Secuenciación del exoma en anemia de Fanconi

214 Pages·2015·6.43 MB·Spanish

Facultat de Biociències
Departament de Genètica i Microbiologia
Unitat de Genètica

Secuenciación del exoma en anemia de Fanconi:
del diagnóstico al descubrimiento de un nuevo
gen

Memoria presentada por Massimo Bogliolo para optar al grado de Doctor en Genética por la
Universitat Autònoma de Barcelona

Director de tesis Autor

Dr. Jordi Surrallés Calonge Massimo Bogliolo
Catedrático de Genética, UAB

Esta tesis es dedicada a todos los pacientes de
Anemia de Fanconi y a sus familias

Contenido

ABREVIATURAS .................................................................................................................... 9
I. PROLOGO .................................................................................................................... 13
II. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 17
II.1. La Anemia de Fanconi ...................................................................................... 17
II.1.1. Anomalías del desarrollo ........................................................................ 17
II.1.2. Defectos de las células madre ................................................................ 18
II.1.3. Neoplasias .............................................................................................. 19
II.1.4. Mosaicismo somático ............................................................................. 20
II.1.5. Fenotipo de las células FA ..................................................................... 21
II.1.6. FA y aldehídos endógenos ..................................................................... 22
II.2. Clonación de los genes FA ................................................................................ 24
II.3. Genes FA, FA-like y asociados a FA ............................................................... 32
II.4. Biología molecular de la FA ............................................................................. 33
II.4.1. FAN1 ...................................................................................................... 38
II.5. Reparación por Recombinación Homóloga y FA .......................................... 39
II.6. FA y la susceptibilidad al cáncer familiar de mama y ovario. ...................... 43
II.6.1. Mutaciones bialélicas en genes FBOC: fenotipos celulares y clínicos .. 45
II.7. La secuenciación del DNA de nueva generación: secuenciación del exoma 46
II.7.1. WES: Captura y amplificación de las regiones codificantes. ................. 47
II.7.2. Secuenciación de las librerías ................................................................ 50
II.7.3. Otras tecnologías para secuenciación de librerías .................................. 54
II.7.4. NGS y diagnóstico de la FA ................................................................... 56
III. OBJETIVOS .................................................................................................................. 63
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IV. MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................... 67
IV.1. Pacientes y controles ........................................................................................ 67
IV.2. Ensayo de fragilidad cromosómica ................................................................ 68
IV.3. WES y análisis de las mutaciones en pacientes FA. ..................................... 69
IV.4. MLPA ............................................................................................................... 70
IV.5. Líneas celulares ................................................................................................ 71
IV.6. Análisis del bloqueo del ciclo celular en G2 y citometría de flujo ............... 72
IV.7. Clonaje especifico de alelos ............................................................................. 73
IV.8. Ensayo de sensibilidad a los ICL y UVC en células adherentes. ................. 73
IV.9. Ensayo de la sensibilidad a los ICL y UVC en LCLs ................................... 74
IV.10. Producción de las líneas revertidas FA104R and 1333R. .......................... 75
IV.11. Mutagénesis sitio dirigida ............................................................................. 76
IV.12. Vectores y producción de partículas virales ............................................... 77
IV.13. Selección de células por fluorescencia ......................................................... 78
IV.14. Ensayo de síntesis de DNA no programada ................................................ 79
IV.15. Irradiación local con UVC y reparación del daño al DNA ........................ 80
IV.16. Western Blot, co‐IP y fraccionamiento celular ........................................... 81
IV.17. Evaluación del desenganche (unhooking) por ensayo cometa ................... 82
IV.18. Purificación de XPF-ERCC1 y ensayos de reparación in vitro ................. 83
V. RESULTADOS ............................................................................................................. 89
V.1. Subtipaje y caracterización molecular de los pacientes FA mediante método
WES + MLPA ............................................................................................................ 89
V.1.1. Análisis de la cobertura de los genes FA en el análisis por WES. ......... 89
V.1.2. Análisis por WES y MLPA de 49 pacientes FA .................................... 91
V.1.3. Análisis por cobertura de las grandes deleciones en FANCA ............... 93
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V.2. Mutaciones bialélicas en ERCC4 causan FA .................................................. 96
V.3. Mutaciones en ERCC4 que causan FA afectan marginalmente la NER. ... 104
V.4. Mutaciones en ERCC4 que causan FA inactivan la reparación de los ICL107
V.5. Las proteínas XPF mutadas en FA relocalizan de forma normal al núcleo y
al DNA dañado. ....................................................................................................... 109
V.6. Escisión, actividad nucleasa y “unhooking” de los mutantes XPF ............. 111
V.7. ERCC4/FANCQ como posible gen FBOC ..................................................... 112
VI. DISCUSIÓN ................................................................................................................ 119
VI.1. Caracterización genética mediante WES + MLPA de 49 pacientes FA. .. 119
VI.1.1. Espectro mutacional de los pacientes FA-A analizados ..................... 124
VI.1.2. Espectro mutacional de los pacientes FA-A españoles ...................... 126
VI.1.3. Espectro mutacional de los pacientes no FA-A analizados ................ 129
VI.2. Identificación de ERCC4 como gen FA ........................................................ 133
VI.3. ERCC4 y FBOC ............................................................................................. 140
VII. COCLUSIONES ......................................................................................................... 145
VIII. BIBLIOGRAFÍA: ........................................................................................................ 149
IX. ANEXOS ..................................................................................................................... 175

