Rozprawa doktorska Anita Wisniewska

249 Pages·2009·6.86 MB·Polish

Politechnika Gda(cid:1)ska
Wydział Chemiczny
Katedra Technologii Leków i Biochemii

Rozprawa doktorska

METABOLICZNA TRANSFORMACJA IN VITRO
PRZECIWNOWOTWOROWYCH POCHODNYCH
9-AMINO-1-NITROAKRYDYNY W ASPEKCIE ICH DZIAŁANIA
PRZECIWNOWOTWOROWEGO I TOKSYCZNO(cid:1)CI OGÓLNEJ

mgr in(cid:2). Anita Wi(cid:3)niewska

Promotor: dr hab. in(cid:2). Zofia Mazerska

Gda(cid:1)sk 2008
Pragn(cid:1) serdecznie podzi(cid:1)kowa(cid:2) Pani Doktor Zofii Mazerskiej
za umo(cid:3)liwienie przeprowadzenia bada(cid:4) naukowych, za wiedz(cid:1), któr(cid:5) mi przekazała,
okazan(cid:5) (cid:3)yczliwo(cid:6)(cid:2) oraz trosk(cid:1), a tak(cid:3)e za cenne i (cid:3)yczliwe uwagi podczas prowadzenia
eksperymentów
i redagowania niniejszej pracy.

Pani Doktor Ewie Augustin za (cid:3)yczliwe rady i mił(cid:5) atmosfer(cid:1) pracy
Annie Skwarskiej i Magdalenie (cid:7)lisz za wspólnie sp(cid:1)dzony czas, wiele wspólnych dyskusji oraz
duchowe wsparcie przez cały okres prowadzenia bada(cid:4).
Karolinie Jagiełło, Agnieszce Chrapkowskiej i Magdalenie Niemira za pomoc w prowadzeniu
eksperymentów.
Dorocie Nowak-Ziatyk i Joannie Koprowskiej oraz pozostałym kole(cid:3)ankom z zespołu za (cid:3)yczliwo(cid:6)(cid:2)
i mił(cid:5) atmosfer(cid:1) pracy.

Moim Kochanym Rodzicom za miło(cid:6)(cid:2) i podtrzymywanie wiary w osi(cid:5)gni(cid:1)cie zamierzonego celu.

