandling bygger på laboratoriearbejde udført på Kemisk Institut, Aarhus Universitet i
Bioorganisk gruppe i perioden januar til november 2009 under vejledning af adjunkt Henrik Helligsø
Jensen. Projektet blev udført i tæt samarbejde med tidligere specialestuderende Christina
Schjøth-Eskesen fra januar til juni 2009. Specialet er skrevet på dansk, og der er anvendt danske
fagudtryk i det omfang, der er fundet dækkende og muligt. Det eksperimentelle afsnit er skrevet på
engelsk med henblik på fremtidig publikation.
I forbindelse med mit speciale er der flere, jeg vil takke. Først og fremmest stor tak til min vejleder,
Henrik Helligsø Jensen, for at involvere mig i dette spændende projekt og for særdeles god vejledning
under hele forløbet. Tak til Christina Schjøth-Eskesen for det gode samarbejde omkring projektet. Tak til
Steffen Sinning for samarbejdet omkring de biologiske optagsforsøg og for gode diskussioner omkring
disse resultater. Derudover vil jeg gerne takke Anders Lindhardt, Karin Dooleweerdt, Søren Kramer og
Thomas Gøgsig for hjælp og gode råd med Buchwald-Hartwig koblingerne. Stor tak til Maria Musgaard
for hjælp og vejledning med IFD studiet og til Heidi Koldsø og Leyla Celik for klargøring af
krystalstrukturen af Leucin-transporteren. Heidi Frahm, Julie Lybæk Høj Madsen og Lisbeth Andersen
takkes for hjælp med oprensning med HPLC.
Maria Musgaard, Anne Mette Frey og Karin Dooleweerdt skal have stor tak for gode diskussioner
omkring projektet og hjælp med korrekturlæsning af udvalgte dele af rapporten.
Ph.d. studerende Marie Jensen skal have en særlig stor tak for gennemlæsning og korrektur af hele
opgaven.
Jeg vil gerne takke nuværende og tidligere studerende og ansatte i gruppe 103 samt gruppe 107 for
mange gode timer, både i og udenfor laboratoriet.
Sidst, men bestemt ikke mindst, vil jeg gerne takke min kæreste Bo, min familie og mine venner for god
og uundværlig støtte og opbakning under hele forløbet.

Helle Christensen
Januar 2010

iii
Helle Christensen
Forkortelsesliste
Forkortelsesliste
Ac: Acetyl h: Hour(s)/time(r)
aq: Aqueous/ vandig h: Human
Ar: Aryl 5-HIAA: 5-Hydroxyindoleacetic acid/
BDNP: Brain-derived neurotrophic factor 5-hydroxyindol-eddikesyre
BINAP: 2,2’-Bis(diphenylphosphino)-1,1’- HMQC: Heteronuclear multiple quantum
binaphthyl coherence
Boc: Tertbutyldicarbonat HPA: Hypothalamus-pituitary-adrenal/
br s: Broad singlet/ bred singlet Hypothalamus-hypofyse-
Bu: Butyl binyrebark
cDNA: Complementary DNA/ HPLC: High performance liquid
komplementært DNA chromatography
CNS: Centralnervesystemet HRMS: High resolution mass
COSY: Correlation spectroscopy spectrometry
cpm: counts per minute/ hSERT: Human serotonin-transporter
Lysglimt pr. minut 5-HT: 5-Hydroxytryptamin, serotonin
CREB: cAMP response element binding 5-HTP: 5-Hydroxytryptofan
protein Hz: Hertz
D: Deuterium #: Indgang
d: Doublet IC : Inhibitory concentration 50%
50
dd: Double doublet/dobbelt doublet ICD: International classification of
3D: Tredimensionel(le) diseases/ International
DA: Dopamin sygdomsklassifikation
DAT: Dopamin transporter IFD: Induced fit docking
dba: Dibenzylidenacetone J: coupling constant/
DBMH: 1,3-Dibromo-5,5- Koblingskonstant
dimethylhydantoin kat: Katalytisk
DBU: 1,8-Diazabicycl[5.4.0]undec-7-en K: Inhiberingskonstant ved ligevægt
i
DCM: Dichlormethan K : Michaelis-Menten konstant
M
DMAP: 4-Dimethylaminopyridin konc.: Koncentreret
DME: Dimethoxyethan LeuT Leucin-transporter fra Aquifex
Aa:
DMF: N,N-Dimethylformamid aeolicus

