Síntesis enzimática de acilglicéridos de alto valor nutricional

322 Pages·2016·6.56 MB·Spanish

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR
Departamento de Ingeniería Química

TESIS DE DOCTOR EN INGENIERÍA QUÍMICA

Síntesis enzimática de acilglicéridos de alto valor
nutricional

Daniel Alberto Sánchez

Bahía Blanca Argentina
2016
PREFASIO
Esta Tesis es presentada como parte de los requisitos para optar al grado Académico
de Doctor en Ingeniería Química, de la Universidad Nacional del Sur y no ha sido
presentada previamente para la obtención de otro título en esta Universidad u otra. La
misma contiene los resultados obtenidos en investigaciones llevadas a cabo en la
Planta Piloto de Ingeniería Química, dependiente del Departamento de Ingeniería
Química y el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, durante el
período comprendido entre el 1 de abril de 2011 y el 12 de febrero de 2016, bajo la
dirección de la Dra. María Luján Ferreira y la Dra. Gabriela M. Tonetto.

Daniel Alberto Sánchez

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SUR
Secretaría General de Posgrado y Educación Continua

La presente tesis ha sido a probada el …… /……/………., mereciendo la calificación
de ………(………………………..)
A mi familia, mi sustento
A la memoria de mis abuelos, eternamente en mi corazón.
AGRADECIMIENTOS

A mis directoras, María Luján Ferreira y Gabriela Tonetto por el apoyo y estímulo
constante en la realización de la presente tesis. Gracias Luján por la pasión puesta cada
día en la investigación y por el entusiasmo demostrado en la transmisión de
conocimientos. Gracias Gabriela por el compañerismo, por aventurarte a aprender
junto a mí en esta tesis y estar atenta a cada detalle. Gracias a ambas por encontrarle
siempre el lado positivo a los resultados, que a mí entender, eran malos.

Al Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), a la Agencia
Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT) y a la Universidad Nacional
del Sur (UNS) por el soporte financiero para el desarrollo de esta tesis.

A la Planta Piloto de Ingeniería Química (PLAPIQUI) por proveer los equipos y el
espacio físico adecuado para la realización del trabajo resumido en el presente
informe.

A todo el personal de apoyo del instituto PLAPIQUI y especialmente del grupo de
Catálisis (Andrea, Matías, Diego, Magalí) por la incondicional ayuda en la puesta a
punto de las técnicas y equipos usados para el trabajo experimental de la tesis.

A Ana Julia Ávila y Mariana Reinoso por su colaboración en el uso del cromatógrafo de
gases y la implementación de la técnica cromatográfica. A María del Pilar Guauque
Torres por su ayuda en la puesta a punto de la técnica de titulación.
A Esteban Brignole por la detallada explicación sobre el uso de Ecofac 1.0

A Julie Merchan Sandoval por la generosa facilitación de la montmorillonita empleada
en esta tesis.

A la Ing. Miryam Crespo y al Dr. Claudio N. Ferrarello por la colaboración con el análisis
ICP-AES de los preparados enzimáticos. Al Dr. Raúl Garay por su colaboración en la
realización de los análisis por RMN de 1H y 13C de diversas muestras.

A Nora, Any, Adriana, Elsa, Selva y Guillermo por simplificarnos la vida dentro del
instituto, por la incansable ayuda a la hora de realizar trámites.

A todos mis compañeros de oficina. Gracias por tantos momentos gratos, por tantos
mates, por tantas tortas. Gracias Pili, Vicky, Ana, Agus, Edu, Naza, Andrés, Mariana,
Yani, Marta, Fernando, Paula y Franco.

Gracias a todos los miembros del grupo de Catálisis por hacerme sentir parte de este
grupo desde el primer día. Gracias Daniel, Luján, Mara, Gabi, Martín, Andrea, Matias,
Diego, Maga.

Un agradecimiento muy especial merecen los grandes amigos que me dio la realización
de esta tesis en PLAPIQUI: gracias Pili, Agus, Maga, Mariana A. S., Andrés y Fernando.
Gracias a mis abuelos, que hoy ya no están pero compartieron estos años de estudio
junto a mí. Gracias por todo el amor y por la felicidad que me han dado.