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ABREVIATURAS
6-4PP: fotoproductos pirimidina (6-4) pirimidona
8-MOP: 8-Methoxypsoralen
ALL: Leucemia linfoide aguda
AML: Leucemia Mieloide Aguda
BMF: Fallo de la medula ósea; del inglés, Bone Marrow fa(cid:76)lure.
bp: pares de bases; del Inglés, base pairs
CGH: Hibridación Genómica Comparada
CisPt: Cisplatino
CNV: Variación del número de copias
CPD: Dímeros de ciclobutano de pirimidinas
CRT: Terminación cíclica reversible
CS: Síndrome de Cockayne
DEB: Diepoxy-butano
DHPLC: Cromatografía liquida desnaturalizante de alta rendimiento; del inglés, Denaturing
High-Performance Liquid Chromatography
DMEM: Medio de cultivo celular Dulbecco's Modified Eagle's Medium
dNTP: desoxirribonucleótido trifosfato
DSB: Roturas de doble cadena del DNA; del inglés, Double Strand Breaks
dsDNA: DNA de cadena doble; del inglés double strand DNA
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emPCR: PCR en emulsión.
FA: Anemia de Fanconi
FAAP: Proteínas Asociadas a la Anemia de Fanconi
FACS: Clasificación de células activadas por fluorescencia; del inglés, Fluorescence-
Activated Cell Sorting
FBOC: Cáncer de mama y Ovario familiar; del inglés, familial breast and ovary cancer
FCS: Suero Fetal Bovino; del inglés, Fetal Calf Serum
Full-FA: Pacientes con Anemia de Fanconi que no presentan mosaicismo somático
HNSCC: Carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello; del inglés, Head and Neck
Squamous Cells Carcinoma.
HRR: Reparación por Recombinación Homóloga.
HSC: células madres hematopoyéticas; del inglés, Hematopoyetic Stem Cells
ICL: enlaces entrecruzado entre las dos cadenas del DNA; del inglés, Interstrand crosslinks
IF: imunofluorescencia
IGV: software de análisis: Integrative Genomics Viewer
InDel: inserciones/deleciones
IP: imunoprecipitación
IR: radiación ionizante
IRES: Sitio Interno de entrada al Ribosoma; del inglés, Internal ribosome entry site
LCL: Línea celular linfoblastoide inmortalizada
MAF: Prevalencia del Alelo Minoritario, del inglés, Minor Allele Frequency
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