Mojemu kochanemu m(cid:1)(cid:3)owi, Mariuszowi oraz córeczce Magdalenie za miło(cid:6)(cid:2), cierpliwo(cid:6)(cid:2)
i zrozumienienie.
SPIS TRE(cid:1)CI
1. WST(cid:4)P......................................................................................................................1
2. ZAŁO(cid:5)ENIA I CEL PRACY........................................................................................4
3. CZ(cid:4)(cid:6)(cid:7) TEORETYCZNA...........................................................................................6
3.1 Ogólne informacje o cytochromie P450...............................................................6
3.2 Struktura enzymów cytochromu P450.................................................................8
3.3 Mechanizm działania enzymów cytochromu P450............................................10
3.4 Funkcje fizjologiczne izoenzymów cytochromu P450........................................13
3.5 Typy reakcji katalizowanych przez izoenzymy cytochromu P450.....................18
3.5.1 Reakcje monooksygenacji............................................................................18
3.5.2 Reakcje izoenzymów cytochromu P450 ró(cid:2)ne od monooksygenacji...........24
3.5.3 Nietypowe reakcje izoenzymów cytochromu P450......................................31
3.6 Izoenzymy cytochromu P450 w metabolizmie ksenobiotyków..........................36
3.6.1 Polimorfizm enzymów i jego znaczenie w terapii.........................................44
3.6.2 Indukcja izoenzymów cytochromu P450......................................................47
3.7 Reduktaza cytochromu P450 (CPR).................................................................48
3.7.1 Ogólne informacje o CPR.............................................................................48
3.7.2 Struktura reduktazy cytochromu P450.........................................................50
3.7.3 Kompleks reduktazy cytochromu P450 z kofaktorami i z NADPH................50
3.7.4 Zmiany w strukturze CPR w czasie procesu katalizy...................................51
3.7.5 Mechanizm redukcji katalizowany przez CPR..............................................53
3.7.6 Kompleks cytochromu P450 z reduktaz(cid:8) cytochromu P450........................56
3.7.7 Wybrane reakcje reduktazy cytochromu P450.............................................59
3.8 Nowa hipoteza na temat cyklu katalitycznego izoenzymów cytochromu P450.62
3.9 Podsumowanie..................................................................................................63
4. OMÓWIENIE WYNIKÓW.........................................................................................65
4.1 Metabolizm pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny w obecno(cid:3)ci mieszaniny
enzymów mikrosomalnych................................................................................65
4.1.1 Przemiany zwi(cid:8)zku C-857 (Capridine a)......................................................65
4.1.2 Przebieg przemian zwi(cid:8)zku C-1748 (Capridine (cid:9)).......................................69
4.1.3 Przebieg reakcji Ledakrinu wobec frakcji enzymów mikrosomalnych
indukowanych w w(cid:8)trobie szczurów.............................................................72
4.2 Badanie produktów przemian pochodnych 1-nitroakrydyny w modelowym
układzie redukcji chemicznej w obecno(cid:3)ci ditiotreitolu (DTT)...........................77
4.2.1 Okre(cid:3)lenie struktur wybranych produktów zwi(cid:8)zku C-857 z DTT................78
4.2.2 Analiza HPLC z detekcj(cid:8) widm UV-VIS i ESI-MS dla pozostałych
produktów.....................................................................................................92
4.2.3 Barwny produkt redukcji zwi(cid:8)zku C-857.....................................................103
4.2.4 Produkty reakcji zwi(cid:8)zku C-1748...............................................................105
4.3 Identyfikacja produktów metabolizmu pochodnych C-857 i C-1748 wobec
enzymów mikrosomalnych wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczurów......120
4.3.1 Metabolity zwi(cid:8)zku C-857...........................................................................120
4.3.2 Metabolity zwi(cid:8)zku C-1748.........................................................................126
4.4 Badanie przemian metabolicznych zwi(cid:8)zków C-857 i C-1748 obserwowanych
pod wpływem ró(cid:2)nych enzymów mikrosomalnych w(cid:8)troby człowieka............130
4.4.1 C-857 wobec enzymów mikrosomalnych...................................................130
4.4.2 C-857 wobec reduktazy cytochromu P450, CPR.......................................132
i
4.4.2.1 Przemiany metaboliczne wobec CPR..................................................133
4.4.2.2 Reduktaza cytochromu P450, a enzymy mikrosomalne
w metabolizmie pochodnej C-857........................................................135
4.4.3 Biotransformacja zwi(cid:8)zku C-857 wobec rekombinantowych izoform
cytochromu P450: CYP1A2, CYP2C19, CYP3A4......................................137
4.4.4 Przemiany zwi(cid:8)zku C-1748 (Capridine (cid:9)) wobec ludzkich enzymów
mikrosomalnych..........................................................................................142
4.4.5 C-1748 wobec reduktazy cytochromu P450 (CPR)....................................143
4.4.5.1 Przemiany metaboliczne zwi(cid:8)zku C-1748 wobec CPR........................144
4.4.5.2 Reduktaza cytochromu P450, a enzymy mikrosomalne
w metabolizmie pochodnej C-1748......................................................145
4.4.6 Zwi(cid:8)zek C-1748 (Capridine (cid:9)) wobec wybranych izoform cytochromu
P450: CYP1A2, CYP2C19, CYP3A4..........................................................147
4.4.7 Biotransformacja pochodnych 1-nitroakrydyny wobec ludzkich enzymów
mikrosomalnych z zastosowaniem tzw. Reaction Phenotyping Kit, RPK...149
4.4.7.1 Badanie przemian zwi(cid:8)zku C-857 i C-1748 wobec RPK......................150
4.5 Biotransformacja zwi(cid:8)zków C-857 i C-1748 wobec enzymów mikrosomalnych
wyizolowanych z w(cid:8)troby myszy o obni(cid:2)onym poziomie ekspresji genu
NADPH-zale(cid:2)nej reduktazy cytochromu P450................................................157
4.5.1 Transformacja C-857..................................................................................157
4.5.2 Transformacja C-1748................................................................................159
4.5.2.1 Eliminacja zwi(cid:8)zku C-1748 z organizmu myszy o normalnym, WT
