Sveučilište u Zagrebu Prirodoslovno-matematički fakultet Biološki odsjek Alen Kovačević ...

69 Pages·2015·3.48 MB·Croatian

by  Alen Kovacevic

Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek

Alen Kovačević
Proteomska analiza promjena u stanicama tumora dojke
čovjeka MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina α
v
Diplomski rad

Zagreb, 2015.
Ovaj rad, izrađen na Institutu Ruđer Bošković u Zagrebu, u Laboratoriju za
genotoksične agense Zavoda za molekularnu biologiju i u Laboratoriju za sistemsku
biomedicinu Zavoda za molekularnu medicinu , pod vodstvom dr. sc. Andreje
Ambriović Ristov, znanstvene savjetnice i doc. dr. sc. Maria Cindrića , predan je na
ocjenu Biološkom odsjeku Prirodoslovno-matematičkog fakulteta Sveučilišta u
Zagrebu radi stjecanja zvanja magistra molekularne biologije.
II
Zahvaljujem se svojim mentorima dr. sc. Mariju Cindriću i dr. sc. Andreji Ambriović
Ristov, na stručnom vodstvu, prenesenom znanju, konstruktivnim kritikama, podršci i
strpljenju tijekom izrade diplomskog rada. Također, srdačno se zahvaljujem svim
djelatnicima Laboratorija za sistemsku biomedicinu i Laboratorija za genotoksične
agense na pomoći i suradnji, a posebno dr. sc. Ani Butorac, dipl. ing. Kristini Perica i
dr. sc. Nikolini Stojanović, na izdvojenom vremenu, prenesenom praktičnom znanju,
motivirajućoj radnoj atmosferi i ugodnom društvu.
Želim se zahvaliti svojim roditeljima i baki Draginji na svakodnevnoj potpori i
podršci te bezgraničnoj i bezuvjetnoj ljubavi koja me kroz cijeli život gura naprijed i
diže kad posustanem. Hvala i bratu Milanu na pomoći, podršci i toleranciji tijekom
svih ovih godina suživota.
Za kraj, htio bih se zahvaliti svojim kolegama i prijateljima Frani, Kruni, Mirni, Katji,
Vesni, Željki i Ivi za 5 prekrasnih godina druženja bez kojih ovo iskustvo ne bi bilo
potpuno. Hvala vam što ste uz mene čak i kad smo kilometrima razdvojeni. Hvala
Tamari, Tamsi, Moniki, Ivanu, Filipu i Luci na riječima ohrabrenja te ugodnim i
opuštenim razgovorima i druženjima.
III
TEMELJNA DOKUMENTACIJSKA KARTICA

Sveučilište u Zagrebu
Prirodoslovno-matematički fakultet
Biološki odsjek Diplomski rad

PROTEOMSKA ANALIZA PROMJENA U STANICAMA
TUMORA DOJKE ČOVJEKA MDA-MB-435S NAKON
UTIŠAVANJA INTEGRINA α
V

Alen Kovačević
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb
Integrini su transmembranski glikoproteini koji stanici omogućuju kontakt s
izvanstaničnim matriksom i drugim stanicama. Sudjeluju u prijenosu molekularnih
signala čime reguliraju brojne procese u stanici kao što su adhezija, rast, preživljenje,
diferencijacija i pokretljivost. Stanice tumora dojke čovjeka MDA-MB-435S
eksprimiraju na svojoj površini heterodimere integrina α β i α β . Utišavanjem ovih
V 3 V 5
integrina, transfekcijom α -specifičnom siRNA, stanice MDA-MB-435S postaju
V
osjetljivije na djelovanje vinkristina i paklitaksela te im se smanjuje migratorna
sposobnost. U ovom radu opisane su promjene u proteomskom profilu stanica MDA-
MB-435S nakon utišavanja integrina α . Ovo istraživanje moglo bi doprinjeti
V
otkrivanju molekularnog mehanizma povećanja osjetljivosti stanica na vinkristin i
paklitaksel i smanjenja migratorne sposobnosti, nakon utišavanja podjedinice
integrina α .
V

(62 stranice, 8 slika, 18 tablica, 80 literaturnih navoda, jezik izvornika: hrvatski)
Rad je pohranjen u Središnjoj biološkoj knjižnici
Ključne riječi: tumor dojke, MDA-MB-435S, protutumorski lijekovi, integrini,
proteomika

