Separation and characterization of vitellin of Nilaparvata lugens (Stål) (Homoptera: Delphacidae)

2006·0.59 MB·

by  Hua-Guo, Dai

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&$’())*，+（, -）：(,.// 0112)+3+4*(,*
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!"#$%&’()*+,-./0
戴华国，衣维贤
（南京农业大学植物保护学院，南京 (-)),3）
123 电泳结合不同染色方法证实，褐飞虱 -+)$.$/0$#$)1*2&3（1FG9）卵黄蛋白为一种糖脂结合蛋白，其分子量约为
/-+HI，由-+J HI、-(+K3 HI和/,K* HI/个亚基组成。免疫反应证明，卵黄蛋白只存在于生育期的雌性褐飞虱成虫
体内。褐飞虱卵黄蛋白具有种的特异性，其免疫血清与白背飞虱的卵黄蛋白无交叉反应。
4563 褐飞虱；卵黄蛋白；性质；免疫反应
78)9:3 L,*3 ;<=>?3 D ;@A:3)+3+4*(,（* ())*）)-4))(,4)3
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8"9 :(%*7：-+)$.$/0$#$ )1*2&3；C8F"998>；E$OE"$F8"W；877%>8F’ $"&AF8O>
研究卵黄蛋白（C8F"998>，[F）的理化性质是深入 了初步研究，对其生化特性作了一些探讨，以期为从
研究昆虫卵黄发生及其调控的重要步骤。部分种类 生理学角度研究高温对褐飞虱种群消长的影响奠定
昆虫卵黄蛋白的研究方法已比较成熟，其组成及含 基础。
量的研究也比较透彻，有关卵黄蛋白的摄取过程、激
素调控机理的研究已达到一定水平，但是，所研究 ; BCDEF
的昆虫主要集中在部分卫生昆虫、经济昆虫与蜘蛛
等，如蜚蠊（I"?7&9 &>: \$OOH"W，-,5(）、埃及伊蚊 ;<; GHIJ
（M&<":O$> &>: ]%:WO>，-,5(）、家蝇（龚和和李乾君， 褐飞虱由广西农业科学研究院植物保护研究所
-,,(）、天蚕（^%>H"9 &>: U&>，-,5*；叶恭银等，-,,J）、 提供，分别于())(年和())/年的+月采自广西南宁
蓖麻 蚕（S;8>O 2# $)@，-,55）、家 蚕（^"> &>: 的水稻田。室外网室饲养，自然繁殖。室内在室温
_H8F%W%<%，-,J/）、真水狼蛛（彭宇等，()))）、飞蝗 (5‘ -a，相对湿度!,)b，光周期 -*cdJI 的条件
（S;"> &>: Q’&FF，-,5J）和七星瓢虫（龚和等，-,J(） 下，以汕优*/分蘖拔节期稻株饲养。
等。作为我国乃至整个东南亚主要粮食作物水稻的 ;<= $%&’(KLMN.
重要害虫———褐飞虱 -+)$.$/0$#$ )1&*2&3（1FG9）所属 参照龚和等（-,J(）方法，并加以改进。收集刚
的同翅目昆虫，国内外至今尚未见对其卵黄蛋白性 产下的褐飞虱卵，用蒸馏水洗净，滤纸吸干后称鲜
质的相关报道。本文作者对褐飞虱的卵黄蛋白进行 重；\8OT%<" 1F$&OW 型冷冻离心机（德国 M"$&"%W 公司
基金项目：国家自然科学基金项目（/,,5)-(3）
作者简介：戴华国，男，-,++年/月生，教授，主要从事昆虫生理和化学生态学研究，647&89：:&8;<=>?&%@":%@A>
收稿日期 B"A"8C":：())34)+4-+；接受日期 DAA"EF":：())34)54--
!" 昆虫学报 -+"#./"&0&$&’,+#%,/,+# %B卷
生产）! !""#$，%&下离心’" ()*，取上清液；上清液 只。以后每隔一周注射一次，第 ’、! 次采用背部多
在低温下用玻璃纤维迅速过滤除去脂层后，按 点注射，注射量’ (43只。第%、/次耳静脉注射不含
+,-.+,+"的比例加入预冷的重蒸水，%&下静置过 佐剂的卵黄蛋白溶液，注射量+ (43只。最后一次注
夜，使卵黄蛋白沉淀；再于 -/" # $，%&下离心 ’" 射后的第H 天耳静脉采血，分离血清，用+J 琼脂糖
()*，弃上清液；将所得的粗沉淀物溶于少量 "0% 双扩散法（TUV() !" #$W，+BB%）测定效价；效价达+,!’
