Study on mycosporine-like amino acids (MAAs) in cyanobacteria

174 Pages·2009·2.59 MB·English

Study on mycosporine-like amino acids (MAAs) in cyanobacteria: A
biochemical, bioinformatics and molecular biology approach

Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades

vorgelegt von
Shailendra Pratap Singh
aus Lakhimpur-kheri (Indien)
I
Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität
Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 09-10-09
Vorsitzender der
Promotionskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. D.-P. Häder
Zweitberichterstatter: Dr. R.P. Sinha
II
ACKNOWLEDGEMENTS
I would like to express my deep and sincere gratitude to Prof. Dr. Donat-Peter Häder for
giving me an opportunity to work with him. His wide knowledge and logical way of thinking
have been of great value for me. His understanding, encouraging and personal guidance have
provided a good basis for the present thesis.
I would like to convey my gratitude to Dr. Rajeshwar Prasad Sinha for his moral support,
inspiration and guidance throughout the study. I am also grateful to Dr. Manfred Klisch for
his advice and fruitful discussion.
I am thankful to Dr. Viktor Daiker for teaching me the molecular biology techniques. I am
also grateful to PD Dr. Michael Lebert, Dr. Peter Richter, Sebastian M. Strauch, Roland
Richter, Hoda Ahmed, Stephnie Wohllebe, Adeel Nasir, Azizullah Azizullah, Martin
Schuster, Ulrike Trenz, Jennifer Tebart, Eva Akins, Monica Bauer, Sabine Seeler, Nining
Zrinski, Norbert Meßner and Oliver Weisert for their assistance in numerous ways.
I would like to thank Prof. C.P. Wolk, Plant Research Laboratory, Michigan State University,
East Lansing, USA for providing pRL443, pRL648 and pRL623 plasmids. I am also thankful
to Dr. Jose I. Carreto, Instituto Nacional de Investigación y Desarrollo Pesquero (INIDEP),
Paseo Victoria Ocampo, Argentina for the identification of MAA palythine-serine.
Last but not least, I am thankful to my parents and all family members for their constant
encouragement and love throughout my study.
III
ZUSAMMENFASSUNG
Cyanobakterien sind einfache Sauerstoff produzierende Prokaryoten, die bereits auf der Erde
auftraten, bevor es eine Ozonschicht gab, die sie vor schädlicher ultravioletter Strahlung
(UVS) schützen konnte. UVS hat sowohl direkten als auch indirekten Einfluss auf diese
Organismen, da sie einerseits von Biomolekülen wie der DNA absorbiert wird, andererseits
aber auch oxidativen Stress (durch Sauerstoffradikale, reactive oxygen species, ROS), er-
zeugt. Der fortschreitende Abbau der Ozonschicht führte bisher zu einem Anstieg der
Strahlung auf der Erdoberfläche insbesondere im UV-B-Bereich (UV-B, 280 – 315 nm), der
die photochemischen und photobiologischen Prozesse in Cyanobakterien hemmt.
Die Verminderungs- und Abwehrmechanismen, die die Cyanobakterien entwickelt haben, um
den Beschädigungen durch UVS entgegenzuwirken, umfassen Vermeidung, Entfernung von
ROS, Filterung von UVS und Reparatur von z. B. DNA-Schäden. Das Herausfiltern von
gefährlicher UVS durch UV-absorbierende Verbindungen wurde von verschiedenen
Cyanobakterien als Abwehrmechanismus unter langer UV-Exposition entwickelt. Mykospo-
rinartige Aminosäuren (mycosporin-like amino acids, MAA) stellen eine Familie von über 20
Verbindungen mit einem Absorptionsmaximum zwischen 310 und 362 nm. Diese für ihre
UV-filternden Eigenschaften bekannte Stoffgruppe scheint einen Selektionsvorteil darzustel-
len, kommt sie doch in verschiedenen Organismen, auch in Cyanobakterien, vor.
