SNP Analysis of Six Nuclear Gene Fragments for Studying Population Genetics of Oryza granulata from China

2013·5.8 MB·

by  Wu Chun-Yan-

植 物 分 类 与 资 源 学 报 ,35 ( ):
摇 2013 5 537~546
Plant Diversity and Resources :
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI 10.7677/ynzwyj201312151
六个核基因片段在中国颗粒野生稻中的单核苷酸多态性
及其在群体遗传学研究中的应用
*
吴春燕1,2, 高立志1**
中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库植物种质资源与基因组学研究中心
(1 ,
云南昆明 中国科学院大学 北京
摇 650201; 2 , 摇 100049)
摘要: 为了筛选可用于亚洲栽培稻的重要野生近缘物种颗粒野生稻群体遗传结构研究的有效 标记
SNPs ,
本研究共选取Osgstf3 OsNAC6 BADH XCP2 EMF2和 ERCC4 个重要水稻功能基因 检测了来自中国
、 、 、 、 6 ,
云南和海南 份颗粒野生稻代表样品中的单核苷酸多态性 结果发现Osgstf3 OsNAC6 BADH和XCP2
12 , 、 、
的单核苷酸多态性接近于零 但在 EMF2和ERCC4 内含子区中检测到较低的核苷酸变异 利用EMF2 和
, 。
ERCC4片段对来自云南的 个天然群体和来自海南的 个天然群体共 个个体进行了群体遗传学研究
3 2 52 ,
发现该物种具有高水平的遗传分化和低水平的遗传变异的独特群体遗传结构 这种剧烈的遗传分化不仅来
;
自云南和海南两个地区之间 而且还来自地区内居群间 说明该野生稻生长的热带 亚热带森林生境的破
, , 、
坏导致了碎裂的居群间基因流强烈受阻
。
关键词: 核基因 颗粒野生稻 单核苷酸多态性 遗传变异 群体遗传结构
; ; ; ;
中图分类号: 文献标识码: 文章编号:
Q751摇 摇 摇 摇 摇 摇 A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 2095-0845(2013)05-537-10
SNP Analysis of Six Nuclear Gene Fragments for Studying
Population Genetics of Oryza granulata from China
1,2 1**
WU Chun鄄Yan , GAO Li鄄Zhi
PlantGermplasmandGenomicsCenter GermplasmBankofWildSpeciesinSouthwestChina KunmingInstitute
(1 , ,
ofBotany ChineseAcademyofSciences UniversityofChinese
, ,Kunming650201,China;2
AcademyofSciences
,Beijing100049,China)
Abstract Osgstf3 OsNAC6 BADH XCP2 EMF2
:Atotalofsixricegenesoffunctionalimportance,including , , , , and
ERCC4 Oryzagranula鄄
,wereselectedtoassesssuitableSNPsforuseinananalysisofpopulationgeneticstructureof
ta O.granulata
, a precious wild relative of Asian cultivated rice. An initial survey of12 representative samples of
Osgstf3 OsNAC6 BADH XCP2
from Yunnan and Hainan, China, resolved few SNPs in , , and , while low levels of
EMF2 ERCC4
variation were recorded within introns of and . A subsequent SNP survey was conducted within the
EMF2 ERCC4
and fragmentsacrossasampleof52plantscollectedfromthreeandtwonaturalpopulationsinYunnan
O.granulata
and Hainan, respectively. Thissurveyshowedthat exhibitsfairlyhighgeneticdivergencebetweenpop鄄
ulations despitelowlevelsofnucleotidediversity. Geneticdivergencebetweenpopulationswasevidentbothbetween
and within geographical regions. These findings imply that recent habitat fragmentation in tropical and subtropical
forests led to severe restrictions to gene flow, which enhanced divergence among populations.
基金项目 云南省自然科学基金重点项目 云南省高端人才项目 云南省 百名海外高层次人才
* : (2010CC011)、 (20080A009)、 “ 冶
引进计划和中国科学院 百人计划 项目
“ 冶
通讯作者
** : Authorforcorrespondence;E鄄mail:[email protected]
收稿日期 接受发表
: 2012-11-15, 2013-01-05
作者简介 吴春燕 女 硕士 主要从事植物谱系地理学研究
: (1986-) , , 。 E鄄mail:[email protected]
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇538摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
Key words Oryzagranulata
: Nuclear gene; ;Singlenucleotidepolymorphisms;Geneticvariation;Populationgenetic
structure
稻属 Oryza 包含亚洲栽培稻 O.sati鄄 间有着较高水平的遗传分化 而居群内的遗传多
摇 ( L.) ( ,
va 非洲栽培稻 O. glaberrima 和其他 个 样性很低 上述研究结果均表明 颗粒野生稻具