(1234 5672，%&下静置过夜，使卵黄蛋白再沉淀。如 后隔一周颈动脉放血。最后分离得到的血清效价为
此反复’.!次后，将分离所得的卵黄蛋白经聚丙烯 +,=%。然后将血清与雄性褐飞虱成虫匀浆液混合，
酰胺凝胶电泳（89:;）鉴定纯度，达到电泳级后，将 !H&水浴保温+ O，室温下-/"#$离心+/ ()*，取上
得到的卵黄蛋白经 <54’+=>型真空冷冻干燥机（美 清液得卵黄蛋白的特异性抗血清，置@’"&下备用。
国<6>6*? 公司生产）冷冻干燥，@ ’"&密闭保存备 !"& #$%&*-./0123
用。 采用双向免疫扩散法（李成文，+BB’）分别将褐
!"# !" 飞虱卵、雌成虫、雄成虫、初孵 + 龄若虫、/ 龄若虫、
采用 46A((2)系统。参照郭尧君和俞添（+BB=） 白背飞虱 %&’#"!$$# ()*+,(!*# 雌成虫匀浆稀释液，加入
及郭尧君（’""+）的方法进行卵黄蛋白的 89:; 分 +J 琼脂糖凝胶板的样品孔中（孔径 ! ((）；样品孔
析；参照李玉民（+BBB）方法进行卵黄蛋白的 <C<D 排列呈梅花型，每孔加样量 +" 4；中心孔（孔径 /
#
89:;分析。测定卵黄蛋白的组成、分子量及亚基 ((）加入 +/ 4 +"" $3(4 的褐飞虱卵黄蛋白抗血
# #
分子量。实验重复!次。 清。加样后，效价测定方法同上。将琼脂糖胶板放
!"#"! 样品制备：将提取后经纯化的卵黄蛋白用 入电热恒温培养箱内，!H&保湿扩散!= O，取出后用
预冷的酶提取液（;CE9，"0"’B’ $；D巯基乙醇， "0BJ生理盐水漂洗/ O，干燥后用’0/J考马斯亮蓝
!
"0"!B+ (4；苯基硫脲，"0"%" $；用 FG H0" 的磷酸缓 Q’/"染色，脱色后根据染色情况判断结果。实验重
冲液定容至+"" (4）配成 / ($3(4的供试样品混合 复!次。
液。89:;和 <C<D89:;加样前分别按样品混合液, !"’ #$%&4567*89
样品缓冲液 I%,+ 比例，将供试样品与 / 倍样品缓 褐飞虱不同时期的卵样品液，一部分与一定量
冲液混合。后将混合液在沸水浴中加热/ ()*，取出 考马斯亮蓝:’/"混合，用//"型酶标仪（X)1DQ6Y公
冷至室温备用。 司生产）测定各样品在/B/ *(波长的ZC值，根据标
!"#"$ 电泳条件：89:; 的凝胶浓度为 /J 和 准曲线计算出样品的总蛋白浓度；另一部分进行聚
H0/J，缓冲体系为 FG -0! 的 EK)LD:2M（甘氨酸）。 丙烯酰胺凝胶电泳。
<C<D89:;的凝胶浓度为H0/J，缓冲体系为 FG -0! 电泳结束后，凝胶经固定、染色、脱色后，用解剖
的EK)LD:2MD<C<。CNND"型电泳仪为北京六一仪器 刀将凝胶上各个样品的卵黄蛋白条带切下，用磷酸
厂生产，<;=""D+/D+0/ 型电泳槽为瑞典 8O6K(6P)6 公 缓冲液洗脱，得到结合了考马斯亮蓝Q’/"的卵黄蛋
司生产。 白洗脱液。用酶标仪测定洗脱液在 /B/ *(波长的
!"#"# 染色：蛋白质用考马斯亮蓝 Q’/" 染色；脂 ZC值，根据蛋白质标准曲线求出卵黄蛋白条带的蛋
蛋白采用苏丹黑预染法（莽克强等，+BH/；华家栓 白相对含量，计算出电泳样品中卵黄蛋白的相对浓
等，+B-’）；糖蛋白采用过碘酸D<PO)RR试剂染色法（莽 度，从而得到卵黄蛋白相对浓度与样品总浓度的比
克强等，+BH/）；磷蛋白采用甲基绿D钼氨酸染色法 值，即卵黄蛋白的相对含量。测定重复!次，相对含
（莽克强等，+BH/）。 量取平均值。