Das Cyanobakterium Anabaena variabilis PCC 7937 synthetisiert nur eine einzige MAA, das
Shinorin (Retentionszeit 2,3 min, Absorptionsmaximum bei 334 nm nach Isolation und
Aufreinigung in einer HPLC (high-performance liquid chromatography)). Obwohl sich nach
72 h Exposition unter einem 395-nm- oder einem 320-nm-cut-off-Filter bereits eine
signifikante Steigerung der MAA-Induktion ergab, war diese noch einmal signifikant erhöht,
wenn die Zellen unter einem 295-nm-cut-off-Filter exponiert wurden. Hitze hatte keinen
Einfluss auf die MAA-Induktion, gleich ob mit oder ohne UVS. Dagegen hatten erhöhte Salz-
IV
und Ammoniumkonzentrationen einen synergistischen Effekt zusammen mit UVS. Die
MAA-Synthese wurde durch Salz und Ammonium konzentrationsabhängig induziert, und
zwar unabhängig vom UV-Stress. Dies deutet darauf hin, dass MAAs in Cyanobakterien
möglicherweise noch andere Funktionen als Strahlungsschutz haben und die Synthese von der
Menge verfügbaren Stickstoffs abhängt.
Die Untersuchungen zur Induktion von Shinorin in A. variabilis PCC 7937 in verschiedenen
Kulturmedien (BGA-, BGA+, BG11 und Allen und Arnon’s) wurden mit dem Ziel angestellt,
das Medium zu finden, das für die MAA-Synthese am besten geeignet ist und auch im
industriellen Maßstab zur Gewinnung dieser multifunktionalen Verbindungen dienen kann.
Dabei wurde auch die photosynthetische Aktivität unter den Induktionsbedingungen in allen
Medien gemessen. Der Shinoringehalt und die photosynthetische Aktivität (der yield) war im
BG11-Medium am höchsten verglichen mit den anderen Ansätzen nach 72 h Exposition
(2948,73 ± 61,13 nmol/g Trockengewicht und 0,47 ± 0,01 gegenüber 1076,08 ± 21,77 nmol/g
Trockengewicht in BGA-, 1320,07 ± 98,19 nmol/g Trockengewicht in BGA+ und 554,64
± 16,47 nmol/g Trockengewicht in Allen und Arnon’s). Medien mit einer Stickstoffquelle
unterstützen also die MAA-Synthese und können für die Massenproduktion von MAAs aus
Cyanobakterien eingesetzt werden.
Anabaena doliolum ist ein Cyanobakterium, das in Reisfeldern vorkommt. Sein MAA-Profil
wurde nach Kultur unter photosynthetisch aktiver Strahlung (photosynthetic active radiation,
PAR) und PAR + UVS untersucht. Mit Hilfe einer HPLC-Analyse der wasserlöslichen
Inhaltsstoffe wurden drei MAAs gefunden: Mykosporin-Glycin (λ = 310 nm), Porphyra-
max
334 (λ = 334 nm) und Shinorin (Retentionszeiten: 4,1 min, 3,5 min, 2,3 min). Dies ist der
max
erste Befund eines Auftretens von Mykosporin-Glycin und Porphyra-334 zusammen mit Shi-
norin in einem Anabaena-Stamm. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass Mykosporin-Glycin
(einfach N-substituiert) ein Vorläufer bei der Biosynthese der doppelt N-substituierten MAAs
Porphyra-334 und Shinorin ist. Mykosporin-Glycin war dabei unter konstituiver Kontrolle,
V
während Synthese von Porphyra-334 und Shinorin von UV-B induziert wurde, was eine
Beteiligung von UV-regulierten Enzymen bei der Biotransformation von MAAs nahelegt.
Das aus einer heißen Quelle isolierte Cyanobakterium Anabaena flos-aquae synthetisiert nur
Shinorin, wie eine HPLC-Analyse ergab, ähnlich wie andere Anabaena-Stämme, außer A.
doliolum. In allen Kulturansätzen, die mit PAR, PAR + UV-A oder PAR + UV-A + UV-B
bestrahlt wurden, zeigte sich eine signifikante MAA-Induktion, wobei sie in dem Ansatz
PAR + UV-A + UV-B nach 72 h am höchsten war. Die MAA-Synthese hängt nur insofern
von der Photosynthese ab, als dass diese die Kohlenstoffquelle darstellt; der inhibitorische
Effekt von DCMU auf die MAA-Synthese konnte durch die Zugabe von von außen zugege-
bener Fruktose aufgehoben werden. Trotzdem kann nicht ausgeschlossen werden, dass die zur
Synthese benötigte Energie aus dem Photosystem I stammt. Die Untersuchung zeigt auch,
dass photoheterotrophe Kulturbedingungen (DCMU + Fruktose) die MAA-Synthese am
besten unterstützt verglichen mit photoautotrophen und photomixotrophen Ansätzen. Ent-
sprechend könnten photoheterotrophe Kulturen zur industriellen Produktion pharmazeutisch
wichtiger MAAs durch Cyanobakterien genutzt werden.
