( Sus scrofa) GENETINĖS ĮVAIROVĖS ANALIZĖ

62 Pages·2013·3.5 MB·Lithuanian

by  Jolita Bak

VYTAUTO DIDŽIOJO UNIVERSITETAS
GAMTOS MOKSLŲ FAKULTETAS
BIOLOGIJOS KATEDRA
Jolita Bakanauskaitė

EUROPINIO ŠERNO ( Sus scrofa) GENETINĖS ĮVAIROVĖS ANALIZĖ
Magistro baigiamasis darbas
Molekulinės biologijos ir biotechnologijos studijų programa, valstybinis kodas 621C71001
Molekulinės biologijos ir biotechnologijos studijų kryptis

Vadovas: dr. Vykintas Baublys ___________ __________
(Parašas) (Data)
Apginta: prof. dr. Algimantas Paulauskas ___________ ____________
(Parašas) (Data)

Kaunas, 2013
Darbas atliktas: 20011 – 2013 m. Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje

Recenzentas:

Darbas ginamas: viešame bakalauro darbų gynimo komisijos posėdyje 2013 metų gegužės30 d.
Vytauto Didžiojo universitete, Biologijos katedroje, 801 auditorijoje 9 valandą. Adresas: Vileikos8,
LT-44404.

Protokolo Nr. ...........

Darbo vykdytojas: Jolita Bakanauskaitė ___________
(Parašas)

Darbo vadovas: Dr. Vykintas Baublys ___________
(Parašas)

Katedra atsakinga už bakalauro darbo parengimą: Biologijos katedra
Katedros vedėjas: prof. dr. Aniolas Sruoga ___________
(Parašas)

2
TURINYS
SANTRAUKA .................................................................................................................................... 4
SUMMARY ........................................................................................................................................ 5
1. ĮVADAS ...................................................................................................................................... 6
2. LITERATŪROS APŽALGA ...................................................................................................... 8
2.1.Europinio šerno (Sus scrofa) paplitimas .................................................................................... 8
2.2.Sus scrofa morfologija ............................................................................................................... 9
2.3.Ekologinė niša ......................................................................................................................... 10
2.4.Sus scrofa veiklos žymės ......................................................................................................... 11
2.5.Mityba ...................................................................................................................................... 13
2.6.Dauginimasis ir gausa .............................................................................................................. 13
2.7.Ligos ir parazitai ...................................................................................................................... 16
2.8.Genetiniai tyrimai .................................................................................................................... 17
3. TIRIAMOJI MEDŽIAGA IR METODIKA ................................................................................. 20
3.1.Tiriamoji medžiaga ir jos paėmimo vietos .............................................................................. 20
3.2.DNR išskyrimas iš audinio ...................................................................................................... 21
3.3.DNR švarumo ir koncentracijos nustatymas ........................................................................... 22
3.4.mtDNR D-kilpos regiono analizė PGR pagala ........................................................................ 24
3.5.Elektroforezė agarozės gelyje .................................................................................................. 26
3.6.DNR išskyrimas iš agarozės gelio ........................................................................................... 27
3.7.AAPD PGR – polimerazinė grandininė reakcija ..................................................................... 28
4. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ............................................................................................ 30
4.1.mtDNR D-kilpos regiono analizė šernų populiacijose ............................................................ 30
4.2.mtDNR D-kilpos sekvenuotų sekų analizė .............................................................................. 32
4.3.Tiriamųjų mėginių analizė AAPD metodo pagalba ................................................................ 34
4.4.AAPD pradmenų analizė elektroforezės pagalba .................................................................... 36
4.5.Genetiniai panašumai tarp tirtų populiacijų............................................................................. 40
4.6.Informatyviausių pradmenų sankaupinė analizė ..................................................................... 44
4.7.Apibendrinti populiacinės genetikos parametrai ..................................................................... 49
5. IŠVADOS ...................................................................................................................................... 53
LITERATŪROS SĄRAŠAS.............................................................................................................55
PRIEDAI...........................................................................................................................................58

3
SANTRAUKA
Darbo autorius: Jolita Bakanauskaitė
Darbo pavadinimas: Europinio šerno (Sus scrofa) genetinės įvairovės analizė.
Darbo vadovas: dr. Vykintas Baublys
Darbas atliktas: Vytauto Didžiojo universitete, Gamtos mokslų fakultete, Kaune 2013.
Puslapių skaičius: 57
Lentelių skaičius: 16
Paveikslų skaičius: 46
Priedų skaičius: 1