!"#"% 标准蛋白：89:;的标准蛋白为8O6K(6P)6公
司生产的非变性高分子量蛋白。<C<D89:;的标准 $ :;<23
蛋白为中国科学院上海细胞生物研究所生产的低分
子量和次高分子量标准蛋白。 $"! #$%&*!"01=>9123
!"% #$%&’()*+, + $褐飞虱刚产下的卵，用沉淀法提纯，经 ! 次
将提纯的卵黄蛋白用 "0% (1234 5672溶液溶解 沉淀并在低温下透析’% O脱盐，冷冻干燥可获得约
并稀释至浓度为 % ($3(4，与弗氏完全佐剂等量混 H" ($卵黄蛋白。得到的卵黄蛋白经 89:;分析，在
合后，注射于雄兔（’.! S$3只）腹股沟，注射量’ (43 H0/J分离胶中的相对迁移率（卵黄蛋白迁移距离3
!期 戴华国等：褐飞虱卵黄蛋白的分离及其生化特性 A!
图! 褐飞虱卵黄蛋白（"）及其亚基（#）分子量的测定
$%&’ ! ()*)+,%-.*%/-/0,/1)231.+4)%&5*/06%*)11%-（"）.-7%*88393-%*8（#）%- !"#$%$&’$($#)*+,-
"：!: 标准蛋白;/1)231.+4)%&5*,.+<)+；=: 褐飞虱卵黄蛋白分子量;/1)231.+4)%&5*/06%*)11%-%- !’ #)*+,-’
#：!: 次高分子量标准蛋白>39?5%&5,/1)231.+4)%&5*,.+<)+；=: 纯化卵黄蛋白@3+%0%)76%*)11%-；A: 低分子量标准蛋白B/4,/1)231.+4)%&5*,.+<)+’
染料迁移距离）为C:!DE（!:F= 2,G!C:=C 2,）；在FH 结果可以看出：褐飞虱卵黄蛋白抗血清与雌成虫、
分离胶中的迁移率为C:=I（=:IJ 2, G!C:AC 2,）。过 卵、!龄若虫的匀浆液均有免疫沉淀反应，有抗原同
碘酸?>25%00试剂染色表明褐飞虱的卵黄蛋白是一种 源性，说明卵黄蛋白在雌成虫体内、卵内、! 龄若虫
糖蛋白；苏丹黑预染后进行电泳证明褐飞虱的卵黄 体内均存在；而与F龄若虫无免疫沉淀反应，说明 F
蛋白是一种脂蛋白；而经甲基绿钼氨酸染色，结果呈 龄若虫体内不含有卵黄蛋白。与白背飞虱雌成虫也
阴性，证明褐飞虱的卵黄蛋白不是磷蛋白。因此可 无免疫反应，说明褐飞虱卵黄蛋白与白背飞虱卵黄
以认为褐飞虱的卵黄蛋白是一种糖脂复合蛋白。 蛋白在结构或组成方面有所不同。
!"! !"#$%&’()*+,- !"$ 2345678!"#$9(&:
通过 @"KL，作相对迁移率?分子量对数曲线，计 室温条件下，褐飞虱从卵产出至胚胎发育DJ 5之
算得出褐飞虱卵黄蛋白的分子量为A!D <(（图 !： 内，卵黄蛋白相对含量变化不大；DJ 5后，卵黄蛋白被
"）。>(>?@"KL 结果表明，褐飞虱卵黄蛋白明显分 大量消耗，其相对含量迅速下降；至=!I 5时（即发育至
离成迁移率不同的A条多肽链，由相对迁移率?分子 孵化后第A天的若虫），褐飞虱若虫已经进入=龄，其体
量对数曲线计算得知，A条肽链的分子量分别为!DJ 内卵黄蛋白相对含量几乎为零（图A）。
<(、!=D:F <(和AE:I <(（图!：#）。
# ;<
!"# !"#$%./01
将褐飞虱卵、雌成虫、! 龄若虫、F 龄若虫，褐飞
虱卵黄蛋白抗血清及白背飞虱雌成虫匀浆稀释液进 #"% =>?!"#$%&’(@*+&’(
行双向免疫扩散实验，染色后结果见图 =。从染色 测定结果表明，褐飞虱卵黄蛋白的分子量为
:! 昆虫学报 21($3,(/4/#/*"1$.","1$ <J卷