i obni(cid:2)onym poziomie reduktazy P450.................................................161
4.6 Wpływ struktury chemicznej 1-nitroakrydyn na przemiany metaboliczne
w wybranych układach enzymatycznych.........................................................162
4.6.1 Biotransformacja Ledakrinu w obecno(cid:3)ci izoenzymów cytochomu P450
z ró(cid:2)nym poziomem koekspresji reduktazy cytochromu P450...................163
4.6.2 Przemiany metaboliczne Ledakrinu w obecno(cid:3)ci mysich enzymów
mikrosomalnych o normalnej, WT i obni(cid:2)onej, HRN, ekspresji genu
NADPH – reduktazy cytochromu P450......................................................166
4.6.3 Metabolizm zwi(cid:8)zku C-450 w obecno(cid:3)ci ludzkich rekombinantowych
izoenzymów CYP1A2, 2C19 i CYP3A4......................................................167
4.6.4 Przemiany metaboliczne zwi(cid:8)zku C-450 w obecno(cid:3)ci enzymów
mikrosomalnych wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy WT i HRN.....170
4.6.5 Podsumowanie. Rola struktury ła(cid:1)cucha bocznego...................................171
4.6.6 Podsumowanie. Rola grupy metylowej.......................................................175
4.7 Przemiany metaboliczne pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny w komórkach
ludzkiego nowotworu w(cid:8)troby, HepG2............................................................180
4.7.1 Badania wst(cid:10)pne – cytotoksyczno(cid:3)(cid:11) i opracowanie metody otrzymywania
i izolacji metabolitów...................................................................................180
4.7.2 Przemiany metaboliczne Ledakrinu............................................................183
4.7.3 Metabolizm zwi(cid:8)zku C-857 ( Capridine (cid:12) ).................................................185
4.7.4 Przemiany zwi(cid:8)zku C-1748 ( Capridine b )................................................187
4.7.5 Obserwacje metabolitów pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny
powstaj(cid:8)cych w komórkach HepG2, przy wykorzystaniu techniki
mikroskopii..................................................................................................189
5. CZ(cid:4)(cid:6)(cid:7) EKSPERYMENTALNA..............................................................................194
5.1 Badane zwi(cid:8)zki................................................................................................194
5.2 Odczynniki chemiczne i kofaktory...................................................................195
5.3 Enzymy............................................................................................................195
5.4 Komórki ludzkiej linii nowotworu w(cid:8)troby hepatoma, HepG2..........................196
5.5 Roztwory buforowe..........................................................................................197
ii
5.6 Aparatura.........................................................................................................198
5.7 Procedury........................................................................................................199
5.7.1 Metabolizm pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny w obecno(cid:3)ci enzymów
mikrosomalnych wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczurów o ró(cid:2)nej
ekspresji izoenzymów cytochromu P450....................................................199
5.7.2 Redukcja chemiczna zwi(cid:8)zków C-857 i C-1748 w obecno(cid:3)ci ditiotreitolu,
DTT.............................................................................................................201
5.7.2.1 Analiza chromatograficzna w skali analitycznej....................................201
5.7.2.2 Analiza chromatograficzna półpreparatywna i izolacja głównych
produktów redukcji zwi(cid:8)zków C-857. i C-1748.....................................202
5.7.2.3 Barwny produkt przemian zwi(cid:8)zku C-857............................................204
5.7.3 Przemiany pochodnych 1-nitroakrydyny wobec ludzkich enzymów
mikrosomalnych..........................................................................................205
5.7.4 Przemiany metaboliczne wobec CPR........................................................207
5.7.4.1 Analiza spektrofotometryczna..............................................................207
5.7.4.2 Analiza chromatograficzna...................................................................207
5.7.5 Biotransformacja Ledakrinu i zwi(cid:8)zków C-857, C-1748 oraz C-450 wobec
wybranych izoform cytochromu P450: CYP1A2, CYP2C19, CYP3A4.......209
5.7.6 Biotransformacja zwi(cid:8)zków C-857 i C-1748 wobec ludzkich enzymów
mikrosomalnych z zastosowaniem tzw. Reaction Phenotyping Kit, RPK...210
5.7.7 Przemiany pochodnych 1-nitroakrydyny wobec mysich enzymów
mikrosomalnych z prawidłowym WT i obni(cid:2)onym, HRN poziomem
ekspresji genu NADPH-reduktazy cytochromu P450.................................210
5.7.7.1 Izolacja frakcji mikrosomalnej z komórek w(cid:8)troby myszy.....................210
5.7.7.2 Oznaczanie st(cid:10)(cid:2)enia białka w enzymach mikrosomalnych
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy...........................................211
5.7.7.3 Inkubacja enzymów ze zwi(cid:8)zkami C-857, C-1748, C-450 oraz
z Ledakrinem........................................................................................212
5.7.8 Przemiany metaboliczne pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny
w komórkach ludzkiego nowotworu w(cid:8)troby, hepatoma, HepG2...............213
5.7.8.1 Hodowla komórek HepG2....................................................................213
5.7.8.2 Oznaczanie aktywno(cid:3)ci cytotoksycznej pochodnych
9-amino-1-nitroakrydyny wobec komórek nowotworowych HepG2
metod(cid:8) MTT.........................................................................................213
5.7.8.3 Izolacja metabolitów z komórek HepG2 traktowanych Ledakrinem,
zwi(cid:8)zkiem C-857 i C-1748....................................................................214
5.7.8.4 Obserwacje komórek HepG2 traktowanych pochodnymi
1-nitroakrydyny przy zastosowaniu techniki mikroskopii......................216
6. DYSKUSJA WYNIKÓW I WNIOSKI.......................................................................218
7. STRESZCZENIE....................................................................................................229
8. LITERATURA.........................................................................................................235