Šio darbo tikslas buvo įvertinti Lietuvos ir Baltijos šalių šernų populiacijos genetinę
įvairovę mitochondrinės DNR D-kilpos regiono pagausiunimo ir atsitiktinai amplifikuotos
polimorfinės DNR (APPD) metodais.
Tiriamieji mėginiai buvo surinkti iš 16 regionų: Mažeikių, Marijampolės, Kazlų Rūdos,
Kėdainių, Rokiškio, Alytaus, Lazdijų, Varėnos, Vilniaus-Šalčininkų, Jonavos, Radviliškio, Trakų ir
Baltarusijos bei Estijos. mtDNR D-kilpos regiono amplifikacijai, naudoti pradmenys
MITL4/MITH4, MITL44/MITH45. Gauti rezultatai nusekvenuoti Biotechnologijos instituto
sekvenavimo centre.
Atlikus Europinio šerno (Sus scrofa) AAPD žymenų tinkamumo populiaciniam
kintamumui įvertinti analizę, nustatyta, kad ROTH180-06 ir ROTH180-09 pradmenys yra tinkami
tarppopuliaciniam kintamumui vertinti (pradmenys atspindi 65% ir 68% tarppopuliacinės įvairovės
atitinkamai). Įvertinus genetinę šernų populiacijų struktūrą nustatyta, kad Lietuvos, Estijos ir
Baltarusijos šalių populiacijos turi labai daug bendrų bruožų tarpusavyje. Darome prielaidą, kad šių
šalių populiacijos sudaro vieną bendrą Baltijos šalių metapopuliaciją. Metapopuliacijos hipotezę
patvirtina mtDNR D-kilpos kontrolinio regiono tyrimas panaudojant MITL4/MITH4 žymenį.
Visuose tirtose Baltijos šalyse ir regionuose amplifikuoto regiono seka buvo identiška. Aptikti
skirtumai palyginus šias sekas su Azijos regiono šernais ir Naminėmis kiaulėmis iš Europos bei
Azijos.

4
SUMMARY
Author of term paper: Jolita Bakanauskaite
Full title of term paper: Genetic variability analysis of European wild boar (Sus scrofa)
Term paper advisor:dr. Vykintas Baublys
Number of pages: 57
Number of tables: 16
Number of pictures: 46
Number of appendixes: 1

The aim of this work was to evaluate genetic diversity of the Lithuanian and Baltic wild
boar populations using mitochondrial DNA D-loop region amplification and random amplified
polymorphic DNA (RAPD) methods.
Test samples were collected from 16 regions: Mazeikiu, Marijampoles, Kazlų Rųdos,
Kėdainių, Rokiskio, Alytus, Lazdijų, Varėnos, Vilnius-Šalčininkų, Jonavos, Radviliškio, Trakų and
Belarus and Estonia. for amplification of Sus scrofa mtDNA D-loop region we used
MITL4/MITH4, MITL44/MITH45 primers. The obtained results were sequenced in Biotechnology
Institute sequencing centre.
RAPD analysis showed that ROTH180-06 and ROTH180-09 primers are suitable for
interspecific analysis of examined wild boar populations. After genetic analysis we detected that all
investigated populations (Lithuanian, Estonian and Belarusian) have a lot of common genotypes.
We make hypothesis that populations from all investigated countries form one big metapopulation.
mtDNA D-loop region analysis supports this hypothesis, because all investigated (marker
MITL4/MITH4) individuals has the identical sequence.

