Structural studies of Heteromeric Amino acid Transporters (HATs)

265 Pages·2015·14.77 MB·English

Structural studies of Heteromeric Amino acid
Transporters (HATs): Validation of the first 3D
structural model of a HAT (human 4F2hc/LAT2) and
identification of new HAT targets
‐
for 3D crystallization

Mª Elena Álvarez Marimón

ADVERTIMENT. La consulta d’aquesta tesi queda condicionad a a l’acceptació de les següents condicions d'ús: La difusió
d’aquesta tesi per mitjà del servei TDX (www.tdx.cat) i a través del Dipòsit Digital de la UB (diposit.ub.edu) ha estat

autoritzada pels titulars dels drets de propietat intel·lectual únicament per a usos privats emmarcats en activitats
d’investigació i docència. No s’autoritza la seva reproducció am b finalitats de lucre ni la seva difusió i posada a disposició
des d’un lloc aliè al servei TDX ni al Dipòsit Digital de la UB. No s’autoritza la presentació del seu contingut en una finestra

o marc aliè a TDX o al Dipòsit Digital de la UB (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant al resum de presentació de
la tesi com als seus continguts. En la utilització o cita de parts de la tesi és obligat indicar el nom de la persona autora.

ADVERTENCIA. La consulta de esta tesis queda condicionada a la aceptación de las siguientes condiciones de uso: La
difusión de esta tesis por medio del servicio TDR (www.tdx.cat) y a través del Repositorio Digital de la UB
(diposit.ub.edu) ha sido autorizada por los titulares de los derechos de propiedad intelectual únicamente para usos
privados enmarcados en actividades de investigación y docencia. No se autoriza su reproducción con finalidades de lucro
ni su difusión y puesta a disposición desde un sitio ajeno al servicio TDR o al Repositorio Digital de la UB. No se autoriza
la presentación de su contenido en una ventana o marco ajeno a TDR o al Repositorio Digital de la UB (framing). Esta
reserva de derechos afecta tanto al resumen de presentación de la tesis como a sus contenidos. En la utilización o cita de
partes de la tesis es obligado indicar el nombre de la persona autora.

WARNING. On having consulted this thesis you’re accepting the following use conditions: Spreading this thesis by the
TDX (www.tdx.cat) service and by the UB Digital Repository (diposit.ub.edu) has been authorized by the titular of the
intellectual property rights only for private uses placed in investigation and teaching activities. Reproduction with lucrative
aims is not authorized nor its spreading and availability from a site foreign to the TDX service or to the UB Digital
Repository. Introducing its content in a window or frame foreign to the TDX service or to the UB Digital Repository is not
authorized (framing). Those rights affect to the presentation summary of the thesis as well as to its contents. In the using or
citation of parts of the thesis it’s obliged to indicate the name of the author.
Aquesta tesis ha estat realitzada al Institut de Recerca Biomèdica (IRB Barcelona)  
Dins el programa de Doctorat de Biotecnologia de la Universitat de Barcelona (UB) 
Facultat de Biologia, Departament de Bioquímica i Biologia Molecular (UB) 
Structural studies of Heteromeric Amino acid Transporters (HATs): 
Validation of the first 3D structural model of a HAT (human 4F2hc/LAT2) 
and identification of new HAT targets for 3D‐crystallization 
Memòria per optar al grau de Doctora per la Universitat de Barcelona presentada per: 
Mª ELENA ÁLVAREZ MARIMON 
Barcelona, 2014

Dedico aquesta tesi a les persones més importants:
als meus pares, pel seu gran carinyo i recolzament
incondicional que ha permés que arribés fins aquí,
per ser els millors pares que es pugui tenir!
així com a Rubén per fer-me tant feliç