iii
WYKAZ STOSOWANYCH SKRÓTÓW

C st(cid:10)(cid:2)enie powstaj(cid:8)cych produktów przemian metabolicznych
C produkt metabolizmu Ledakrinu wobec CYPs (n = 1, 2...)
L
C produkt metabolizmu C-857 wobec ludzkich rekombinantowych
n
izoenzymów cytochromu P450 (n = 1, 2...)
C ’ produkt metabolizmu C-1748 wobec ludzkich rekombinantowych
n
izoenzymów cytochromu P450 (n = 1, 2...)
C produkt metabolizmu Ledakrinu wobec ludzkich rekombinantowych
L
izoenzymów cytochromu P450 (n = 1, 2...)
C ’ produkt metabolizmu Ledakrinu wobec ludzkich rekombinantowych
L
izoenzymów cytochromu P450 (n = 1, 2...)
CPR NADPH zale(cid:2)na reduktaza cytochromu P450
cpr gen koduj(cid:8)cy NADPH-reduktaz(cid:10) cytochromu P450
CYP H i L izoenzymy cytochromu P450 z wysokim i niskim poziomem
koekspresji NADPH-reduktazy cytochromu P450
DMSO dimetylosulfotlenek
D produkt reakcji C-857 z ditiotreitolem (n = 1, 2...)
n
D ’ produkt reakcji C-1748 z ditiotreitolem (n = 1, 2...)
n
DTT ditiotreitol
E enzymy mikrosomalne wyizolowane z komórek w(cid:8)troby szczurów,
którym podano leki podwy(cid:2)szaj(cid:8)ce ekspresj(cid:10) z wybranych grup
izoenzymów cytochromu P450
EC numer enzymu przypisany przez Komitet Nazewnictwa
Mi(cid:10)dzynarodowej Unii Biochemicznej i Biologii Molekularnej
EC st(cid:10)(cid:2)enie zwi(cid:8)zku przy którym proliferacja komórek nowotworowych
50
została zahamowana w 50%
ESI-MS „Electrospray Ionization Mass Spectrometry” – technika spektrometrii
masowej z jonizacj(cid:8) próbki
FMO monooksygenazy flawinoadeninowe
GST S-transferazy glutationowe
HR-MS „High Resolution Mass Spektrometry”-spektrometria mas wysokiej
rozdzielczo(cid:3)ci
HRN frakcja mikrosomalna wyizolowana z komórek w(cid:8)troby myszy
z nokautem genu koduj(cid:8)cego NADPH-reduktaz(cid:10) cytochromu P450
K ’ produkty metabolizmu C-1748 powstaj(cid:8)ce komórkach HepG2
n
MS „Mass Spectrometry” - spektrometria masowa
M frakcja ludzkich enzymów mikrosomalnych
L
i
M enzymy mikrosomalne wyizolowane z komórek w(cid:8)troby myszy
m
M produkt metabolizmu C-857 w obecno(cid:3)ci ludzkich enzymów
n
mikrosomalnych (n = 1, 2...)
M ’ produkt metabolizmu C-1748 w obecno(cid:3)ci ludzkich enzymów
n
mikrosomalnych (n = 1, 2...)
M enzymy mikrosomalne wyizolowane z komórek w(cid:8)troby szczura
S
MS/MS tandemowa spektrometria masowa
MTT barwnik stosowany do oznaczenia aktywno(cid:3)ci cytotoksycznej
zwi(cid:8)zków w komórkach.
N produkt metabolizmu C-857 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy (n = 1, 2...)
N ’ produkt metabolizmu C-1748 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy (n = 1, 2...)
N produkt metabolizmu Ledakrinu wobec enzymów mikrosomalnych
L
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy (n = 1, 2...)
N ’ produkt metabolizmu C-450 wobec enzymów mikrosomalnych
L
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby myszy (n = 1, 2...)
NAT N-acetylotransferaza
NMR „Nuclear Magnetic Resonance” - Spektroskopia Magnetycznego
Rezonansu J(cid:8)drowego
L Produkt metabolizmu Ledakrinu wobec enzymów mikrosomalnych
n
z podwy(cid:2)szonym poziomem ekspresji wybranych izoenzymów
cytochromu P450
P produkt metabolizmu C-857 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczura (n = 1, 2...)
P ’ produkt metabolizmu C-1748 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczura (n = 1, 2...)
Pa produkt metabolizmu C-857 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczurów, którym podano zwi(cid:8)zki
podnosz(cid:8)ce poziom izoenzymów z wybranych rodzin enzymów
cytochromu P450 (n = 1, 2...)
Pa ’ produkt metabolizmu C-1748 wobec enzymów mikrosomalnych
n
wyizolowanych z komórek w(cid:8)troby szczurów, którym podano zwi(cid:8)zki
podwy(cid:2)szaj(cid:8)ce poziom izoenzymów z wybranych rodzin enzymów
cytochromu P450 (n = 1, 2...)
ppm jednostka st(cid:10)(cid:2)enia – jedna cz(cid:10)(cid:3)(cid:11) na 100000.0
R produkt metabolizmu C-857 w obecno(cid:3)ci reduktazy cytochromu P450
n
(n = 1, 2...)
ii
R ’ produkt reakcji C-1748 w obecno(cid:3)ci reduktazy cytochromu P450
n
(n = 1, 2...)
RPK „Reaction Phenotyping Kit” - zbiór próbek enzymów mikrosomalnych
w(cid:8)troby pobranych od ró(cid:2)nych pacjentów
RP produkt biotransformacji C-857 wobec RPK (n = 1, 2...)
n
RP ’ produkt biotransformacji C-1748 wobec RPK (n = 1, 2...)
n
S substrat
S Stopie(cid:1) przereagowania substratu
S
UGT UDP-gluronylotransferaza
WT frakcja mikrosomalna wyizolowana z komórek w(cid:8)troby myszy typu
dzikiego