)、 ( ) 21 。 ,
野生种 等 分布 有高水平的居群间的遗传分化和低水平的居群内
(Khush, 1997; Vaughan , 2003),
于亚洲 非洲 大洋洲和美洲的热带 亚热带地 的遗传变异的群体遗传结构
、 、 、 。
区 在中国产的 种野生稻中 颗粒野生稻 O. 迄今对中国颗粒野生稻的群体遗传结构进行
。 3 , (
granulata 仅分布于云南 海南和台湾三省 高 了上述一系列的研究工作 但鉴于这些遗传标记
) 、 ( ,
立志等 根据 的分类界 本身存在的局限性 仍值得进一步对该物种开展
, 1996)。 Vaughan (1989) ,
定 疣粒野生稻复合种被认为包含两个二倍体种 群体遗传结构的深入研究 单核苷酸多态性
, 。
n 即O.granulata 和 是指在
(2 =24): Neeset Arn. ex Watt. (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs)
O.meyeriana 基 基因组水平上由单个核苷酸变异引起的 序
(Zoll. et Mor. ex Steud.) Baill.; DNA
于全基因组 杂交 颗粒野生稻被确定属于 列多态性 随着测序技术的迅速发展 已
DNA , 。 , SNPs
基因组 在稻属 余种中与亚洲栽培稻的亲 成为大规模遗传作图和基因型分析的重要工具
GG , 20
缘关系最远 等 和
(Aggarwal , 1997)。 (Henikoff Comai, 2003; Rafalski, 2002; Wang
野生稻不仅是现代水稻遗传育种的重要物质 等 目前已经广泛地应用于分子进化
, 1998), 、
基础 也是适应未来环境变化和人类需求而培育 群体遗传学 谱系地理学和保护生物学等方面的
, 、
相应品种的前提 高立志等 其中 颗 研究 然而 迄
( , 1996)。 , (Akashi, 2001; Brookes, 1999)。 ,
粒野生稻是最为珍贵的稻种资源之一 它抗白叶 今尚未有颗粒野生稻基因序列的 分析及其
, SNPs
枯病至接近免疫 高抗稻瘟病 褐飞虱和螟虫 遗传多样性和群体遗传结构的报道 相比于叶绿
, 、 , 。
并具有耐旱 耐荫等诸多优异的性状 章琦和 体和线粒体基因的序列多态性而言 核基因序列
、 ( ,
李道远 然而 随着经济的快速发展和 因具有双亲的遗传特性而包含着更为丰富的遗传
, 1994)。 ,
人类对热带 亚热带地区森林破坏的加剧 该物 信息 无疑对深入认识遗传变异水平较低的颗粒
、 , ,
种因大量居群灭绝和萎缩而处于濒危状态 高 野生稻的群体遗传学具有十分巨大的潜力
( 。
立志等 为了有效地保护颗粒野生稻种 水稻全基因组测序的完成 等
, 1996)。 (Goff , 2002;
质资源 近年来 中国学者对其遗传变异和居群 等 及其许多重要功能基因的相继克
, , Yu , 2002)
遗传结构进行了深入的研究 等 利 隆 等 等
。 Gao (2000) (Brookman , 1996; Nakamura , 2007; Xu
用 种酶系统 个等位酶位点对采自云南和海 和 等 等
12 17 Chye, 1999; Yoshida , 2001; Soranzo ,
南的颗粒野生稻 个居群 个个体进行了遗 等 等 和
15 304 2004; Li , 2006; Nakashima , 2007; Cho
传多样性研究 首次报道了该物种具有高水平的 和
, Kong, 2007; McDaniel Schultz,2009; Gammul鄄
居群间遗传分化和低水平的居群内遗传多样性的 等 为我们开展颗粒野生稻的单核苷
la , 2010),
独特居群遗传结构 钱韦等 用 酸多态性分析与群体遗传学研究提供了独一无二
; (2000) RAPD
和 分子标记技术研究了云南和海南 个颗 的机会 在本研究中 我们共选取 个已克隆的
ISSR 20 。 , 6
粒野生稻居群混合样品和云南 海南 个居群内 重要水稻功能基因 在对颗粒野生稻克隆测序得
、 2 ,
的遗传多样性 比较发现 来自云南的颗粒野生 到的基因序列与亚洲栽培稻直系同源基因比较的
, ,
稻居群的遗传多样性略高于海南居群 等 基础上 检测了中国颗粒野生稻具有广泛地理代
; Qian ,
分析了云南和海南的 个颗粒野生稻居 表的样品中的种内单核苷酸多态性 与结
(2001) 5 (SNPs)
群 研究结果与 等 获得的结论基本 构变异多态性
, Gao (2000) (Structural Variation Polymorphisms,
一致 等 和万亚涛等 用 寻找适用于开展颗粒野生稻群体遗传学
; Wu (2004) (2006) SVPs),
和 分析了云南颗粒野生稻居群间和 和谱系地理学研究的候选核基因 最后 我们利
RAPD ISSR 。 ,
居群内的遗传结构 结果显示 颗粒野生稻居群 用 个具有较高序列变异的基因 EMF2 和 ER鄄
, , 2 (
期 吴春燕和高立志 六个核基因片段在中国颗粒野生稻中的单核苷酸多态性及其在群体遗传学
5 摇 摇 摇 : …摇 摇 摇5摇39
CC4 片段对云南的 个和海南的 个天然群体 因的 引物依据亚洲栽培稻中的序列特异性设计 表
) 3 2 PCR (
进行了群体遗传学研究 报道了中国颗粒野生稻 扩增反应体系为 内含 2+
, 3)。 PCR 50滋L, 10伊Buffer (Mg
天然群体的核苷酸变异水平与群体遗传结构 -1 每个引物 -1
Plus) 5滋L, dNTP400滋mol·L , 0.2滋mol·L ,
。
酶 模板 反应程序为
ExTaq 1.5U, DNA100ng。 PCR : 94
预变性 变性 表 退火
1摇 材料和方法 益 4min; 94益 35s, TM ( 3) 1min,
延伸 共 个循环 最后 延伸
72益 1 min 30 s, 35 ; 72 益 10
1 1摇 材料 保存 在 的 仪上
. min, 10益 。 PCR Biometra Tgradient PCR
选取分布于云南及海南省南部的具有广泛地理代表 进行 在 反应结束后 产物用 琼脂糖凝
。 PCR , PCR 1.0%
的 个天然居群 表 每个居群选取 个个体用于 胶电泳进行检测 电泳的同时加 的 标
12 ( 1), 1 , 3滋L Trans2K plus
单核苷酸多态性分析 采集植株幼嫩叶片 每株采集 准分子量以初步判断 扩增是否为目的片段 将带有
, , 5 PCR 。
片 放入装有变色硅胶的自封袋中迅速干燥并保 目的片段的 产物用纯化试剂盒 上海生工 进行
~10 , PCR ( )
存 带回实验室进行总 提取 此外 还选取了具有 纯化 然后将纯化后的产物送往深圳华大基因研究院进
, DNA 。 , ,
地理代表性的 个云南居群和 个海南居群进行了群体 行两端引物分别测序 测序引物为扩增引物 利用正反
3 2 。 ,
遗传学的研究 表 每个居群取 株 为避免 向引物分别对两条链进行测序
( 2)。 10 ~11 , 。
取到克隆植株 取样时个体间至少间隔 采集幼嫩 1 3摇 数据分析
, 10m, .