Es stellte sich heraus, dass die Biokonversion von primären in sekundäre MAAs bei A.
variabilis PCC 7937 von Schwefelmangel reguliert wird. Dieses Cyanobakterium syntheti-
siert unter normalen Bedingungen die primäre MAA Shinorin, während bei Schwefelmangel
die sekundäre MAA Palythin-Serin erscheint (Retentionszeit = 3,9 min, λ = 320 nm). Eine
max
Methioninzugabe zu schwefellosen Kulturen führt zu einem Verschwinden des Palythin-
Serin, was einen Hinweis gibt auf die Rolle der primären MAA bei Schwefelmangel. Dies ist
der erste Beleg der Synthese von Palythin-Serin bei Cyanobakterien; bisher war dies nur bei
Korallen bekannt. Die Zugabe von Methionin beeinflusste auch das Verhältnis zwischen der
Mykosporin-Glycin-Biosynthese und dessen Konversion zu Shinorin, so dass nach Zugabe
von Methionin Mykosporin-Glycin nachweisbar wurde. Die Ergebnisse deuten auch darauf
hin, dass Palythin-Serin aus Shinorin durch Decarboxylierung und Demethylierung seiner
VI
Gycinuntereinheit aufgebaut wird. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wird folgender
Mechanismus vorgeschlagen: eine Glycindecarboxylase katalysiert möglicherweise die
Decarboxylierung und Demethylierung der Gycinuntereinheit des Shinorin. Anschließend
wird die Methylgruppe auf ein Tetrahydrofolat übertragen, das letztlich an der Regeneration
des Methionin unter Schwefelmangelbedingungen beteiligt ist.
Vier verschieden Cyanobakterien, A. variabilis PCC 7937, Anabaena sp. PCC 7120,
Synechocystis sp. PCC 6803 und synechococcus sp. PCC 6301 wurden auf ihre Fähigkeit hin
untersucht, MAAs zu produzieren. Genomische und phylogenetische Untersuchungen wurden
durchgeführt, um diejenigen Gene zu identifizieren, deren Produkte möglicherweise an der
Biosynthese dieser Verbindungen beteiligt sind. A. variabilis PCC 7937 war der einzige der
vier Organismen, der zur MAA-Produktion fähig war. Genomanalysen identifizierten eine
Reihe von Genen, YP_324358 (eine mögliche DHQ synthase) und YP_324357 (O-
Methyltransferase), die nur in A. variabilis PCC 7937 vorkam und nicht in den anderen
untersuchten Cyanobakterien. Eine phylogenetische Auswertung ergab, dass diese beiden
Gene durch lateralen Gentrasfer von Cyanobakterien über Dinoflagellaten bis zu Metazoen
weitergegeben wurden. Alle andere Cyanobakterien mit diesen beiden Genen hatte auch eine
weitere Kopie des DHQ-Synthasegens. Die vorhergesagte Proteinstruktur des Genprodukts
von YP_324358 legte nahe, dass es sich von der chemisch charakterisierten DHQ-Synthase
aus Aspergillus nidulans unterschied. Im Gegensatz dazu war YP_324879 der A. nidulans-
DHQ-Synthase ähnlich. Darauf aufbauend wurde vorgeschlagen, dass die Genprodukte von
YP_324358 und YP_324357 an der Synthese einer gemeinsamen Grundstruktur
(Deoxygadusol) aller MAAs beteiligt sind. Daher wurde in einem weiteren Schritt die DHQ
in A. variabilis PCC 7937 mit Hilfe von tri-parentaler Konjugation als Gentransfermethode
ausgeschaltet. Der Versuch, eine YP_324358-Mutante von A. variabilis PCC 7937 durch
insertionelle Mutagenese zu erzeugen, schlug fehl, da sich die Mutanten und Wildtypen nicht
vollständig trennten. Somit konnte auch nicht die Rolle dieses Genprodukts bei der MAA-
VII
Biosynthese geklärt werden. Der Ansatz, Produkte des Shikimatweges zuzusetzen war auch
erfolglos und nur ein teilweise abgetrennter merodiploider Mutantenstamm von A. variabilis
PCC 7937 wurde nach einigen Generationszyklen unter Selektionsdruck erhalten. Daher stellt
möglicherweise die Expression von YP_324358 zusammen mit YP_324357 in anderen, nicht
zur MAA-Synthese fähigen Cyanobakterien oder in E. coli eine Möglichkeit dar,
herauszufinden, ob diese Gene in die MAA-Biosynthese involviert sind oder nicht.