DMSO: Dimethylsulfoxid LHMDS: Lithium hexamethyldisilazin
DPPA: Diphenyl phosphoryl acid LRMS: Low resolution mass
DPPF: 1,1’-Bis(diphenylphosphino) spectrometry
ferrocen LSD: Lysergsyre diethylamid
ΔE: Energi ændring m: Multiplet
Ed: Edition, udgave MAO: Monoaminoxidase
eq: equivalents MAOI: Monoaminoxidase inhibitor
ES: Electrospray MC: Monte Carlo
Et: Ethyl MDMA: 3,4-Methylen-N-
FF: Force field/kraftfelt dioxymetamfetamin
GABA: γ-Aminobutyric acid/ Gamma- Me: Methyl
amino-butansyre µw: Mikrobølge
GLIDE: Grid-based ligand docking with Min: minut(ter )/minute(s)
energetics mp: Melting point/ smeltepunkt
iv
Helle Christensen
Forkortelsesliste
Ms: methansulfonyl/mesyl S 1: Nukleofil substitution,
N
MS: Mass Spectrometry/ unimolekylær
Massespektrometri S 2: Nukleofil substitution,
N
MTBE: Methyl tert-butyl ether bimolekylær
NA: Noradrenalin SNRI: Serotonin-noradrenalin reuptake
NARI: Selective noradrenalin reuptake inhibitors/serotonin-noradrenalin
inhibitor/selektiv noradrenalin genoptagsinhibitor
genoptagsinhibitor SSRI: Selective serotonin reuptake
NaSSA: Noradrenergic and specific inhibitor/selektiv serotonin
serotonergic antidepressant/ genoptagsinhibitor
Noradrenerg og specifikt t: Tert, tertiær
serotonerg antidepressiva t: Triplet
NBS: N-Bromosuccinimid TBAF: Tetra-n-butylammoniumfluorid
NET: Noradrenalin-transporteren TCA: Tricyclic antidepressants/
NMR: Nuclear Magnetic Resonance/ Tricyklisk antidepressiva
kernemagnetisk resonans Temp.: Temperatur
NSS: Neurotransmitter natrium Tf: Trifluormethansulfonyl/triflyl
symportere TFA: Trifluoreddikesyre
OPLS: Optimized potential for liquid th: Til højre
simulations THF: Tetrahydrofuran
p: Pentet TLC: Thin layer chromatography/
P: Probability/sandsynlighed Tyndtlagskromatografi
PaMLAC: Paired mutant-ligand analougue TMEDA: N,N,N’,N’-tetramethylethylen
complementation diamin
Ph: Phenyl TM: Transmembran(e)
ppm: Parts per million TMS: Trimethylsilyl
Prækat: Prækatalysator Tol: Toluyl
q: Quartet/kvartet Tot.: Total
qv: Quintet/kvintet tv: Til venstre
ref: Reference WHO: World Health Organization/
R: Retention factor Verdenssundhedsorganisationen
f
rt: Room temperature/ wt: Wild type/vildtype
Stuetemperatur ækv.: Ækvivalent(er)
s: Singlet Å: Ångstrøm
SERT: Serotonin-transporteren

Der anvendes standart 1- og 3-bogstavsforkortelser for aminosyrer.

v
Helle Christensen
Resumé
Resumé
Formålet med dette projekt var at syntetisere 3,7-disubstituerede imipraminer til anvendelse af studier
af hSERT samt for at finde nye og bedre antidepressiva med høj affinitet og selektivitet for hSERT. Målet
var at danne disse analoger via en syntesevej, der involverer en dobbelt C-N krydskobling, også kaldet en
Buchwald-Hartwig kobling, i tilstedeværelse af esterfunktionaliteter på 3- og 7-positionen. Fordelen ved
esterfunktionaliteter er, at de kan derivatiseres til andre funktionelle grupper, og på den måde vil en 3,7-
diesterimipramin åbne op for fremstillingen af en række andre af andre 3,7-disubstituerede imipraminer.