Voditelji: doc. dr. sc. Mario Cindrić
dr. sc. Andreja Ambriović Ristov, znanstveni savjetnik
Ocjenitelji: doc. dr. sc. Dubravko Pavoković
izv. prof. dr. sc. Vesna Benković
izv. prof. dr. sc. Antun Alegro

Rad prihvaćen: 18. veljače 2015.
IV
BASIC DOCUMENTATION CARD

University of Zagreb
Faculty of Science
Department of Biology Graduation Thesis

PROTEOMIC ANALYSIS OF HUMAN BREAST
CANCER CELLS MDA-MB-435S AFTER SILENCING
INTEGRIN α
V

Alen Kovačević
Rooseveltov trg 6, 10000 Zagreb
Integrins are transmembrane glycoproteins that mediate cell-cell and cell-ECM
interactions. They are a part of signal transduction pathways that regulate numerous
cell processes such as cell adhesion, growth, proliferation, differentiation and
migration. Human breast carcinoma cell line MDA-MB-435S expresses integrins
α β and α β . The silencing of integrins αvβ3 and αvβ5, achieved by αv-specific
V 3 V 5
siRNA transfection, increases sensitivity of MDA-MB-435S cells to vincristine and
paclitaxel and reduces their migratory potential. In this study we describe changes in
MDA-MB-435S proteome profile upon integrin α silencing. These results could
V
contribute to better understanding of molecular mechanisms involved in MDA-MB-
435S chemosensitation as well as mechanisms involved in decreased cell migration
after integin α silencing.
V

(62 pages, 8 figures, 18 tables, 80 references, original in: Croatian)
Thesis is deposited in Central biological library
Key words: breast cancer, MDA-MB-435S, anti-cancer drugs, integrins, proteomics

Supervisors: Mario Cindrić, PhD, assistant professor
Andreja Ambriović Ristov, PhD, senior scientist
Reviewers: Dubravko Pavoković, PhD, assistant professor
Vesna Benković, PhD, associate professor
Antun Alegro, PhD, associate professor

Thesis accepted: February 18th, 2015
V
Sadržaj
1. UVOD........................................................................................................................1
1.1. Tumori............................................................................................................................1
1.1.2. Tumori dojke...........................................................................................................2
1.1.3. Trostruko negativni tumor dojke.............................................................................3
1.1.3.1. Stanična linija MDA-MB-435S kao model istraživanja................................................4
1.2. Terapija tumora dojke..................................................................................................5
1.2.1. Tubulin vezujući agensi: vinkristin i paklitaksel.....................................................5
1.3. Integrini..........................................................................................................................7
1.3.1. Integrini αv: α β i α β ............................................................................................9
v 3 v 5
1.3.2. Integrini kao ciljne molekule u terapiji tumora.....................................................10
1.3.2.1. Ciljanje integrina α s naglaskom na heterodimere α β i α β ....................................10
v v 3 v 5
1.4. Otpornost tumora na protutumorske lijekove posredovana integrinima.............11
1.5. Proteomski pristup istraživanju tumora...................................................................12
1.5.1. Spektrometrija masa kao oruđe u proteomskim istraživanjima.............................14
2. CILJ ISTRAŽIVANJA.........................................................................................16
3. MATERIJALI I METODE...................................................................................17
3.1. Materijali.....................................................................................................................17
3.1.1. Stanična linija........................................................................................................17
3.1.2. Osnovne kemikalije...............................................................................................17
3.1.3. Transfekcija malih interferirajućih molekula RNA (siRNA)................................19
3.1.4. Protutijela...............................................................................................................19
3.1.5. Otopine..................................................................................................................19
3.1.6. Uređaji i drugi materijali.......................................................................................21
3.1.7. Programska podrška...............................................................................................22
3.2. Metode..........................................................................................................................23
3.2.1. Uzgoj stanica u kulturi...........................................................................................23
3.2.2. Presađivanje stanica...............................................................................................23
3.2.3. Zamrzavanje stanica..............................................................................................23
3.2.4. Odmrzavanje stanica..............................................................................................24
3.2.5. Utišavanje gena RNA interferencijom...................................................................24
3.2.6. Određivanje ekspresije integrina metodom protočne citometrije..........................24
3.2.7. MTT test................................................................................................................26
3.2.8. Priprema staničnog lizata.......................................................................................26
3.2.9. Određivanje koncentracije proteina po Bradfordu................................................27
VI
3.2.10. Rehidratacija i izoelektrično fokusiranje.............................................................27
3.2.11. Ekvilibracija IPG traka........................................................................................28
3.2.12. Denaturirajuća elektroforeza u poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE)................28
3.2.13. Bojanje proteina u gelovima Coomassie brilijant plavom bojom.......................29
3.2.14. Snimanje i analiza gelova....................................................................................30
3.2.15. Odbojavanje izrezanih komadića gelova.............................................................30
3.2.16. Digestija proteina u gelu tripsinom......................................................................30
3.2.17. Pročišćavanje peptida tehnikom Zip-Tip pomoću C18 kolona..........................31
3.2.19. Analiza peptida spektrometrom masa MALDI-TOF/TOF..................................32
3.2.20. Pretraživanje baze podataka................................................................................32
4. REZULTATI..........................................................................................................34
4.1. Utišavanje podjedinice integrina α specifičnom siRNA čini stanice tumora dojke
v
čovjeka MDA-MB-435S osjetljivijim na djelovanje vinkristina i paklitaksela............34
4.2. Kvantitativna usporedba proteomskih profila stanica tumora dojke čovjeka
MDA-MB-435S nakon utišavanja integrina α okriva nekoliko diferencijalno
v
eksprimiranih proteina......................................................................................................36
4.3. Rezultati analize staničnih proteina spektrometrijom masa i pretrage baze
podataka..............................................................................................................................39
5. RASPRAVA...........................................................................................................44
6. ZAKLJUČCI..........................................................................................................54
7. LITERATURA.......................................................................................................55
8. ŽIVOTOPIS...........................................................................................................61

