Stadien der Flugmuskelgenese holometaboler Insekten

26 Pages·1983·0.655 MB·German

by  Dr. rer. nat. Klaus Lehmann (auth.)

FORSCHUNGSBERICHTE DES LANDES NORDRHEIN-WESTFALEN
Nr. 3156 / Fachgruppe Physik/Chemie/Biologie
Herausgegeben vom Minister für Wissenschaft und Forschung
Dr. rer. nat. Klaus Lehmann
Zoologisches Institut der
Universität zu Köln
Stadien der Flugmuskelgenese
holemetaboler Insekten
Springer Fachmedien Wiesbaden GmbH 1983
CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek
Lehmann, Klaus:
Stadien der Flugmuskelgenese halometaboler
Insekten / Klaus Lehmann. - Opladen : West
deutscher Verlag, 1983.
(Forschungsberichte des Landes Nordrhein
Westfalen ; Nr. 3156 : Fachgruppe Physik,
Chemie, Biologie)
ISBN 978-3-53l-03156-9
NE: Nordrhein-Westfalen: Forschungsberichte
des Landes •••
© 1983 by Springer Fachmedien Wiesbaden
Ursprünglich erschienen bei Westdeutscher Verlag GmbH, Opladen 1983
Herstellung: Westdeutscher Verlag
ISBN 978-3-531-03156-9 ISBN 978-3-663-19728-7 (eBook)
DOI 10.1007/978-3-663-19728-7
Inhalt
1. Das Flugmuskelsystem der Insekten
2. Die Myogenese in vivo {K. Lehmann) 2
3. Die in vitro Myogenese von Flugmuskelmyoblasten 4
{G. Zwadlo, K. Lehmann)
4. Die Aktivierung von Aktomyosin- und Mitochondrien
ATPasen im sich entwickelnden Fl9~muskel 6
{K. Lindemann, K. Lehmann)
5. Ausblick und Zusammenfassung 7
6. Literatur 10
7 . Abbildungen 13
8. Tabellen 21
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1. Das Flugmuskelsystem der Insekten
Muskeln oder muskelähnliche Strukturen bewirken in der Tierwelt
die Bewegung. Dabei sind die Grundprinzipien des muskulären
Energieumwandlungsapparates für alle Lebenwesen ähnlich, der
bei den Wirbeltieren und Insekten als quergestreifte Muskulatur
seine Vollendung erreicht.
Oft sind in der individuellen Entwicklung eines Lebewesens
Veränderungen in der Art der Fortbewegung zu beobachten. Diese
haben einen Ab- und Aufbau bestimmter Muskeln zur Folge. So er
möglichen im Thorax der Schwärmer (Lepidoptera, Sphingidae)
innere und äußere Merkmalsänderungen während der Metamorphose
den Aufbau einer hochleistungsfähigen Flugmuskulatur. Der auf
triebserzeugende Flügelabschlag wird im imaginalen Thorax durch
den dorsalen Längsmuskel (dlm-1) des 2. und 3. Thoraxsegments
erzeugt, während die antagonistische Bewegung durch mehrere dor
soventrale Muskeln hervorgerufen wird. Diese Muskeln nehmen im
Thorax fliegender Insekten den größten Raum ein. Sie inserieren
an kutilären Phragmata zwischen den Segmentgrenzen bzw. be
stimmten Kutikulaarealen von Coxa, Sternum und Noturn der Thorax
segmente (Seifert 197o, Weber 1953).
Insgesamt stellen diese Flugmuskeln ein System quergestreifter
Muskulatur des fibrillären, "close-packed" Typs dar (Pringle,
1957). Sie werden in der Metamorphose nach klar determiniertem
Muster aufgebaut.
Neben der Frage nach dem Aufbau des streng geordneten Systems
der Muskulatur, die mit Insekten als Versuchstieren u.a. wegen
der fehlenden Immunantwort der Individuen und der schnellen Ge
nerationsfolge gut zu bearbeiten ist, beschäftigt die Ent
wicklungsphysiologie folgende Probleme:
a) Nach welchem Muster sind die Strukturen der imaginalen
Flugmuskeln mit ihren spezifischen Insertionen angelegt?