Tidligere studier udført i Bioorganisk gruppe i samarbejde med Biomodelleringsgruppen på Aarhus
Universitet og Center for Psykiatrisk Forskning, Psykiatrisk Hospital, Risskov, har valideret en
bindingsmodel for imipramin i bindingslommen i hSERT. Denne bindingsmodel blev i dette projekt
anvendt til at studere 3,7-disubstituerede imipraminer via induced fit docking i en homologimodel af
hSERT.
For at bestemme de optimale reaktionsbetingelser for Buchwald-Hartwig koblingen blev forskellig
sammensætning af palladium-kilde, ligand, base, temperatur og solvent afprøvet på et simplificeret
testsystem. Det højest opnåede udbytte for det simple system var 85 %, men ved skift til cyklisering af
substratet med netop disse betingelse, viste det sig, at betingelserne ikke var optimale for den dobbelte
krydskobling. Dette førte derfor til yderligere optimering. De fundne betingelser blev anvendt til
fremstilling af en usymmetrisk (18) og fire symmetriske (4, 5, 6 og 7) 3,7-disubstituerede imipraminer.

Fremstillingen af disse imipramin analoger muliggjorde syntese af yderligere en usymmetrisk (21) og fire
symmetriske imipraminer (8, 9, 10 og 12).

Ni imipramin analoger (5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 og 21) blev testet for affinitet for hSERT og tre mutanter
deraf, samt for affinitet over for hDAT og hNET. Det viste sig, at 3,7-dimethylimipramin (12) både har
højere affinitet og selektivitet for hSERT end imipramin selv. Resultaterne fra optagsforsøgene med
hSERT og de tre mutanter heraf underbygger den tidligere validerede bindingsmodel.
vi
Helle Christensen
Symmary
Summary
The purpose of this project was to synthesize 3,7-disubstituted imipramines for use in studies of hSERT
and to discover new and better antidepressants with high affinity and selectivity for hSERT. The goal was
to synthesize these analogues via a synthesis that involves a double C-N cross coupling, also called a
Buchwald-Hartwig coupling, in the presence of ester functionalities at the 3- and 7-positions. The
advantage of ester functionalities are that they can be transformed to other functional groups, and so
can a 3,7-diesterimipramine lead to a number of other 3,7-disubstituted imipramines.

Earlier studies performed in Bioorganic group in collaboration with the group of Biomodeling at Aarhus
University and Center for Psychiatric Research, Psychiatric Hospital, Risskov, has validated a binding
model of imipramine in the binding pocket in hSERT. This model was used in this project to study
3,7-disubstituted imipramines via induced fit docking into a homology model of hSERT.
To determine the optimal conditions for the Buchwald-Hartwig coupling was a number of different
compositions of palladium source, ligand, base, temperature and solvent tested on a simplified test
system. The highest yield obtained for the simple system was 85 %, but when switching to the cyclization
of the substrate with precisely those conditions, it appeared that these conditions were not optimal for
the double cross-coupling. This therefore led to further optimization. The determined conditions were
used for the synthesis of one unsymmetrical (18) and four symmetrical (4, 5, 6 and 7) 3,7-disubstituted
imipramines.