褐飞虱雌成虫体内卵黄原蛋白和卵黄蛋白的关系有
深入探讨的必要。
SGS?T4U=结果表明，褐飞虱卵黄蛋白明显地分
成分子量为2<Q FG、2!<3> FG和:J3B FG的:条多肽
链。但卵黄蛋白前体分子从合成、释放到沉积的修
饰过程中亚基比例有无变化，则需通过离体条件下
标记合成和化学计算法来测定。
!"# !"#$%&’()*+,
于长明等（2JJQ）研究发现，卵黄蛋白是雌虫所
特有的，并在一定发育阶段由特定组织（一般为脂肪
体）产生，经血淋巴到达卵巢沉积而成；卵黄蛋白的
图! 褐飞虱卵黄蛋白存在检验
发生过程受激素调控。本实验通过双向扩散免疫反
"#$% ! &’()*+),’-#)’..#/’0#()’/1’#/ !"#$%$&’$($#)*+,-
应，证明初孵的褐飞虱2龄若虫体内含有卵黄蛋白，
23 褐飞虱卵黄蛋白抗血清 4/)#(’567*+ !% #)*+,- -#)’..#/；
推测这部分卵黄蛋白可能来源于雌成虫，卵内的卵
!3 雌成虫"’78.’896.)；:3 雄成虫;8.’896.)；<3 卵 =$$；
>3 >龄若虫>),?#/()85/@7A,；B3 2龄若虫2()?#/()85/@7A,； 黄蛋白在胚胎发育过程中被部分利用，另有部分转
C3 白背飞虱雌成虫"’78.’896.)*+ ./*$(+##$0)&1"0+&$% 移到初孵若虫体内。褐飞虱>龄若虫体内未测得卵
黄蛋白，这说明褐飞虱 > 龄若虫尚未开始合成卵黄
蛋白，从而证明褐飞虱的卵黄蛋白只存在于生殖期
的雌成虫体内。
卵黄蛋白具有种的特异性，叶恭银等（2JJQ）在
研究天蚕的卵黄蛋白时，比较了天蚕（大、小亚基的
分子量分别为2QK FG和<K FG）与柞蚕（2CK FG和<>
FG）、蓖麻蚕（2QK FG 和 <: FG）、惜古比天蚕蛾（2QK
FG和<C FG）、家蚕（2QK FG和<! FG）的卵黄蛋白亚
基的组成特性，发现它们大、小两个亚基的分子量相
近；但与樗蚕（!:K FG 和 >> FG）相比，则相差较远；
图: 褐飞虱胚胎发育过程中卵黄蛋白含量的变化 由此认为，卵黄蛋白的亚基组成可在一定程度上反
"#$% : D,8/$’*+-#)’..#/1*/)’/)965#/$’7E5@*/#1 映其亲缘关系。叶恭银等（2JJQ）还发现天蚕卵黄蛋
9’-’.*A7’/)*+ !"#$%$&’$($#)*+,-
白抗血清与柞蚕卵黄蛋白呈阳性反应，而与家蚕呈
:2< FG，这与 HI67# 等（2JJ<）所报道的“昆虫卵黄蛋 阴性反应，因此认为卵黄蛋白的免疫特性在一定程
白分子量在 !2KLB>! FG之间”结论相符。就已研 度上也能反映种间的亲缘关系。本项研究发现，褐
究的昆虫来看，褐飞虱卵黄蛋白的分子量比较接近 飞虱卵黄蛋白免疫血清与褐飞虱雌成虫有免疫反
双翅目和部分鳞翅目昆虫，如埃及伊蚊卵黄蛋白的 应，而与白背飞虱雌成虫无免疫反应，说明褐飞虱与
分子量为 :BK FG（M8$’9*5/ 8/9 N69(*/，2JC!）、家蚕 白背飞虱的亲缘关系有一定距离，其卵黄蛋白也会
卵黄蛋白的分子量为 <<K FG（O’/ 8/9 PF#)6(6$6， 有一定的差异。
2JQ:），而低于蜚蠊目、直翅目等目的昆虫，如德国小 !"! !"#$’-./0123%45
蠊卵黄蛋白的分子量为 B>! FG（于长明等，2JJQ）、 迄今，关于卵黄蛋白在昆虫胚胎发育过程中作
飞蝗卵黄蛋白的分子量为 >>K FG（D,’/ 8/9 R@8))， 用的研究很少。一般认为卵黄蛋白在胚胎发育中有