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b) Wie stellt sich biochemisch der Aufbau der Sarcomerstruk
tur dar und sind bestimmte Proteine des Aktemyosins re
qulierend daran beteiligt?
c) Wann sind diese Muskeln funktionsfähig, bzw. wann sind
die ATP-synthetisierenden und -verbrauchenden Mechanismen
dafür vorhanden?
d) Ist dieser Entwicklungsablauf von der Wirkungsweise von
Hormonen oder anderer Wachstumsfaktoren abhängig?
2. Die Myogenese in vivo
Die Flugmuskeldifferenzierung nimmt ihren Ausgang mit aus
Flügelimaginalscheiben auswandernden mesodermalen Zellen wie
bei Drosophila beschrieben (Lawrence and Brower, 1982). Bei
Manduca sexta sind diese Zellen wie auch bei der ~-1yogenese
von Ephestia Kühniella nach einer Migrationsphase als post
mitotische Myoblasten (Abb. 1c) in Zentren aggregiert (Lehmann,
K., 1973). Sie sind im Thorax kurz nach der Verpuppung erkenn
bar, während die larvale Muskulatur zu diesem Zeitpunkt bis
auf wenige Muskelreste nicht mehr vorhanden ist (Lehmann et
al 197 8) •
Die dlm-1 Myoblasten von Manduca sexta fusionieren in Myoblas
tenzentren und wachsen als Fasern zu den Insertionen. Bis zum
Zeitpunkt der Querstreifung (am 14. von 22 Puppenentwicklungs
tagen) vergrößert sich die Zahl der Fasern pro Muskelquer
schnitt, der dlm-1 unterteilt sich in 5 Untereinheiten und die
Kerne der Fasern orientieren sich an die Faserperipherie
(Abb. 1 d-j) .
Die Bildung der Myofibrillenproteine verläuft wie bei der Myo
genese der Thoraxmuskulatur von Ephestia Kühniella (Lehmann
1976, b, c). Das mit immunologischen und elektrophoretischen
Methoden nachweisbare Fehlen larvaler Myofibrillenproteine in
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Thoraxmuskelhomogenaten früher Manduca-Puppen und der stufen
weise Nachweis imaginaler Myofibrillenproteine kurz vor dem
Auftreten der Querstreifung im histologischen Schnitt der neu
gebildeten dlm-1 zeigen den vollständigen Neuaufbau der Muskeln
und die de-novo Synthese der Myofibrillenproteine (Abb. 2 A, B).
Die SOS-Gel-Elektrophorese weist die Banden höhermolekularen
Molekulargewichts zuerst nach. Diese Entwicklugn steht im Ge
gensatz zur Myogenese der Dipterenmuskeln, deren dlm-1 trans
formiert werden (Beinbrech 1968) und deren kontraktile Proteine
wohl erst in späteren Puppenstadien zu schon vorhandenen Struk
turen angelagert werden (Houlihan 1976).
Eine der Komponenten des Actomyosins von Invertebratenmuskeln
ist Paramyosin. Es ist ein Protein mit dem Molekulargewicht
1o7 ooo d (Bullard et al 1973) und befindet sich im Inneren des
Myosinfilaments (Szent-Györgyi 1971, Aust et al 198o). Seine
Funktion ist noch umstritten, doch wird ihm ein Einfluß auf die
Länge des Myosinfilaments während der Entwicklung von Muskula
tur zugeschrieben (Bullard et al, 1973, Lehmann, 198o). Neuere
Untersuchungen an der E 1214 Mutante des Nematoden Caenor
habeditis elegans unterstützen diese Vermutung (Mackenzie and
Epstein 198o, Waterstone et al 1977).
Nach der Paramyosin-Extraktion (Bullard et al 1973) wurde als
zusätzlicher Reinigungsschritt eine Passage durch eine Sephadex
G - 1oo Säule eingerichtet. Das so gereinigte Protein hatte ein
Molekulargewicht von 1o9 ooo d (Abb. 3) und seine Parakristalle
(Abb. 4A) zeigen eine durchschnittliche Periodizität von 728 A
(Lehmann 1981). Diese Resultate und die Aminosäurenzusammenset
zung von Manduca-Paramyosin stehen in Obereinstimmung mit den
Untersuchungen anderer Autoren (Bullard et al, 1973). Die gegen
Paramyosin hergestellten Antikörper zeigten in der Immundiffusion
gegen Paramyosin und Aktomyosin ein Immunpräcipitat (Abb. 4B).