5
1. ĮVADAS
Šernas (Sus scrofa), kiaulinių (Suidae) šeimai, porakanopių (Artiodactyla) būriui
priklausantis žinduolis. Paplitęs Eurazijos miškų zonoje (Europoje, Azijoje), vėliau introdukuotas
Australijoje, Amerikoje ir pietų Afrikoje. Lietuvoje aptinkamas vidurio Europos šernas (Sus
scrofascrofa). Dažniausiai aptinkami visuose miškuose - gausiausiai ten, kur dirvožemis
derlingesnis, įvairesnė ir gausesnė augalija, ar žemės ūkio kultūros. Gyvena didelėmis bandomis,
labiausiai mėgsta spygliuočių miškus, didelius eglynus (Beleišis, 2002).
Šiuo metu šernų populiacija Lietuvoje išaugusi šešis kartus . Jų kasmet gausėja dėl palankių
klimato sąlygų, papildomo šėrimo, visaėdiškumo. Patelės prisitaikiusios vesti per metus po dvi
vadas dėl to šernai Lietuvoje yra labai vislūs. Per didelė šernų populiacija pridaro nemažai žalos
urbanizuotoms vietoms, gamtai, daug nuostolių dėl jų patiria ūkininkai. Vietovėse, kur šernų
populiacijos gausiasnės, nuo jų dažnai nukenčia ant žemės perintys miško paukščiai: tetervinai,
jerubės, slankos, bei žemės ūkio kultūros. Labiausiai šernų populiacijos reguliuojamos medžioklės
pagalba, tačiau dėl gausaus individų paplitimo gyvenvietėse ar kurortiniuose miesteliuose
(Juodkrantė, Nida, Pervalka, Smiltynė, Preila), šis būdas nėra itin veiksmingas (Navasaitis, 2007).
Bioįvairovės tyrimai yra pagrįsti keletu pagrindinių molekulinių tyrimų metodų, kurių
pagrindinė tiriamoji medžiaga yra DNR. Dažniausiai genetinė medžiaga tiriama PGR (polimerazės
grandinine reakcija) naudojant įvairius žymenis: RAPD (atsitiktinai pagausinta polimorfinė DNR) ,
mitochondrinės DNR variabilūs ir konservatyvūs regionai. Analizė šiais žymenimis atliekama
greitai, pasižymi dideliu specifiškumu. Šie molekuliniai tyrimų metodai yra plačiai naudojami
daugelio rūšių genolapių sudarymui, genų paieškai, genotipų identifikavimui, populiacijų genetinės
įvairovės tyrimams. Tai svarbu tiriant genetinius reiškinius populiacijoje, aiškinant populiacijos
adaptacijos ir specializacijos mechanizmus (Augalų biotechnologijos centras, 2012).

6
Darbo tikslas:
 Nustatyti Lietuvos ir Baltijos šalių Laukinių šernų (Sus scrofa) genetinę įvairovę panaudojus
atsitiktinai amplifikuotospolimorfinės DNR (AAPD) analizę irmitochondrinės DNR D-kilpos
regiono fragmento pagausinimą.

Uždaviniai:
1. Nustatyti atsitiktinius pradmenis tinkamus Europinio šerno (Sus scrofa) vidupopuliaciniam ir
tarppopuliaciniam kintamumui tirti Lietuvoje ir Baltijos šalyse.
2. Apibūdinti Lietuvos ir Baltijos šalių Laukinių šernų (Sus scrofa) genetinę populiacijų struktūrą
ir polimorfizmo lygį, tyrimui naudojant AAPD žymenis.
3. Nustatyti tiriamų šernų (Sus scrofa)genetinę įvairovę amplifikuojantmitochondrinės DNR D-
kilpos regioną, ir analizuojant pagausinto DNR fragmento seką.

7
2. LITERATŪROS APŽALGA
2.1 Europinio šerno (Sus scrofa) paplitimas

Šernas (Sus scrofa) kiaulinių (Suidae) šeimos žinduolis, priklausantis porakanopių
(Artiodactyla) būriui, žinduolių (Mammalia) klasei, chordinių (Chordata) tipui ir gyvūnų
(Animalia) karalystei. Lietuvoje gyvena vienos genties šenai (Sus) rūšis: vidurio Europos šernas
(Sus scrofascrofa) (Beleišis, 2002).
Šernai evoliucijos pasėkoje neteko raktikaulio, todėl kojos juda viena plokštuma – pirmyn
ir atgal, kūno masės judesius sušvelnina priekinės kojos, kurios laisvai raumenimis jungiasi su
liemeniu, taip pat redukuotas šeivikaulis bei alkūnkaulis todėl kojos nedaro sukamojo ir
griebiamojo judesio. Šoninis judesys kompensuojamas blauzdikaulio ir stipinkaulio sustorėjimu.
Pirštai taip pat redukuoti, kūno atrama tapo galinė naguota kūno falanga, kurią apdengė raginė
sienelė vadinama naga. Lyginant su kitais kanopiniais šernų šoninės kanopos yra ilgesnės, todėl
visada yra matomi 2-5 įspaudai, tuo tarpu kitų kanopinių šoninės kanopėlės siekia žemę tik žvėrims
bėgant. Dėl maitinimosi stambiu augaliniu maistu pakito dantų ir skrandžio sandara. Vienas iš
svarbiausių šernų bruožų - prisitaikymas prie landšafto (Beleišis, 2002).
Labiausiai šernai išplitę Eurazijos miškų zonoje iškskyrus Airiją, Angliją ir Skandinaviją
(1 pav.). Aptinkami visoje Europoje ir Azijoje (išskyrus šiaurines dalis), šiaurinėje Afrikos
dalyje, Australijos rytinėse ir vakarinėse dalyse, Šiaurės Amerikos pietinėje ir rytinėje dalyse bei
Pietų Amerikoje.