2JCQ）。但褐飞虱卵黄蛋白分子量的测定结果可能 营养源、运 输、机 械 支 持 等 方 面 的 作 用，如：
会受样品制备过程中蛋白质降解及碱性条件下电泳 T*().’),V8#)和U#*5$（# 2JQ>）、彭宇等（!KKK）认为卵黄
引起的样品降解的影响。近期，D,’/$和 M*6（!KK>） 蛋白为发育中的胚胎提供营养物质；R*.+?W’#(
对褐飞虱雌成虫、雄成虫、>龄若虫的匀浆液进行电 （2JCB）证明卵黄蛋白有运输某种必需物质的作用。
泳的结果发现，雌成虫有一条 2C> FG的特殊条带； 褐飞虱胚胎发育过程中卵黄蛋白的含量变化
经荧光免疫法测定，其为卵黄原蛋白（-#)’..*$’/#/）。 （图:），与 O’/和 PF#)6(6$6（2JQ:）研究家蚕卵黄蛋
.期 戴华国等：褐飞虱卵黄蛋白的分离及其生化特性 22
白在胚胎发育过程中变化的结果相似，作者认同 K)-&>",6KK，JC>#"6+V，./;4< !C,*@*B)$*"6)6>#*$&"@#96$’&#*#"@ ;060%
!"#$%&$’()*$和+*",-*（./01）“卵黄蛋白为发育中的胚 ’0*92&) 9"%UD,"$&*6G <>2G ?""-G，.04：2\;H2;0<
KC)JN，_*+V，Q* W5，./04< !,)B$*B)%7&B’6*[C&#"@!,"$&*6 5’&A*#$,9G
胎提供营养物质”的观点，这样才能较合理地解释卵
N’)6-’)*：N’)6-’)*NB*&6$*@*B)6>7&B’6*B)%!,&##G 14H1\［< 华家栓，
黄蛋白在胚胎发育过程中逐渐减少的原因。
西国良，易庆成，./04< 实用蛋白质化学技术G上海：上海科学
从褐飞虱胚胎发育过程中卵黄蛋白含量的变化
技术出版社G 14H1\］
曲线（图2）来看，在卵产出母体30 ’后，胚胎发育进 ‘PCA*N，Q)6" S，Q)A)A"$" Q，.//3< :&?*&( 9"%U D,"$&*6 @,"A *6#&B$
入附肢形成阶段，胚胎的新陈代谢极其旺盛，卵黄蛋 &--#：#$,CB$C,&，F*"#96$’&#*# )6> D,"-,)AA&> >&-,)>)$*"6 >C,*6-
&AF,9"-&6&#*#G 74%0#&8/9%)"-G，3M（/）：;21H;3\<
白被大量消耗，其相对含量迅速下降；.33 ’ 后，若
S&6‘，aU*$C#C-C Q，./02< Y--E#D&B*@*B D,"$&*6 *6 $’& #*%U(",A，,"(@9>
虫孵化，并已开始取食，但卵黄蛋白的相对含量仍然
("+)：DC,*@*B)$*"6，D,"D&,$*&#，%"B)%*P)$*"6 )6> $*$,& B’)6-&# >C,*6-
继续减少，推测此时卵黄蛋白可能继续作为营养物
""-&6&#*#)6>&AF,9"-&6#*#G 74%0#&,)"#/0(G，.2（.）：;.H0M<
质在消耗，以保证初孵若虫能够度过孵化初期生命 SC6U&%Jb，!)6bV，./;\< N&%&B$*?*$9"@9"%UD,"$&*6CD$)U&：B"AD),*#"6"@
的脆弱阶段。也可能是卵黄蛋白转化为初孵若虫体 ?*$&%%"-&6&#*#"@$("*6#&B$#G 74%0#&8/9%)"-G，44：0M/H0.0<
内某种缺乏但又必需的物质，或者卵黄蛋白本身就 V*58，.//4< ‘AAC6"B’&A*#$,97&B’6*[C&#G N’)6-’)*：N’)6-’)*NB*&6$*@*B