VII
1. UVOD

1.1. Tumori
Tumori su skupina bolesti čije je glavno obilježje nekontrolirani rast stanica
koje u nekom trenutku stječu sposobnost prelaska iz jednog tkiva u drugo putem
krvožilnog i/ili limfnog sustava. Tkivo iz kojeg tumor nastaje određuje specifične
osobine pojedinog tumora, a do danas je klasificirano više od 100 različitih tipova.
Prema vrsti stanica iz kojih su nastali, mogu se podijeliti u 5 skupina: karcinomi
(nastali od epitelnih stanica), sarkomi (nastali od stanica vezivnog tkiva), leukemije
(tumori nastali u krvotvornim organima), limfomi i mijelomi (nastali iz stanica
imunosnog sustava) te tumori središnjeg živčanog sustava (http://www.cancer.gov).
U genomu tumorskih stanica postoje brojne mutacije - od točkastih, u kojima
je promijenjen samo jedan nukleotid, do većih kromosomskih aberacija kao što je npr.
translokacija. Uzevši to u obzir, tumore je moguće definirati kao bolest genoma na
staničnoj razini čiji nastanak uzrokuje višegodišnje nakupljanje mutacija u genomu
stanica nekog tkiva (Pecorino, 2012). Nastali tumor (neoplazma) zapravo je
kompleksno tkivo sastavljeno od različitih tipova stanica koje međusobno heterotipski
intereagiraju. Osim toga, tumorske stanice utječu i na normalne stanice koje ih
okružuju i čine tzv. tumoru pridruženu stromu. Stromalne stanice (tumorski
mikrookoliš) također pridonose procesu tumorigeneze. Na slici 1. prikazane su
značajke tumora odgovorne za nastanak i cjelokupni razvoj bolesti, a kao najvažniju
treba istaknuti nestabilnost genoma i podložnost mutacijama (Hanahan, 2011).
Mutacije bitne za razvoj tumora su one koje se događaju u proto-onkogenima
te tumor supresorskim genima. Prekomjernom ekspresijom ili mutacijama u proto-
onkogenima nastaju onkogeni, geni čiji produkt je sposoban transformirati normalne
stanice u tumorske (npr. geni koji kodiraju za proteine uključene u proces staničnog
rasta i proliferacije). Tumor supresorski geni su pak oni čiji produkt sprječava
nastanak tumora (npr. geni koji kodiraju za proteine uključene u popravak DNA).
Gubitak ekspresije ili mutacija u ovim genima dovodi do nastanka tumora (Pecorino,
2012).
1
Slika 1. Obilježja tumora (preuzeto i prilagođeno iz Hanahan, 2011).