叶片 硅胶迅速干燥 放置于自封袋中保存 凭证标本 核基因片段的初始序列用软件
, , ; Sequencher 4. 1. 4
保存于中国科学院昆明植物所标本馆 将正反两条序列进行拼
(KUN)。 (Gene Codes, Ann Arbor, MI)
1 2摇 DNA的提取和PCR扩增 接 将拼接好的序列用 软件包中
. , Bioedit (Hall, 1999)
采用改良后的 法对颗粒野生稻的硅胶干燥叶 进行序列多重比对 等 辅
CTAB ClustalW (Thompson , 1994),
片进行总 的提取 和 Osgstf3 以手工校正 在进行分析时 将空位 当做缺失
DNA (Doyle Doyle,1987)。 、 。 , (gap)
OsNAC6 BADH XCP2 EMF2和ERCC4共 个候选基 将长度大于 个碱基的插入 缺失处理为单碱
、 、 、 6 (missing); 1 /
表1摇 颗粒野生稻材料的采样地理来源
O.granulata
Table1摇 Geographicallocationsofthe accessions
编号 代码 采样地点
Number Codes 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 SamplingLocations
云南省普洱市澜沧县
1 AKS LancangCounty,PuerCity,YunnanProvince
海南省白沙黎族自治县
2 BS BaishaCounty,HainanProvince
海南省昌江黎族自治县
3 CJ ChangjiangCounty,HainanProvince
云南省保山市昌宁县
4 CN ChangningCounty,BaoshanCity,YunnanProvince
云南省临沧市沧源县
5 CY CangyuanCounty,LincangCity,YunnanProvince
云南省普洱市澜沧县
6 FK LancangCounty,PuerCity,YunnanProvince
云南省西双版纳州江北
7 JB Jiangbei,Xishuangbanna,YunnanProvince
云南省保山市龙陵县
8 LL LonglingCounty,BaoshanCity,YunnanProvince
云南省红河州绿春县
9 SM LuchunCounty,HonghePrefecture,YunnanProvince
云南省德宏州盈江县那帮
10 YJ Nabang,YingjiangCounty,DehongPrefecture,YunnanProvince
海南省三亚市崖城镇
11 YCB YachengCounty,SanyaCity,HainanProvince
云南省临沧市镇康县
12 ZKX ZhenkangCounty,LincangCity,YunnanProvince
表2摇 5个颗粒野生稻天然居群的地理来源
O.granulata
Table2摇 Geographicaloriginsofthefivestudiedpopulationsof
居群 样本大小 纬度 经度
地理位置 (N) (E)
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 GeographicLocations
Populations Samplesize Latitude longitude
海南省三亚市崖城县
YCB YachengCounty,SanyaCity,HainanProvince 10 18毅22忆 109毅10忆
海南省昌江黎族自治县
CJ ChangjiangCounty,SanyaCity,HainanProvince 10 19毅03忆 108毅50忆
云南省西双版纳江北
JB Jiangbei,Xishuangbanna,YunnanProvince 11 22毅01忆 100毅48忆
云南省临沧市沧源县
AKS CangyuanCounty,LincangCity,YunnanProvince 10 23毅22忆 98毅50忆
云南省保山市龙陵县
LL LonglingCounty,BaoshanCity,YunnanProvince 11 24毅19忆 99毅01忆
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇540摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
表3摇 用于扩增颗粒野生稻6个基因所用的PCR引物
O.granulata
Table3摇 TheprimersusedforthePCRamplificationsofthesixgenefragmentsin
基因登录号 基因名称 引物 退火温度
GeneBankID Genes (5忆鄄3忆) Primers TM/益
Osgstf3 ATAAGGCCACTCGAGCCCATC 61.92
Os03g0135300
CAGCCACTGCTCGTAAACATC 59.97
OsNAC6 TCCTCGAAACCCACCACCTC 61.90
Os04g0464200
TGTACAGCCGACACAGCAC 59.72
BADH TGTACTGACAGCACCTCAAAAG 58.21
Os03g0815100
GGGAATAGCGAGGTTGGTA 57.56
XCP2 GCAAAGCTTAAAGCCTTGGCATG 60.17
Os05g0108600
GAGAAGGCGTAGTCCATGAG 59.85
ERCC4 TGGTACACTGGATGGAGCTG 59.85
Os01g0948100
GTCGGGAGCACTGTTTATCAC 59.97
EMF2 GTACCTTGGGCTTGTGAG 57.30
Os04g0162100
CTTGGGCAATGTGCTGTG 57.30
基的插入 缺失 所有的插入 缺失位点被视为第五碱 的片段 和亚洲栽培稻的直系同源序列相比 在
/ 。 / , ,
基 并进行了重新编码 采用 等 编码区发现有 个单核苷酸的变异 其中
, 。 MEGA5.0 (Tamura , 36 , 3 bp
进行 检测和非加权组平均法构建聚类树 建 的缺失 两者的相似度为 BADH 经
2011) SNP ,
, 83%; PCR
树的自展值设为 运用 等
扩增后在颗粒野生稻中获得 的片段 和
1 000。 DNASP 4.10 (Rozas ,
515 bp ,
软件统计了EMF2和ERCC4片段的单倍型 在居
2003) , 亚洲栽培稻的直系同源序列相比 在编码区发现
群水平上对核苷酸多态性 仔 和 单倍 ,
( ) (Nei Li,1979), 个单核苷酸的变异 两者的相似度为