1 pav. Šernų (Sus scrofa) paplitimas. (WAZA, 2005)

8
2.2 Sus scrofa morfologija
Visoms rūšims būdingas ilgas snukis (knyslė), kojos trumpos, kitaip negu atrajotojai, turi
ne tik apatinius, bet ir viršutinius kandžius, bei dideles išsikišusias iltis, kurios auga visą individo
gyvenim, tai svarbi ginybinė kūno dalis. Šernai yra visaėdžiai gyvūnai, gyvena įvairiuose
miškuose, miškastepėse, daugiausia lygumose (Lietuvos fauna. Žinduoliai, 1988).
Kūnas iš šonų plokščias, priekinė dalis masyvi. Kaklas trumpas ir raumeningas. Galva
didelė, priekyje baigiasi nusmailėjusia knysle. Akys mažos ir giliai įdubusios. Uodega vidutinio
ilgio, jos gale yra ilgesnių plaukų kuokštas. Kūnas apaugęs juosvais šeriais, po jais yra rudi
vilnaplaukiai, jie būna ypač tankūs žiemą, o vasarą retesni (2 pav.) keteros šeriai ilgi. (Belova,
2007). Jauniklių kailiukas išilgai dryžuotas, po 3-5 mėn. dryžiai išnyksta ir kailis tampa rausvai
rudas. Suaugusiems būdingas kailis susiformuoja kitą pavasarį. Pirmą kartą šernai šeriasi būdami
12 – 14 mėnesių, visiškai išsišeria antrųjų gyvenimo metų pradžioje. Suaugę šernai šeriasi kartą
per metus – kovo-gegužės mėnesiais. Vasarą kailis būna tamsesnis, lieka tik šeriai (Medžiotojų
draugija, 2011).
Suaugusi patelė vidutiniškai sveria 135 kg. (109-160 kg.), patinas nuo 300 iki 320 kg.
Kaukolė masyvi. Patinų labai stambios tribriaunės viršūnės ir apatinės nuolat beaugančios iltys (3
pav.). Patinų priekinė kūno dalis masyvesnė ir gūbrys didesnis negu patelių. taip pat jie turi
plaukų šepetėlį papilvėje. Šernų odoje yra riebalinių liaukų, kurios reikalingos gyvūnui žymėtis
savo teritoriją (Belova, 2007).
2 pav. Šernas (Barauskas, 2011) 3 pav. Šerno iltys – viršutinės ir apatinės
(Medžiotojų draugija, 2011)
Laukinių šernų patinų kūno ilgis nuo 156 iki 175 cm, aukštis – nuo 84 iki 103 cm.
Patelių kūno ilgis – 146-164 cm, aukštis – 82-94 cm. Šerno dantų formulė:
I3/3C1/1P4/4M 3/3=44
(I – kandžiai, C – iltiniai dantys, P – prieškrūminiai dantys, M –
krūminiai dantys). Viršutiniame ir apatiniame žandikauliuose yra po 22 dantis, viso – 44. Šernų
9
dantų sistema yra heterodontinė (4pav.) (Šatkauskienė, 2009). Tik gimę šerniukai turi 10 dantų, iš
jų 4 iltinius. Krūminiai ir prieškrūminiai dantys yra nuolatiniai, jų paviršius gumburiuotas
(Mažeikių krašto enciklopedija, 2008).
4 pav. Sus scrofa dantų schema ( Manualofzoology, 2002).

2.3 Ekologinė niša

Gyvena įvairaus dydžio, formos ir sudėties miškuose. Gausiau jų aptinkama lapuočių,
mišriuose eglės lapuočių miškuose. Šernai aktyvūs naktimis, o dieną dažniausiai praleidžia
guoliuose. Žiemai guolio vietą iš anksto paruošia – prisiknisa iki žemes arba iškloja ,,patalą” eglės
šakutėmis, nendrėmis. Patelių su jaunikliais guoliai apvalūs, pavienių patinų – pailgi, storiau
iškloti. Vasarą ir rujos metu šernai mėgsta purvo, “vonias” (5 pav.). Labai mėgsta maudytis, tiek
vandenyje, tiek dumble. Po purvo vonių nuvalo savo kailį į šiurkštų medžio kamieną (Belova,
2007). Šernai paprastai gyvena bandomis. Jas dažniausiai sudaro patelė (kartais kelios patelės) su
jaunikliais ir keletu antramečių šernų mažiausiai 6 daugiausiai gali būti 22 žvėrys. Vasarą –
rudens pradžioje bandos mažiausios, vidutiniškai 5 žvėrys. Žiemą kelios bandos susijungia į
didesnius būrius, priimami ir žuvusių patelių jaunikliai. Patinai laikosi pavieniui, išskyrus rujos
periodą (Baleišis, 2002).
10