VIII
ABSTRACT
Cyanobacteria are primitive photosynthetic oxygen-evolving prokaryotes that appeared on the
Earth when there was no ozone layer to protect them from damaging ultraviolet radiation
(UVR). UVR has both direct and indirect effects on the cyanobacteria due to absorption by
biomolecules and UVR-induced oxidative stress, respectively. Continuous depletion of the
stratospheric ozone layer has resulted in an increase in ultraviolet-B (UV-B; 280 – 315 nm)
radiation on the Earth’s surface which inhibits photochemical and photobiological processes
in cyanobacteria. However, these organisms have developed several lines of mitigation
strategies/defence mechanisms such as avoidance, scavenging, screening and repair to
counteract the damaging effects of UVR. Screening of damaging UVR by UV-absorbing
compounds has been developed by several cyanobacteria as a defense mechanism under
prolonged UVR exposure. Mycosporine-like amino acids (MAAs) are a family of more than
20 compounds having absorption maxima between 310 – 362 nm. These compounds are well
known for their UV-absorbing/screening roles in various organisms, including cyanobacteria,
and seem to have evolutionary significance.
The cyanobacterium Anabaena variabilis PCC 7937 was found to synthesize a single MAA,
shinorine (retention time = 2.3 min and absorption maximum at 334 nm) when isolated and
purified by high-performance liquid chromatography (HPLC). Although there was significant
induction of MAA synthesis from its initial value under 395 or 320 nm cut-off filters, MAA
induction was significantly more pronounced in samples covered with 295 nm cut-off filters
after 72 h of exposure. Heat as a stress factor had no effect on MAA induction with or
without UVR. In contrast, salt and ammonium treatment had synergistic effects with UVR
stress. MAA synthesis was also induced by salt and ammonium in a concentration-dependent
manner without UV stress in samples covered with 395 nm cut-off filters. The results indicate
IX
that MAAs may have other functions in addition to photoprotection in cyanobacteria and its
synthesis is also regulated by available nitrogen.
The study of induction of shinorine in A. variabilis PCC 7937 in various culture media
(BGA-, BGA+, BG11 and Allen and Arnon’s) was performed to select the most appropriate
medium that can support the highest synthesis of MAA, and can be used for industrial
production of these multifunctional compounds. Also, in vivo photosynthetic activity was
measured under shinorine inducing conditions in all media. The shinorine content and
photosynthetic activity (yield) were highest (2948.73 ± 61.13 nmol/g dry wt and 0.47 ± 0.01,
respectively) in BG11 medium in comparison to others after 72 h of exposure to UV
radiation. After the same duration of irradiation the shinorine content was 1076.08 ± 21.77,
1320.07 ± 98.19 and 554.64 ± 16.47 nmol/g dry wt in BGA-, BGA+, and Allen and Arnon’s
media, respectively. Thus, growth media with a nitrogen source supports higher synthesis of
MAA and can be used for mass production of MAA from cyanobacteria.
The MAA profile of a rice-field cyanobacterium, Anabaena doliolum, was studied under PAR
and PAR + UVR conditions. The HPLC analysis of water-soluble compounds reveals the
biosynthesis of three MAAs, mycosporine-glycine (λ = 310 nm), porphyra-334 (λ = 334
max max
nm) and shinorine, with retention times of 4.1, 3.5 and 2.3 min, respectively. This is the first
report for the occurrence of mycosporine-glycine and porphyra-334 in addition to shinorine in
Anabaena strains studied so far. The results indicate that mycosporine-glycine (mono-
substituted) acts as a precursor for the biosynthesis of the bi-substituted MAAs shinorine and
porphyra-334. Mycosporine-glycine was under constitutive control while porphyra-334 and
shinorine were induced by UV-B radiation, indicating the involvement of UV-regulated
enzymes in biotransformation of the MAA.
The cyanobacterium Anabaena flos-aquae isolated from a hot spring was found to synthesize
a single MAA shinorine as purified by high-performance liquid chromatography, similar to
other Anabaena strains, except A. doliolum. There was significant induction of MAA
X