型多态性 h 和分离位点数目 S 进行了检测 利用 15 , 86%;
( ) ( ) 。 XCP2 经 扩增后在颗粒野生稻中获得
软件对居群间遗传分化系数 G 和居群间 PCR 733 bp
DNASP4.10 ( st) 的片段 和亚洲栽培稻的直系同源序列相比 在
的平均基因流 N 进行了估算 利用 , ,
( m) (Nei, 1973) 。
软件 等 构建 EMF2 和 ERCC4 44~52bp、 72~77bp、 352~355bp、 379~384bp
TCS1.2 (Clement , 2000)
和 发现 处碱基的插入 缺失 两者
片段的单倍型网络图 这种方法应用溯祖理论
。 (coales鄄 400~408bp 5 / ,
来推测单倍型的亲缘关系 基于统计简约性 的相似度为 EMF2 经 扩增后在颗粒
cent theory) , 89%; PCR
产生单倍型网状关系并保存了单倍型之间 的最简约 野生稻中获得 的片段 和亚洲栽培稻的
95% 1592 bp ,
节点 应用 等 对居群 直系同源序列相比 在编码区域发现 个单核
。 ARLEQUIN3.0 (Excoffier ,2005) , 12
进行遗传结构的分子方差分析 苷酸变异 两者的相似度为 ERCC4 经
(AMOVA, Analysis of Mo鄄 , 86%;
等 扩增后在颗粒野生稻中获得 的片
lecular Variance) (Excoffier ,1992)。 PCR 1 652 bp
段 和亚洲栽培稻的直系同源序列相比 在编码
, ,
2摇 结果
区域发现 个单核苷酸的变异并导致 个非同义
2 2
2 1摇 六个核基因在颗粒野生稻和栽培稻间的序 替换 两者的相似度为
. , 87%。
列变异比较及其在颗粒野生稻中的单核苷 对来自云南和海南具有广泛地理代表的
12
酸多态性分析 个颗粒野生稻样品的单核苷酸多态性分析扫描后
在本研究中 个候选核基因Osgstf3 OsNAC6 发现 OsNAC6 BADH和XCP2 片段中未检测到
, 6 、 、 , 、
BADH XCP2 EMF2 和ERCC4 均成功地在颗粒 Osgstf3 片段呈现出低水平的多态性 仅检
、 、 SNPs; ,
野生稻中通过 扩增得到目标片段 对其进 测到 个
PCR , 2 SNPs (90bp, C圮G; 205bp, G圮A)。
行克隆 测序与序列比对的结果发现 Osgstf3 相对而言 EMF2 和 ERCC4 片段在种内均呈现
、 , ,
经 扩增后在颗粒野生稻中获得 的片 出相对较高的单核苷酸多态性 表
PCR 911 bp ( 4, 5)。
段 和亚洲栽培稻的直系同源序列相比 在所测 EMF2 片段在颗粒野生稻种内共发现 个
, , 17 SNPs,
序的编码区上发现有 个单核苷酸的变异 其 平均约每 出现 个 还检测到 个
17 , 94 bp 1 SNP, 14
中有 的缺失 两者的相似度为 Os鄄 插入 缺失 它们分布在
1 bp , 88%; InDels ( / ), 113bp (1bp)、
NAC6 经 扩增后在颗粒野生稻中获得
PCR 871 bp 341bp (1bp)、 576 ~585 bp (10 bp)、 662 ~663
期 吴春燕和高立志 六个核基因片段在中国颗粒野生稻中的单核苷酸多态性及其在群体遗传学
5 摇 摇 摇 : …摇 摇 摇5摇41
处 表
bp (2 bp)、 667 ~668 bp (2 bp)、 678 ~711 bp (10 bp) ( 5)。
基于EMF2 和 ERCC4 片段的颗粒野生稻单
(34 bp)、 729 ~768 bp (40 bp)、 774 ~791 bp
核苷酸多态性信息 构建了来自云南和海南
(18 bp)、 802 ~888 bp (87 bp)、 946 ~977 bp , 12
个颗粒野生稻供试样品的 聚类树 图
(32bp)、 998~999bp (2 bp)、 1416 bp (1 bp)、 UPGMA (
和 处 结果发现 无论 EMF2 图 还是
1498 ~1508 bp (11 bp) 1555 bp (1 bp) 1)。 , ( 1: A)
表 在 ERCC4 片段的非编码区检测到了较 ERCC4 图 均将来自云南
( 4); ( 1: B) (FK、 ZKX、
为丰富的单核苷酸多态性 在颗粒野生稻中共检 和 和海南
, YJ、 CY、 JB、 AKS、 SM、 CN、 LL)
测到 个 平均 约每 出现 个 和 的样品明显聚为两大分支
17 SNPs, 97bp 1 SNP, (CJ、 BS YCB) ,
还检测到 个 它们分布在 表明分布于云南和海南的居群已经发生了剧烈的
3 InDels, 628 ~629 bp
和 遗传分化
(2bp)、 866~882bp (17 bp) 1470 ~1479 bp 。
表4摇 EMF2基因片段在颗粒野生稻中的单核苷酸多态性
EMF2 O.granulata
Table4摇 Singlenucleotidepolymorphismsofthe genefragmentin
单核苷酸位置
SitesofNucleotides
材料来源 1 1 1 1 1 1 1
5 6 6 6 6 6 9 9 9 9 0 2 2 2 2 2 3
SourceOrigins
7 4 6 7 7 7 1 1 3 7 2 2 3 3 3 7 2
6 3 0 0 1 4 1 6 2 9 0 4 3 5 9 8 7
AKS T A G G T T C A T G G A T G A G T
BS T T T A C C C A T A G G T G G G G
CJ - A T G G G C G A A A G T A G G G
CN A A G G T T C A T G G A T G A G T
CY A A G G T T C A T G G A T G A G T
FK T A G G T T C A T G G A T G A G T
JB T A G G T T C A T G G A T G A G T
LL A A G G T T C G T G G A T G A G T
SM A A G G T T C A T G G A T G A G T
YJ A A G G T T C A T G G A T G A G T
YCB T T T A C C C G T A A G C G G A G
ZKX A A G G T T T A T G G A T G A G T
表5摇 ERCC4基因片段在颗粒野生稻中的单核苷酸多态性
ERCC4 O.granulata
Table5摇 Singlenucleotidepolymorphismsofthe genefragmentin
单核苷酸位置
SitesofNucleotides
材料来源 1 1 1 1 1 1 1
1 4 4 5 6 7 8 8 9 9 0 1 2 2 2 3 4