The production of these imipramine analogs allowed the synthesis of an additional unsymmetrical (21)
and four symmetrical (8, 9, 10 and 12) imipramines.
Nine imipramine analogs (5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 18 and 21) were tested for affinity for hSERT and three
mutants thereof and for affinity for hDAT and hNET. It turned out that 3,7-dimethylimipramin (8) both
has higher affinity and selectivity for hSERT than imipramine itself. The results from the biological
experiments with hSERT and the three mutants provide further evidence for the validated binding
model.
vii
Helle Christensen
Introduktion

1. Introduktion
1.1 Depression
I dagligdags sprog bruges ordet ”depression” til tider om almindelig tristhed, men dette skal ikke
forveksles med den kliniske sygdom, depression, der i sværere tilfælde manifesterer sig som en psykotisk
sygdom. Depression er en sindslidelse, der oftest varer mange måneder og i betydelig grad nedsætter
livskvaliteten og den sociale funktionsevne for patienten. Depression er først og fremmest karakteriseret
ved sænket stemningsleje.1 Der findes to typer af depressionssygdomme. Den ene er bipolar affektiv
lidelse, hvor patienten svinger mellem mani og depression. Denne sygdomstype udgør 25 % af alle
tilfælde. Den anden depressionssygdom er unipolar depression, hvor stemningslejet konstant er sænket
og udgør de resterende 75 % af sygdomstilfældene.2
Verdenssundhedsorganisationen (WHO) har placeret unipolar depression på en fjerdeplads over de 10
sygdomme i verden, som giver anledning til det største tab af livskvalitet og leveår, og anslår at
depression i år 2020 vil ligge på en andenplads på denne liste næst efter hjerte-kar-sygdomme.3
Depression er en hyppig forekommende sindslidelse. Cirka 15 % af den danske befolkning vil på et eller
andet tidspunkt i livet udvikle symptomer på depression.1 En undersøgelse fra 2004 viste, at forekomsten
af depression hos voksne danskere i alderen 20-79 år var på omkring 3 %. Denne statistik er i
overensstemmelse med studier i Europa, hvor forekomsten af depression i befolkningen er mellem 3 og
5 %. I Danmark betyder denne statistik, at der til enhver tid vil være omkring 150.000 personer, der er
ramt af en depression. Blandt disse udgør patienter med svær, indlæggelseskrævende depression
omkring 20 %.4
En depression medfører store lidelser for den enkelte og for de pårørende. Hos en deprimeret, kan der,
udover sænket stemningsleje, være nedsat energi og et nedsat aktivitetsniveau. Derudover kan der være
træthed, en følelse af uoverkommelighed og manglende evne til at føle glæde. Selvfølelsen er nedsat, og
det kan udvikle sig til tanker om skyld og betydningsløshed og til tanker om selvmord. Derudover kan
søvnforstyrrelser, nedsat eller øget appetit og nedsat seksualdrift forekomme. Somme tider ses en
karakteristisk variation i tilstanden over døgnet, således at den depressive tilstand er særlig slem om
morgenen og bedres noget hen mod aften.1
Til diagnosticering af depression har danske læger og psykiatere siden 1994 fulgt WHO’s internationale
sygdomsklassifikationssystem (International Classification of Diseases, ICD). Ud fra denne klassifikation
inddeles de depressive tilstande i tre hovedgrupper: Depressiv enkelt episode, tilbagevendende
(periodisk) depression og vedvarende (kroniske) affektive tilstande.5 I den gældende ICD-10-klassifikation
defineres depressiv enkeltepisode som en tilstand med flere samtidige symptomer, set over en 14 dages
periode. Symptomerne inddeles i depressive kernesymptomer og depressive ledsagesymptomer (se

1 Gerlach, J., Depression, Symptomer, årsager og behandling, Psykiatri Fondens Forlag, 1. udgave, 2006, 11, 27-55,
217-244, 289-296.
2 Rang, H. P.; Dale, M. M.; Ritter, J. M.; Flow, R. J., Rang and Dale’s Pharmacology, Churchill Livingstone Elsevier, 6th
Ed., 2007, 189-198, 498-502, 557-573.
3 The World Health Report 2001. Mental Health: New Understanding, New Hope. Geneva, WHO, 2001.
4 Olsen, L. R.; Mortensen, E.L.; Bech, P., Acta. Psychiatr. Scand., 2004, 109, 96-103.
5 WHO ICD-10, Psykiske lidelser og adfærdsmæssige forstyrrelser. Klassifikation og diagnostiske kriterier,
Munksgaard, 1. udgave, 2000, 81-98.
1
Helle Christensen