Contents
Introduction  2 
............................................................................................................................................................................................................................
1. Membrane protein transporters 2
..........................................................................................................................................................
1.1. Transport across the plasma membrane  2 
............................................................................................................
1.2. Solute Carrier Transporters (SLC) 5 
 ................................................................................................................................
1.3. Importance of getting the 3D‐structure of membrane proteins 7 
.................................................
1.4.   Amino acid transporters and their physiological relevance   8 
..........................................................
2. Heteromeric Amino acid Transporters (HATs) 11
 ...................................................................................................................
2.1.    rBAT and its heterodimers 14 
..............................................................................................................................................
2.1.1.  rBAT/b0,+AT (system b0,+)  14 
  .................................................................................................................................
2.1.2.   rBAT/AGT1 15 
.........................................................................................................................................................................
2.2.    4F2hc and its heterodimers 16 
...........................................................................................................................................
2.2.1.   System L 17 
.  ............................................................................................................................................................................
2.2.1.1.  4F2hc/LAT1 17 
......................................................................................................................................
2.2.1.2.  4F2hc/LAT2 20 
.....................................................................................................................................
2.2.2.   System y+L 20 
 ........................................................................................................................................................................
2.2.2.1.  4F2hc/y+LAT1 21 
................................................................................................................................
2.2.2.2.  4F2hc/y+LAT1 21 
................................................................................................................................
2.2.3.  System asc  22 
.......................................................................................................................................................................
2.2.2.1.  4F2hc/asc1 22 
.......................................................................................................................................
2.2.4.  System X‐ 22 
c...........................................................................................................................................................................
2.2.4.1.  4F2hc/xCT 22 
..........................................................................................................................................
2.3.    Light subunits with unknown heavy subunits  24 
............................................................................................
2.3.1.  asc2 24 
...........................................................................................................................................................................................
2.3.2.  arpAT 24 
............................................................................................. .........................................................................................
3. Structural information about HATs 26
...............................................................................................................................................
3.1.    Structure of heavy subunits  26 
..........................................................................................................................................
3.2.    Light subunit paradigm structures  30 
.........................................................................................................................
3.2.1.  The LeuT fold  31 
.................................................................................................................................................................
3.2.2.  The closest paradigm to HAT light subunits:  AdiC  32 
..................................................................
3.2.3.  The alternative access mechanism of prokaryotic transporters with   
LeuT fold  34 
............................................................................................................................................................................
3.2.4.  Closest bacterial SLC7 transporter characterized: SteT  36 
......................................................
3.3.    Interaction between subunits  37 
....................................................................................................................................
Objectives 43 
.................................................................................................................................................................................................................................
i
Chapter I:  Validation of the first low resolution 3D model of human 4F2hc/LAT2 
by intersubunit crosslinking 
I.   Introduction 47 
................................................................................................................................................................................................... 
I.   Results  53 
....................................................................................................................................................................................................................
I.1.  Crosslinking of 4F2hc‐ED and LAT2 and docking analysis   53 
.......................................................................
I.1.1. Residues selected in LAT2 and 4F2hc to perform intersubunit cysteine 
crosslinking assays  53 
...........................................................................................................................................................................
I.1.2. Validation of new mutants, previous crosslinking assays, by checking 
heterodimerization and functionality 55 
.......................................................................................................................... 
I.1.3. Crosslinking assays with the validated mutants  57 
.................................................................................
I.1.4. Human LAT2 model from AdiC and multialignment  57 
…………….........................................................
I.1.5. Docking confirmation and guidance for new crosslinking pair positions 60 
…………........
I.2.  4F2hc increases the stability of LAT2 66 
…………………………………………………………………………………………………….................... 
I.2.1. The ectodomain of the heavy subunit 4F2hc increases the stability of LAT2  68 
.......
I. Discussion 71 
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
I. Materials & Methods  79 
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..…
I.1.  Cloning of human 4F2hc and human LAT2 for mammalian cell expression  79 
..........................
I.2.  Generation of cysteine mutants for intersubunit crosslinking by site‐directed 
mutagenesis 81 
........................................................................................................................................................................................
 I.3.  Transitory co‐transfection in HEK 293 T 82 
......................................................................................................................
I.4.  Protein purification from HEK 293T cells. 82 
..................................................................................................................
I.5.  4F2hc‐LAT2 intersubunit crosslinking 83 
……………………………………………………………………………………………............................
I.6.  Western blot analysis 84 