SourceOrigins
7 4 4 6 0 5 2 5 4 8 9 0 0 1 1 1 8
0 2 6 0 2 1 0 6 6 8 0 2 9 0 1 7 7
AKS C G G C G A A A C T A C A T T G G
BS T - A A A G C G T T A C A T T A G
CJ T - A A A G C G T A G T T G T A T
CN C G A C G A A G T T A C A T A A G
CY C G A C G A A G T T A C A T T A G
FK C G G C G A A A C T A C A T T G G
JB C G G C G A A A T T A C A T T A G
LL C G A C G A A G T T A C A T A A G
SM C G A C G A A G T T A C A T T A G
YCB T - A A A G C G T A G T T G T A T
YJ C G A C G A A G T T A C A T T A G
ZKX C G A C G A A G T T A C A T T A G
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇542摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
图 基于P距离构建的颗粒野生稻 个个体的非加权组平均法树 各分支旁所示的数字为该分支的靴带支持率
1摇 12 。
O.granulata P
Fig.1摇 UPGMAtreeof12 individualsof basedon 鄄distance. Bootstrapvalueswereshownalongthebranchforeachclade
2 2摇 EMF2 和ERCC4 在颗粒野生稻天然居群中 别为 和 处的单碱基的插
. 464bp, 465bp 593bp
的序列变异分析 入 缺失以及 和
/ 379 bp, 469 bp, 480 bp, 484 bp
对 个颗粒野生稻天然居群 个个体的 处的多碱基的插入 缺失
5 52 1091 bp / 。
EMF2 和ERCC4 片段进行了测序 比对后序列 ERCC4片段共检测到 种不同的单倍型 通
, 4 。
长度分别为 和 其中 EMF2 过对单倍型序列间进行比对 共发现了 个变异
1 592 bp 1 652 bp。 , , 19
片段共检测得到 种不同的单倍型 通过对单倍 位点 表 包括 处碱基替换
4 。 ( 7), 15 (substitutions)
型序列间进行比对 共发现了 个变异位点 和 处插入 缺失 其中的 处插入 缺
, 26 4 / (indels), 4 /
表 包括 处碱基替换 和 失分别为 处的单碱基插入 缺失和
( 6), 18 (substitutions) 1080 bp / 36 bp,
处插入 缺失 其中 处插入 缺失分 和 处的多碱基的插入 缺失
8 / (indels), 8 / 638bp 895bp / 。
表6摇 EMF2核基因片段在颗粒野生稻4种单倍型间的序列变异位点
EMF2 O.granulata
Table6摇 Variablesiteswithinthealignedsequencesofthe genicfragmentsinthefourhaplotypesof
变异位点
Variablesites
单倍型 1
3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 8 8 8 8 9 0
Haplotype
7 7 6 6 6 6 6 7 7 7 8 8 8 4 5 7 9 9 1 2 0 1 2 3 2 9
8 9 2 4 5 8 9 2 3 6 0 3 4 2 8 3 2 3 4 5 8 8 9 3 1 1
H1 T @ G - - A - G T T - G 淫 A T G A T G T A A G A T #
H2 A @ G - - A - G T T - G 淫 A T G A T G T A A G A T #
H3 T @ T - T G - A C C - - - A T A G T G C G G G G G -
H4 - - T T T G & G G G ＊ A 淫 G A A - - A T A G A G G #
@:TTTTTTTGC;&:AC;＊:GGG;淫:GATTTGGTCGCAGAAATGTTGCTTCGCTTCT; #:GGGCAATCTCA
表7摇 ERCC4核基因片段在颗粒野生稻4种单倍型间的序列变异位点
ERCC4 O.granulata
Table7摇 Variablesiteswithinthealignedsequencesofthe genicfragmentsinthefourhaplotypesof
变异位点
Variablesites
单倍型 1 1 1
2 3 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 8 9 9 0 0 3
Haplotype
3 0 1 1 1 2 3 3 7 3 6 0 7 9 2 6 7 8 5
6 7 3 4 5 2 4 6 8 8 8 4 3 5 2 4 8 0 4
H1 异 T T T T T T T T - T T T 翌 C G C C G
H2 - C T T C T T C T - C T T - C G T C G
H3 - C T T C T T C T - C T T - C G T C G
H4 异 C G C C G C C G 吟 C G C 翌 T T T - A
异:AAAAATGTAA;吟:AATACTTTTCTTTCTTT;翌:TA
期 吴春燕和高立志 六个核基因片段在中国颗粒野生稻中的单核苷酸多态性及其在群体遗传学
5 摇 摇 摇 : …摇 摇 摇5摇43
2 3摇 颗粒野生稻天然居群中的遗传多样性水平 现在同在云南的 居群 与来自海南的
. JB 、 H2 YCB
利用 软件构建了核基因 EMF2 和 共享外 其余的单倍型 和 分别分布在来
TCS1. 2 , H3 H4
ERCC4片段的单倍型网络图 图 对于 EMF2 自云南和海南的 和 居群 图 上述
( 2)。 LL CJ ( 3: B)。
来说 来自海南的两个居群 和 尽管 结果表明 颗粒野生稻单倍型多样性水平整体上
, (CJ YCB) ,
在岛上有着较远的距离 却共享单倍型 说 极低 来自云南的居群遗传变异较为丰富 检测
, H4, , ,
明了它们在历史上可能共享祖先群体 来自云南 到的单倍型在不同居群中发生了明显的固定 体
; ,