Untersuchungen von Thoraxhomogenaten mit Hilfe immunoligischer
Methoden weisen vor allen anderen Myofibrillenproteinen Paramyo
sin einen Tag vor Myosin nach (Abb. 2A). In elektronenoptischen
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Untersuchungen der Puppenstadien nach dem Auftreten der Quer
streifung sind fast alle entstandenen Myosinfilamente, die Para
myosin enthalten sollten, in allen untersuchten Stadien elek
tronendicht gefüllt (Abb. 18 A + B, Lehmann, K., in Vorbereitung).
Das kann als Indiz für die Lokalisation von Paramyosin im Myosin
filament gelten. Zur Klärung dieser vermuteten entwicklungsför
dernden Funktion des Paramyosins in der Muskelentwicklung sind
elektronenoptische Untersuchungen mit peroxydasemarkierten
Paramyosinantikörpern während der dlm-1 Entwicklung in Arbeit.
3. Die in vitro Myogenese von Flugmuskelmyoblasten
Die Myogenese bietet auf Grund ihrer charakteristischen Merk
male, dem Ubergang einkerniger Zellen zu vielkernigen Syncytien
und der Ausbildung kontraktiler Strukturen, ein ideales System
zum Studium von Differenzierungs- und Ordnungsvorgängen. Das
trifft nicht nur für die gut untersuchte Vertebratenmyogenese
(Konigsberg 1963, Yaffee 1968, Hlotzer et al 1973 und 1974),
sondern auch für die Myogenese der Insekten zu. Doch scheiterten
detaillierte Untersuchungen der Insektenmyogenese bisher daran,
daß außer embryonalen und Kopfmyoblasten kein anderes System
von Myoblasten kultiviert werden konnte. (Seecoff et al 1973,
Wittmann et al 1974, Kurtti and Brooks 197o). Vor kurzem konn-
ten nun Flugmuskelmyoblasten, deren Differenzierungsprodukte
"dorsaler Längsmuskel" im Insekten den größten Muskel darstellt,
erfolgreich kultiviert werden (Lehmann und Zwadlo, in Vorberei
tung). Postmitotische Myoblasten des dlm-1 von Manducasexta
(Abb. 4a, b) werden in Graces Insect T.C. Medium ausgesät. Sie
differenzieren sich nur unter dem Zusatz von 5 % larvaler Manduca
hämolymphe (L V, d5) zu einem Netzwerk kontraktiler Strukturen
(Abb. 4b-f). Das elektronenoptische Bild solcher Netzwerke zeigt
dicke und dünne Filamente mit wenigen und ungeordneten Z-Struk
turen (Abb. Sa-d, Tab. 1). Das Netzwerk kontrahiert (demonstriert
auf Video-Band), die Netzwerkhomogenate enthalten Aktomyosin,
wie elektrophoretisch und immunologisch nachgewiesen wurde.
Diese Differenzierung erfolgt nur unter dem Zusatz von Hämo-
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lymphe, ~-und ß-Ecdysonzusätze verschiedener Quantität waren
wirkungslos. Der Verlauf des Ecdysteriodgehaltes während der
Metamorphose wurde durch Radioimmunassay mit Ecdysteroidanti
seren geprüft (Zwadlo und Lehmann, in Vorbereitung). Unter
suchungen der Hämolymphe (L V, dS) mit biochemischen Methoden
(Tab. 2), insbesondere mit Sephacryl 4b- und DE 52 -Chromato
grafien ergaben jeweils nur eine Fraktion ( F3, P3), die biolo
gisch aktiv war. Nur diese Fraktionen erzielten bei Zugabe zur
Primärkultur das gleiche Ergebnis wie bei Zugabe nicht behandel
ter Hämolymphe. Diese beiden Fraktionen erhielten im Unterschied
zu allen anderen Fraktionen der beiden Chromatografien in SDS
Gelelektrophoresen je eine zusätzliche Bande im Bereich von
18 ooo d. Aus den bisherigen Untersuchungen ist zu vermuten,
daß die biologische Aktivität der Hämolymphe von Manduca an
diese Bande (MFH = Manduca-Härnolymphe-Faktor) gebunden ist.