....................................................................................................................................................................
I.7.  Transport of L‐Alanine in HEK 293T cells  85 
..................................................................................................................
I.8.  4F2hc‐ED overexpression in Escherichia coli and purification 85 
..............................................................
I.9.  Human LAT2 overexpressed in Pichia pastoris membrane extraction 86 
.........................................
I.10. 4F2hc‐ED impact on solubilization/stability of LAT2 overexpressed in P.pastoris 87 
….......
I.11. Bioinformatic tools 87 
...........................................................................................................................................................................
Chapter II: Identification of new HAT targets for 3D crystallization 
II. Introduction 93
................................................................................................................................................................................................... 
II. Results 101
...................................................................................................................................................................................................................
II.2.  Protein expression screening in Saccharomyces cerevisiae 101 
.......................................................
ii
II.3.  Membrane protein‐detergent solubilization screening 104 
.................................................................
II.4.  Membrane protein stability assay by Ultracentrifugation Dispersity  
Sedimentation (UDS) screening 106 
..............................................................................................................................
II.5.  Light subunit stability assay by Fluorescent Size‐Exclusion Chromatography 108 
.........
II.6.  Protein purification and size exclusion chromatography analysis 112 
.......................................
II.7.  Expressing the best light subunit candidates in Pichia pastoris 116 
.............................................
II.8.  Improvement of b0,+AT stability for 3D crystallization by lipid addition 117 
........................
II.9.  Expression and purification of b0,+AT (X.T.) in insect cells 119 
............................................................
II.10.  Improvement of b0,+AT molecule by mutagenesis and generation of truncated 
versions 120 
...........................................................................................................................................................................................
II.11.  First 3D‐crystallization trial of C150A b0,+AT (28 Cterm) 123 
 ...........................................................
II. Discussion 129
....................................................................................................................................................................................................... 
II. Materials & Methods 141
.....................................................................................................................................................................
II.1.   Selected cDNAs of eukaryotic light subunits to be expressed in S. cerevisiae 141 
……...
II.2.   Cloning eukaryotic light subunits cDNAs into GFP‐8His‐containing vector  142 
……..…....
II.3.   Preparation of S. cerevisiae competent cells and transformation 143 
………………………..………….
II.4.   Screening light subunit overexpression using whole‐cell fluorescence  144 
………………......
II.5.   Confirmation of the integrity of GFP‐tagged light subunits by  
in‐gel fluorescence 145 
……………………………………….………………………………………………………………………………………………………………..
II.6.   Evaluation of the detergent solubilization efficiency on membranes containing 
overexpressed GFP‐tagged eukaryotic light subunits 145 
………………………………………………….……………....
II.7.   Study  of  the  GFP‐tagged  eukaryotic  light  subunits  stability  by  the 
Ultracentrifugation Dispersity Sedimentation Assay (UDS) 147 
 …………………………………………….……..
II.8.   Analysis  of  the  GFP‐tagged  eukaryotic  light  subunits  monodispersity  by 
Fluorescence Size Exclusion Chromatography (FSEC) 147 
 ………………………………………………………………....
II.9.   Purification of eukaryotic light subunits and monodispersity analysis by SEC 147 
………
II.9.a.   TEV protease overexpression and purification 149 
………….……………………………………………… 
II.10.   GFP‐fusion light subunits overexpressed in Pichia pastoris  150 
………..………………………………..……
II.11.   Baculovirus‐Insect Cell Expression system  150 
………………………………………….…………………………………………………
II.11.a.   Growth and maintenance of the Sf9 cell line  151 
……………………………..……………………………..…
 II.12.   Expression of Xenopus b0,+AT in the Sf9 insect cell line 152 
…………….……………………………………………..…
II.12.a.   Cloning Xenopus b0,+AT into pFastBac vector  153 
……………………………………………………..….…
II.12.b.  Transformation of DH10Bac E. coli cells with the pFastBac‐  
b0,+AT constructs  153
……………………………………………………………………….…………………………………….………………..……………………………  
II.12.c.   Isolation of the recombinant bacmid DNA from DH10Bac 
E. coli cells 153 
……………………………………………………………………………………………………………………………………………………....
iii
II.12.d.  Transfection of Sf9 cells with the recombinant bacmid DNA 154 
….
II.12.e.   Infection of Sf9 cells with P1 virus 154 
…………………………………………………………………..…
II.13.   Baculovirus titration by the end point dilution assay 155 
……………………………………........................….……
II.14.  Expression of truncated versions of C150A b0,+AT overexpression  
and cell membrane extraction 155 
……………………………………………………………………………………………………………………….……
II.15.   In‐gel‐fluorescence and FSEC to analyze protein expression and stability 156 
………..……
II.16.   Large scale expression of b0,+AT C150A (Δ28 CTER) and purification 156 
………………………….…
II.16.a. Buffer preparation for b0,+AT C150A (Δ28 CTER) purification 157 
………………………….…
II.16.b. Solubilization, purification and preliminary 3D‐crystallization  
screening of C150A b0,+AT (Δ28 CTER) 157 
 …………………………………………………………………………………………………..……
Conclusions  161 
…………………………………………............................................................................................................................................................................
Annexes 163 
………………………………………..............................................................................................................……………………………................................................
Annex I: Molecular biology  165 
................................................................................................................................................................
Annex II: Publications 169 
 ……………………………………...................................................................................................................................... 
Annex III: Summary in Spanish 201 
....................................................................................................................................................... 
Bibliography  221 
………………………………………............................................................................................................................................................................ 
iv
List of Figures 
Figure 1. Cartoon of membrane transporters in a cell. 5 
Figure 2.  Representation of membrane protein solved structures relative to each year.  7 
Figure 3.  Representation of membrane protein solved structures belonging to the SLC  8 
family relative to each year. 
Figure 4.  Topology model of human 4F2hc/LAT1 (SLC3A2/SLC7A5) as a representative  11 
member of HAT proteins. 
Figure 5.  4F2hc‐ED structure.  26 
Figure 6.  rBAT‐ED 3D‐model.  27 
Figure 7  4F2hc‐ED electrostatic surface monomer in the monoclinic structure (2DH2)  28 
Figure 8.  Homodimer of 4F2hc ectodomain (PDB 2D43) with a zinc atom coordinated.  28 
Figure 9.  Cys330 location in 4F2hc‐ED and analysis of the mobile areas by B factor data.  30 
Figure 10.  Topology of the LeuTAa. 31 
Figure 11.  Structure of AdiC‐ N101A bound to Arg+. 33 
Figure 12.  Proposed mechanism of substrate (Arginine) recognition and induced fit by  34 
AdiC. 
Figure 13.  Conformational states of the alternative access mechanism of prokaryotic  35 
transporters with LeuT fold. 
Figure 14.  Single particles of detergent‐solubilized and purified SteT were visualized by  36 
negative staining transmission electron microscopy (TEM). 
Figure 15.  Interaction between chimeras generated of 4F2hc and CD69and integrins or  38 
with amino acid transporters indicated by transport function. 