的 个居群 和 的单倍型分别为 现了居群之间发生了较为剧烈的遗传分化
3 AKS, JB LL H1, 。
和 图 ERCC4 的单倍型在研究 对核基因EMF2和ERCC4片段遗传多样性的
H3 H2 ( 3: A)。
居群中观察到的分布式样与EMF2 相似 来自云 分析结果表明 表 取自云南和海南颗粒野生
, ( 8),
南的 居群拥有的两个单倍型中 同时出 稻的代表群体的遗传多样性水平极低 其中除了
AKS , H1 ,
图 核基因EMF2 和ERCC4 基因片段的单倍型网络图
2摇 (A) (B)
EMF2 ERCC4
Fig.2摇 Haplotypenetworksoftwonuclear (A) and (B) genefragments
图 EMF2 和ERCC4 中检测到的 种单倍型在颗粒野生稻 个居群中的地理分布
3摇 (A) (B) 4 5
EMF2 ERCC4 O.granulata
Fig.3摇 Thegeographicdistributionofthefourhaplotypesdetectedby (A) and (B) inthefivepopulationsof
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇544摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
ERCC4片段对来自云南的 居群检测到较高水 ERCC4的估计分别高达 和 其次为
AKS 54.55% 90.44%;
平的单倍型多态性水平 h 和核苷酸多态 地区间的遗传变异 分别达 和 居
( =0.533) , 45.45% 1.69%;
性水平 仔 外 其余取样居群的的单 群内的遗传变异最低 分别为 和 用
( =0.00159) , , 0.00% 7.87%。
倍型多态性水平和核苷酸多态性水平均为零 EMF2和ERCC4估计的颗粒野生稻居群间遗传变异
。
2 4摇 颗粒野生稻的居群遗传结构 固定指数分别为 F P 和F
. ST=1.00000 ( <0.0001) ST=
对颗粒野生稻居群遗传结构分析结果表明 P 表明该物种居群间存在着十
, 0.92127 ( <0.0001),
该物种的居群间存在着高水平的遗传分化 基于 分显著的遗传分化 地区内居群间遗传变异固定
。 ;
EMF2 和 ERCC4 估计的居群遗传分化系数分别 指数分别高达F P 和 F
SC=1.00000 ( <0.0001) SC
为G 和Gst N 值分别为 和 P 表明该物种地区内居群
ST=0.921 :0.797, m 0.01 =0.91992 ( <0.0001),
将上述两个基因合并估计得到 G 间的遗传分化也十分显著 我们基于核基因
0.16; ST=0.861 。
和N 表明居群间基因流强烈受阻导致 EMF2 和ERCC4 P距离构建了 个颗粒野生稻居
m=0.11, 5
了高水平的遗传分化 群的 聚类树 图 结果发现来自云南
。 UPGMA ( 4),
分析结果表明 表 颗粒野生稻的 和海南的居群被聚为两大分支 进一步支持这两
AMOVA ( 9), ,
遗传变异主要存在于地区内居群间 基于EMF2和 个地区的居群已经发生了剧烈的遗传分化
。 。
表8摇 EMF2和ERCC4基因片段单倍型分布和颗粒野生稻的遗传多样性指数
EMF2 ERCC4 O.granulata
Table8摇 Haplotypedistributionofthe and genefragmentsandmeasuresofgeneticdiversityin
居群 单倍型在不同居群中的分布
基因 Distributionofhaplotypesindifferentpopulations
Genes S H h 仔
Populations n H1 H2 H3 H4
AKS 10 10 0 1 0.000 0.00000
CJ 10 10 0 1 0.000 0.00000
EMF2
JB 11 11 0 1 0.000 0.00000
LL 11 11 0 1 0.000 0.00000
YCB 10 10 0 1 0.000 0.00000
AKS 10 4 6 4 2 0.533 0.00159
CJ 10 10 0 1 0.000 0.00000
ERCC4
JB 11 10 0 1 0.000 0.00000
LL 11 11 0 1 0.000 0.00000
YCB 10 10 0 1 0.000 0.00000
序列条数 S 分离位点数目 H 单倍型数 h 单倍型多态性 仔 核苷酸多态性
n: ; : ; : ; : ; :
S H h 仔
n:numberofsequences; :numberofsegregatingsites; :numberofhaplotypes; :haplotypediversity; :nucleotidediversity
表9摇 颗粒野生稻居群的AMOVA分析
O.granulata
Table9摇 AMOVAanalysisofthe populations
平方和 变异组分 变异百分比
基因 变异来源 自由度 固定指数 P值
Sumof Variance Percentage P
Gene Sourceofvariation DF FixationIndices values
squares components ofvariation
地区间 F
Amongregions 1 404.435 10.95060 45.45 CT=0.45455 0.09677
地区内居群间
F
EMF2 3 411.469 13.14072 54.55 SC=1.00000 <0.0001
Amongpopulationswithinregions
居群内 F
Withinpopulations 47 0.000 0.00000 0.00 ST=1.00000 <0.0001
总计
Total 51 815.904 24.09132
地区间 F
Amongregions 1 101.454 0.17492 1.69 CT=0.01686 0.38612
地区内居群间
F
ERCC4 3 296.319 9.38500 90.44 SC=0.91992 <0.0001
Amongpopulationswithinregions
居群内 F
Withinpopulations 47 38.400 0.81702 7.87 ST=0.92127 <0.0001
总计
Total 51 436.173 10.37694
期 吴春燕和高立志 六个核基因片段在中国颗粒野生稻中的单核苷酸多态性及其在群体遗传学
5 摇 摇 摇 : …摇 摇 摇5摇45
了该物种剧烈的遗传分化不仅来自云南和海南两
个地区之间 而且还来自地区内居群间 说明热
, ,
带 亚热带生境的破坏导致了碎裂的居群间基因