Finalmente el agradecimiento más importante, a mis padres. Gracias por el apoyo
constante, por esa compañía infaltable aún a cientos de kilómetros. Gracias por
motivarme a aprender, por ayudarme a construir mi pensamiento. Gracias
nuevamente a mis papás, y a mi hermano, por alegrarse por cada pequeño logro, por
estar presentes en cada día de mi vida. Gracias por ser ejemplos de fortaleza, lucha y
constancia, y en especial por sus inigualables corazones.
RESUMEN

En la presente tesis se estudia la síntesis enzimática en dos etapas de mezclas de
acilglicéridos con un alto valor nutricional. El producto obtenido consiste
principalmente en triglicéridos estructurados, triglicéridos de cadena media y 1,3-
diglicéridos.

En el Capítulo 1 se define el concepto de acilglicérido y se describen las principales
características de los acilglicéridos utilizados en alimentación humana. Además, se
presentan las propiedades buscadas en nuevos glicéridos y el uso de lipasas para la
obtención de los mismos, con especial énfasis en el mecanismo de acción y
especificidad de estas enzimas.

El Capítulo 2 resume los materiales y métodos utilizados para llevar a cabo las
reacciones de síntesis durante esta tesis. También se presentan las técnicas utilizadas
para analizar los productos de reacción y los protocolos de inmovilización de lipasas.

El Capítulo 3 contiene los principales resultados de la síntesis enzimática de 1,3-
dicaprina por esterificación de glicerol con ácido cáprico catalizada por Lipozyme RM
IM. Se lleva a cabo un diseño de experimentos y se estudian múltiples respuestas.
Además, se analiza en detalle la migración de acilo (una reacción secundaria) y se
propone un modelo teórico para explicar la participación de la lipasa en esta reacción.

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En el Capítulo 4 se presentan los resultados obtenidos al realizar la separación y
purificación de 1,3-dicaprina sintetizada con la reacción descripta en el Capítulo 3. Se
estudia la separación de acilgliceroles en un proceso en varias etapas empleando
solventes de baja toxicidad. Como paso previo, se analiza la neutralización y separación
del ácido cáprico remanente.

El Capítulo 5 se centra en el estudio de biocatalizadores para la obtención de mezclas
de glicéridos estructurados de alto valor nutricional a través de la esterificación de 1,3-
dicaprina con ácido palmítico. Se analiza la actividad y selectividad de enzimas
comerciales, en forma libre e inmovilizada. Además, se realiza un exhaustivo análisis de
las características de la mezcla de acilglicéridos obtenida con cada biocatalizador.
Finalmente, se proponen y discuten varias técnicas para estudiar la composición de
estas muestras.

En el Capítulo 6 se lleva a cabo un análisis detallado de la isomerización de acilos
observada en la etanólisis de triglicéridos. En el mismo se examinan los principales
factores que afectan a la reacción de migración de acilo durante la etanólisis de
triglicéridos modelo catalizadas por Novozym 435.

El Capítulo 7 contiene los resultados más relevantes de la síntesis de 1,3-dicaproil-2-
palmitoil glicerol a partir de la esterificación de 1,3-dicaprina con ácido palmítico
catalizada por la lipasa de Burkholderia cepacia inmovilizada por adsorción física sobre
quitosano. En primer lugar, se estudia la obtención del biocatalizador. A continuación,
iii
el mismo se analiza en reacción mediante un diseño de experimentos y se determinan
las condiciones óptimas para la síntesis del triglicérido estructurado deseado.

Por último, el Capítulo 8 presenta las conclusiones más importantes y relevantes del
trabajo experimental llevado a cabo. En este capítulo también se indican los posibles
trabajos futuros derivados de la presente tesis.

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ABSTRACT

In this doctoral thesis, the enzymatic two stages synthesis of acylglycerides blends, with
high nutritional value, is studied. The nutritional mixture mainly consists in structured
triglyceride, medium chain triglycerides and 1,3-diglycerides.

In Chapter 1, acylglycerides concept is defined and the main characteristics of the
acylglycerides used in human nutrition are described. Also, the desired properties of
novel acylglycerides and the use of lipases for obtaining of these glycerides are
presented, with special emphasis on the mechanism of action and specificity of these
enzymes.

Chapter 2 summarizes the materials and methods used to carry out the synthesis
reactions during this thesis. The techniques used to analyze reaction products and the
lipase immobilization protocols are also presented.

Chapter 3 contains the most important results of enzymatic synthesis of 1,3-dicaprin by
esterification of glycerol with capric acid catalyzed by Lipozyme RM IM. An
experimental design is performed and multiple responses are analyzed. In addition, acyl
migration (a secondary reaction) is analyzed in detail and a theoretical model is
proposed in order to explain the participation of lipase in this reaction.

Chapter 4 contains the results obtained by performing the separation and purification
of 1,3-dicaprin synthetized by the reaction analyzed in Chapter 3. Acylglycerides
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