1.1.2. Tumori dojke

Tumor dojke najučestaliji je tip tumora u žena zapadnog svijeta. Nakon raka
pluća, drugi je po redu uzročnik smrti žena, a pojavnost je u porastu. U SAD-a, 2014.
godine, od ukupnog broja novonastalih tumora u ženskoj populaciji, čak 29% čine
tumori dojke (Siegel i sur., 2014). Iako vrlo rijetko, tumor dojke može se javiti i kod
djece, adolescenata te muškaraca (http://pathology.jhu.edu).
Tumori dojke su heterogena skupina bolesti koja se prema histološkoj
klasifikaciji može podijeliti na epitelne tumore i sarkome. Manje od 1% tumora dojke
čine sarkomi, tumori nastali u vezivnom tkivu dojke, dok ih je velika većina nastala u
epitelnom tkivu. Ovisno o tome nastane li epitelni tip raka dojke u stanicama žlijezda
koje stvaraju mlijeko ili u epitelnim stanicama mliječnih cjevčica, govorimo o
lobularnom ili duktalnom tipu raka dojke. Skoro 80% tumora dojke ubraja se u
skupinu invazivnih duktalnih karcinoma (http://pathology.jhu.edu).
2
Estrogeni, ženski spolni hormoni, ključni su u procesu nastanka i razvoja ove bolesti.
Čimbenici koji utječu na povećanje rizika od nastanka raka dojke su brojni, a
uglavnom su povezani s produljenom izloženošću organizma djelovanju estrogena.
Rana prva menstruacija, kasna menopauza, oralna kontracepcija, konzumacija
alkohola i pretilost, samo su neki od rizičnih čimbenika (Pecorino, 2012). Osim
navedenih okolišnih i endogenih utjecaja, veliku ulogu igra i genetska predispozicija.
Čak 20-30% slučajeva nasljednog raka dojke povezano je s mutacijama u tumor
supresorskim genima BRCA1 i BRCA2 (Levanat i Cvok, 2010), čiji su proteinski
produkti zaduženi za regulaciju transkripcije, popravak DNA i regulaciju staničnog
ciklusa (Pecorino, 2012).
Razvoj medicine i molekularne biologije doveo je do boljeg razumijevanja
heterogenosti tumora dojke na molekularnoj razini. Na osnovu razlika u ekspresiji
receptora za estrogen (ER), receptora za progesteron (PR), receptora 2 za faktor rasta
epiderme (engl. Human epidermal growth factor receptor 2, HER2) te citokeratina,
tumore dojke moguće je podijeliti na 5 različitih tipova: tip sličan normalnoj dojci,
luminalni A, luminalni B, HER2-bogati i tumori slični bazalnim/trostruko negativni
tumori (Hollestelle i sur., 2010). Potpunija slika molekularnog profila određenog tipa
tumora dojke dovela je do bolje njege pacijenata, a to se očituje ranijim otkrićem
bolesti te razvojem novih ciljanih lijekova (Pecorino, 2012).

1.1.3. Trostruko negativni tumor dojke

U velikoj raznolikosti do sada navedenih tipova tumora dojke, posebno se
ističe skupina tzv. trostruko negativnih tumora dojke (TNBC, engl. Triple negative
breast cancer) kakvih je 10 – 17% svih invazivnih tumora dojke (Badve i sur., 2011).
Stanice TNBC ne eksprimiraju značajne količine ER, PR niti HER2, što ovu bolest
čini teškom za liječenje. Pacijenti ne reagiraju ni na jednu do sada poznatu terapiju
osim konvencionalne kemoterapije koja je, s obzirom na visok metastatski potencijal
ovog tipa tumora i sklonost recidivu, ograničene učinkovitosti (Carey i sur., 2010).
TNBC se javljaju najčešće kod mlađih žena (<50 godina) s BRCA1 mutacijom
(Badve i sur., 2011), a karakteriziraju ga visok gradus, visok mitotski indeks te
prisutnost mutiranog p53. Oko 70% TNBC ekprimira bazalne markere te ih se ubraja
3