、
流强烈地受阻
。
在稻属系统发育中颗粒野生稻位于基部
(Ge
等 是目前稻属中最为缺乏了解的植物
, 1999),
图 基于核基因EMF2和ERCC4 P距离构建的 个颗粒野生 之一 本研究检测了 个核基因片段在中国颗粒
4摇 5 。 6
稻居群的非加权组平均法聚类树 各分支旁所示的数字为该 野生稻中的单核苷酸多态性 通过利用核苷酸变
。 ,
分支的靴带支持率 各群体代码如表 所示 异较为丰富的核基因片段对颗粒野生稻代表天然
, 5
O.granulata
Fig.4摇 UPGMAtreeofthefive populationswasconstr鄄 居群开展了初步的群体遗传学研究 证明了单核
EMF2 ERCC4 ,
uctedbyusingnucleotidesequencesof and based 苷酸多态性分析可以成为深入开展颗粒野生稻群
P
on 鄄distance. Bootstrapvalueswereshownalongthebranchfor
体遗传学 谱系地理学和保护生物学等方面研究
eachclade. CodeforeachpopulationisshowninTable5 、
的重要工具 基于单核苷酸多态性分析对颗粒野
。
3摇 讨论 生稻在世界范围内更为广泛地取样 开展群体遗
,
本研究首次检测和报道了亚洲栽培稻重要野 传学研究 必将大大地推动对这一珍贵野生稻种
,
生近缘物种颗粒野生稻种内单核苷酸多态性 在 质资源的深入研究 保护与有效发掘利用
。 、 。
选用的 个重要水稻功能基因中 Osgstf3 Os鄄
6 , 、
NAC6 BADH和XCP2 在中国颗粒野生稻广泛地 也参 考 文 献页
、 摇 摇 摇
理代表样品中的单核苷酸多态性接近于零 在
,
EMF2 和 ERCC4 中亦仅检测到较低的核苷酸变 Oryza
Aggarwal R,BrarD,KhushG,1997. Twonewgenomesinthe
异 从而在单核苷酸水平上进一步证实了种内遗
complexidentified on the basis of molecular divergence analysis
,
MolecularandGe鄄
传变异贫乏是该物种的特性 与我们以前的研究 usingtotal genomic DNA hybridization [J].
, neralGenetics 254
结果十分吻合 高立志等 当然 由于 , :1—12
( , 2000)。 , Cur鄄
AkashiH,2001. Geneexpressionandmolecularevolution [J].
这些基因功能十分重要 较为强烈的纯化选择也
rentOpinioninGenetics&Development 11
, , :660—666
可能导致它们维持较低水平的遗传变异 在 Gene 234
。 BrookesAJ,1999. TheessenceofSNPs [J]. , :177—186
EMF2 和ERCC4 两个基因片段中 我们在分布 et al ERCC4
, Brookman KW, Lamerdin JE, Thelen MP ., 1996.
于云南和海南共 份中国颗粒野生稻代表样品 (XPF) encodes a human nucleotide excision repair protein with
12
Molecular and Cellular
中检测到的 和 均仅出现在基因的内 eukaryoticrecombination homologs [J].
SNPs SVPs Biology 16
含子区 这与我们在其他野生稻中观察到的结果 , :6553—6562
,
ChoHY,KongKH,2007. Studyonthebiochemicalcharacterization
一致 这些非编码区中进化上呈中性的丰富
; SNPs of herbicide detoxification enzyme, glutathione S鄄transferase
为我们进一步研究和认识颗粒野生稻的群体遗传 Biofactors 30
[J]. , :281—287
结构与分子进化提供了有价值的遗传标记
ClementM,Posada D, Crandall KA,2000. TCS: a computer pro鄄
。
Molecular Ecology 9
利用核基因 EMF2 和 ERCC4 片段对来自云 gram to estimate gene genealogies [J]. ,
南的 个天然群体和来自海南的 个天然群体进 (10):1657—1659
3 2
行了群体遗传学研究 在单核苷酸水平上证实了 DoyleJJ,DoyleJL,1987. ArapidDNAisolationprocedureforsmall
, Phytochemical Bulletin 19
quantitiesof fresh leaf tissue [J]. , :
中国颗粒野生稻具有高水平的居群间遗传分化和
11—15
低水平的居群内遗传变异的独特群体遗传结构
, ExcoffierL, Smouse PE, Quattro JM, 1992. Analysis of molecular
这与以前我们利用等位酶分析 高立志等
varianceinferred from metric distances among DNA haplotypes:
( ,
和其他研究者利用 和 等分子标 applicationto human mitochondrial DNA restriction data [J].
2000) RAPD ISSR Genetics 131
记技术 钱韦等 等 等 , (2):479—491
( , 2000; Qian , 2001; Wu ,
ExcoffierL,LavalG,SchneiderS,2005. Arlequin (version3.0):
万亚涛等 所获得的结论一致 我们
2004; ,2006) 。 anintegratedsoftwarepackageforpopulationgeneticsdataanaly鄄
对颗粒野生稻居群遗传结构研究结果进一步揭示 EvolutionaryBioinformatics 1
sis [J]. , :47—50
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇546摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
etal Theoretical and Applied Ge鄄
GammullaCG,PascoviciD,AtwellBJ .,2010. Differentialmet鄄 byRAPDand ISSR markers [J].