Figure 16. Expression,  function  and  solubilization  of  the  human  heterodimer  47 
4F2hc/LAT2. 
Figure 17.  Transmission Electron Microscopy and Single Particle Analysis (TEM‐SPA).  48 
Figure 18.  TEM  image  refinement  (A)  and  gallery  of  the  different  single  particle  48 
projections class average (B) 
Figure 19.  3D reconstruction of 4F2hc/LAT2 calculated from projections of negatively  49 
stained heterodimer particles. 
Figure 20.  Reconstitution into liposomes of 4F2hc/LAT2 and LAT2. 50 
Figure 21.  Reactive cysteines of human LAT2 located on SteT 3D model based on AdiC  52 
structure 
Figure 22.  Representation of the different serine to cysteine mutants of 4F2hc‐ED  52 
generated on a background C330S conserving the Cys 109 responsible for the 
disulphide bridge. 
Figure 23.  Heterodimer formation and amino acid transport in HEK 293T cells co‐ 53 
transfected with 4F2hc C330S and LAT2 wild‐type. 
Figure 24.  Heterodimer formation and amino acid transport in HEK 293T cells co‐ 54 
transfected with 4F2hc and LAT2 mutants. 
Figure 25.  Intersubunit crosslinking between 4F2hc and LAT2.   55 
v