)6>7&B’6*B)%!,&##G .04H./M，421H420［< 李成文，.//4< 现代免
运输了初孵若虫必需的蛋白质，以保证若虫的正常
疫化学技术G 上海：上海科学技术出版社G .04H./M，421H
发育。这种趋势一直延续到褐飞虱进入4龄若虫阶 420］
段。对卵黄蛋白的有关作用尚需进一步研究。 V* Qb，.///< NINE!"%9)B,9%)A*>& -&% &%&B$,"D’",&#*#G ‘6：K&X_，X’)6-
NX&>#G Y%&B$,"D’",&#*#G T&*R*6-：NB*&6B&!,&##G .4;H.2/［< 李玉民，
! " # $ %!"#"$"%&"’& .///< NINE聚丙烯酰胺凝胶电泳G 见：何忠效，张树政主编：电
泳G 北京：科学出版社G .4;H.2/］
5’&677，89)$$+:，./;0< =*$&%%*6 )6> ?*$&%%"-&6*6 @,"A%"BC#$#（!"#$%&’
b)6-SW，_C ]X，L)6- :_，./;1< !"%9)B,9%)A*>& +&% Y%&B$,"D’",&#*#G
()*+’&"+)’）：D,"D&,$*&# )6> D"#$E$,)6#%)$*"6)% A">*@*B)$*"6 *6 $’& @)$
T&*R*6-：NB*&6B&!,&##G 10H1/［< 莽克强，徐乃正，方荣祥，./;1<
F">9G ,)"-G ./0(G，412：1243H122.<
聚丙烯酰胺凝胶电泳G 北京：科学出版社G 10H1/］
5’&6- IJ，K"C :L，4MM1< I&$&,A*6)$*"6 )6> >*#$,*FC$*"6 "@ ) @&A)%&E
!&6-Q，KC 5，X’)" JX，4MMM< N$C>*&# "6 ?*$&%%*6 "@ ()$&, ("%@ #D*>&,
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（K"A"D$&,)：I&%D’)B*>)&）G 5)%%$0’46.0--，2（; .）：2;H31G
4\（.）：\/H;3［< 彭宇，胡萃，赵敬钊，4MMM< 真水狼蛛 8)+’&’
5’*6" K，5’&6P&* Q，89)$$ +:，./;;< LC,$’&, B’),)B$&,*P)$*"6 "@
2)+’&)#$%卵黄蛋白的研究G 浙江大学学报（农业与生命科学版），
%&D*>"D$&,)6 ?*$&%%"-&6*6 @,"A ’)&A"%9AD’ )6> A)$C,& &--#G 74%0#&
4（\ .）：\/H;3］
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>"A&#$*B@%9，:$%#’6"(0%&)#’G ;#&’ <4&"("-G =)4G，21（4）：.4/H
0\1H0\/<
.2;<［龚和，李乾君，.//4< 家蝇的卵黄发生及其激素调节G 昆
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虫学报，2（1 4）：.4/H.2;］
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（责任编辑：黄玲巧）
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