Oryzasativa netics 102
abolicresponseofculturedrice( ) cellsexposedto , :440—449
Proteomics 10
high鄄andlow鄄temperaturestress [J]. , :3001— RafalskiA,2002. Applicationsofsinglenucleotidepolymorphismsin
Current Opinion in Plant Biology 5
3019 cropgenetics [J]. , :94—
高立志 张寿洲 周毅 et al
GaoLZ( ), Zhang SZ ( ), Zhou Y ( ) ., 100
et al
1996. Asurveyofthecurrentstatusofwild ricein China [J]. RozasJ,Sanchez鄄DelBarrio JC, Messeguer X .,2003. DnaSP,
ChineseBiodiversity 生物多样性 4
( ), (3):160—166 DNApolymorphismanalysesbythecoalescentandothermethods
Bioinformatics 19
GaoL,GeS,HongDY,2000. Lowlevelsofgeneticdiversitywithin [J]. , (18):2496—2497
etal
populationsand high differentiation among populations of a wild Soranzo N,SariGM,MizziL .,2004. Organisationandstructur鄄
Oryzagranulata
rice, NeesetArn. exWatt.,fromChina [J]. alevolutionofthericeglutathioneS鄄transferasegenefamily [J].
InternationalJournalofPlantSciences 161 MolecularGeneticsandGenomics 271
, :691—697 , :511—521
et al etal
GeS,SangT,Lu BR .,1999. Phylogeny of rice genomes with TamuraK,PetersonD,PetersonN .,2011. MEGA5:molecular
Proceedingsof
emphasisonoriginsofallotetraploidspecies [J]. evolutionarygeneticsanalysisusing maximum likelihood, evolu鄄
the NationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica Mole鄄
, tionarydistance,andmaximum parsimony methods [J].
96 cularBiologyandEvolution 28
:14400 , :2731—2739
etal
GoffSA,RickeD,LanTH .,2002. Adraftsequenceoftherice ThompsonJD,HigginsDG,GibsonTJ,1994. CLUSTALW:impro鄄
Oryza sativa japonica Science
genome ( L. ssp. ) [J]. , 296: ving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment
92—100 throughsequence weighting, position鄄specific gap penalties and
NucleicAcidsResearch 22
HallTA, 1999. BioEdit: a user鄄friendly biological sequence align鄄 weightmatrixchoice [J]. , :4673—
menteditor and analysis program for Windows95/98/NT [J]. 4680
NucleicAcidsSymposiumSeries 41 Oryza
, :95—98 Vaughan DA, 1989. Genus L. current status of taxonomy
Henikoff S, Comai L, 2003. Single鄄nucleotide mutations for plant [R]. IRRIResearchPaperSeries(Philippines)
Annual Review of Plant Biology 54
functionalgenomics [J]. , : Vaughan DA, Morishima H, Kadowaki K, 2003. Diversity in the
Oryza Current Opinion in Plant Biology 6
375—401 genus [J]. , :139—
KhushGS, 1997. Origin,dispersal,cultivationandvariationofrice 146
PlantMolecularBiology 35 万亚涛 阿新祥 樊传章 et al
[J]. , :25—34 WanST ( ), A XX ( ), Fan CZ ( ) .,
etal
LiK,YangJ,LiuJ .,2006. Cloning, characterization and tis鄄 2006. ISSRanalysisongeneticdiversityofthe34populationsof
Oryzameyeriana Chinese
sue鄄specificexpression of a cDNA encoding a novel embryonic distributed in Yunnan Province [J].
OsEMF2 Oryza sativa Mitochondrial JournalRiceScience 中国水稻科学 20
flower2 gene ( ) in [J]. ( ), (6):596—602
DNA 17 etal
, :74—78 WangDG,FanJB,SiaoCJ .,1998. Large鄄scale identification,
McDanielLD, Schultz RA,2009. XPF/ERCC4 and ERCC1: their mapping,andgenotypingofsingle鄄nucleotidepolymorphismsin
MolecularMechanismsofXe鄄 Science 280
productsandbiologicalroles [J]. thehumangenome [J]. , :1077—1082
rodermaPigmentosum etal
,65—82 WuCJ,ChengZQ,HuangXQ .,2004. Geneticdiversityamong
et al Oryzagranulata
NakashimaK,TranLSP,Van ND .,2007. Functional analysis andwithinpopulationsof fromYunnanofChina
OsNAC6
of a NAC鄄type transcription factor involved in abiotic revealed byRAPDandISSRmarkers:implicationsforconserva鄄
The Plant Science 167
andbiotic stress鄄responsive gene expression in rice [J]. tionoftheendangeredspecies [J]. , :35—
PlantJournal 51
, :617—630 42
Nei M, 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations Xu FX,ChyeML,1999. Expressionofcysteineproteinaseduringde鄄
ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnit鄄
[J]. velopmental events associated with programmed cell death in
edStatesofAmerica 70 ThePlantJournal 17
, (12):3321—3323 brinjal [J]. , :321—327
et al
NeiM,LiWH,1979. Mathematicalmodelforstudyinggeneticvaria鄄 YoshidaN, Yanai Y, Chen L ., 2001. EMBRYONIC FLOW鄄
Proceedingsofthe
tionintermsofrestrictionendonucleases [J]. ER2, a novel polycomb group protein homolog, mediates shoot
NationalAcademyofSciencesof the United States of America 76 Arabidopsis The Plant Cell
, developmentand flowering in [J]. ,
13
(10):5269—5273 :2471—2481
钱韦 葛颂 洪德元 etal
QianW( ),Ge S ( ), Hong DY ( ),2000. As鄄 YuJ,HuS,WangJ .,2002. Adraftsequenceofthericegenome
Oryza granulata Oryzasativa indica Science 296
sessment of genetic variation of detected by ( L. ssp. ) [J]. , (5565):79—92
ActaBotanicaSinica 植物学报 42 章琦 李道远
RAPDsandISSRs [J]. ( ), ZhangQ( ),LiDY( ),1994. Evaluationofresistance
Xanthomonasoryzae oryzae
(7):741—750 tobacterialblight( pv. ) inwildrice
AgriculturalSciencesinChina 中国农业科学
QianW,GeS,HongDY,2001. Geneticvariationwithinandamong species [J]. ( ),
Oryza granulata 27
populationsof a wild rice from China detected (5):1—9