Die Zusammenstellung der Resultate zeigt für MHF folgende
Merkmale (Zwadlo und Lehrnann, in Vorbereitung):
a) Die Gabe von MHF mit der Hämolympe zu Flugmuskelmyoblasten
Primärkulturen von Manduca sexta zeigt eine entwicklungsstimu
lierende Wirkung. Sie äußert sich in Streckung, Alignation und
Fusion der Myoblasten bis zur Bildung eines kontraktilen Netz
werkes. Ohne Gabe von MFH wird die Entwicklung nach der Zell
clusterbildung abgebrochen.
b) MHF kommt im 5. Larvenstadium und während bestimmter unter
suchter Entwicklungstage des 4. Larvenstadiums, der Puppenzeit
und in der Imago in einer Konzentration von ca. o,1mg/ml Hämo
lymphe vor.
c) Die morphogene Wirkung von MHF ist konzentrationsabhängig.
d) Das in der SDS-Gelelektrophorese bestimmte Molekulargewicht
ist 18 ooo d. MHF ist kein Glycoprotein.
Neuere Untersuchungen ergaben, daß durch Zusatz eines Gang
lienextraktes eine Parallelisierung der aus den Clustern aus
wachsenden Fasern und eine regelmäßigere Kontraktion erreicht
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werden kann. Das elektronenoptische Bild zeigt die Anlage
von Sarcomeren mit regelmäßigen Z-Strukturen (Abb. Se) und
eine Vermehrung der Myofibrillen dieser Fasern (Pfeiffer
und Lehmann, 1983). Extrakte von Fettkörper und anderer Gewebs
homogenate differenzieren die Myoblasten nicht.
4. Die Aktivierung von Aktomyosin- und Mitochondrien-ATPase
im sich entwickelnden Flugmuskel
Das Hauptaugenmerk unserer Untersuchung liegt, wie schon er
wähnt (Pkt. 1), in der Aufklärung von regulativen und funktions
relevanten Differenzierungsschritten während der Insektenmyo
genese. Die Resultate zeigen, daß funktionsfähige Muskelstruk
turen der Thoraxmuskulatur lange vor der imaginalen Häutung
angelegt sind. Untersuchungen an Puppen von Ephestia kühniella
(Lehmann 1973) und an Puppen von Manducasexta (Kammer and
Theuben 1976, Kammer and Kinnamon 1979) wiesen jedoch nach,
daß sowohl Membranpotentialableitunqen als auch Ableitungen
nach elektrischer Stimulation intramuskulär bzw. intrazellu-
lär keinen Hinweis auf eine physiologische Aktivität dieser
Muskeln erbrachten. Messungen der Aktivität ATP-synthetisie
render und ATP-verbrauchender Enzyme sollte eine teilweise
Klärung dieser Probleme schaffen.
In der Puppe von Manduca sexta sind Mitochondrien- und
Aktomyosin-ATPase nicht zum gleichen Zeitpunkt aktivierbar.
Am 4. Tage vor der Imaginalhäutung wird die Aktomyosin-ATPase
in fast voller Höhe aktiv. Die Mitochondrien-ATPase erreicht
ihren imaginalen Aktivitätswert allerdings erst kurz vor dem
Schlüpfen der Imago (Abb. 6). Das bedeutet: nach der struktur
ellen Fertigstellung des Muskels ist die Funktion der erregen
den Membran und des Aktomyosins gewährleistet. Das bezeugen
ATPase-Aktivität und spontane elektrische Aktivität bzw.
Antwort auf elektrische Reize. Die Mitochondrien-ATPase ist
zu dieser Entwicklungszeit noch nicht aktiv. Damit ist die
Energieversorgung des kontraktilen Apparates noch nicht gewähr-