iii
Wst(cid:1)p
1. WST(cid:2)P

Nowotwory stanowi(cid:8) obecnie jedn(cid:8) z najgro(cid:13)niejszych chorób n(cid:10)kaj(cid:8)cych
ludzko(cid:3)(cid:11). Liczba zachorowa(cid:1) stale ro(cid:3)nie, a jest to głównie spowodowane zmianami
cywilizacyjnymi (cid:3)rodowiska oraz wydłu(cid:2)eniem (cid:3)redniego wieku (cid:2)ycia ludzi. Według
danych National Cancer Institute, Bethesda, USA, z roku 2007 [1], liczba chorych w tym
kraju przekroczyła ju(cid:2) 1,5 miliona, z czego jedna trzecia przypadków rocznie ko(cid:1)czy si(cid:10)
(cid:3)mierci(cid:8). Dlatego wci(cid:8)(cid:2) trwaj(cid:8) badania w dziedzinie terapii nowotworów, maj(cid:8)ce
na celu przede wszystkim opracowanie skuteczniejszych metod profilaktyki,
diagnozowania, ale przede wszystkim leczenia tych chorób.
W Katedrze Technologii Leków i Biochemii Politechniki Gda(cid:1)skiej, w zespole
kierowanym przez prof. Jerzego Konop(cid:10) od wielu lat trwaj(cid:8) poszukiwania nowych
zwi(cid:8)zków przeciwnowotworowych, a tak(cid:2)e kontynuowane s(cid:8) badania nad znanymi ju(cid:2)
zwi(cid:8)zkami o wła(cid:3)ciwo(cid:3)ciach przeciwnowotworowych.
Jedn(cid:8) z interesuj(cid:8)cych grup zwi(cid:8)zków przeciwnowotworowych s(cid:8) zsyntetyzowane
w naszym zespole, pochodne 9-amino-1-nitroakrydyny, które wykazywały wysok(cid:8)
aktywno(cid:3)(cid:11) cytotoksyczn(cid:8) i przeciwnowotworow(cid:8). Czołowym przedstawicielem tej grupy
zwi(cid:8)zków, który znalazł kliniczne zastosowanie w terapii nowotworów był pierwszy
oryginalny polski lek przeciwnowotworowy – Ledakrin, Nitracrine R [2-10]. Wysoka
toksyczno(cid:3)(cid:11) tego leku po kilku latach wykluczyła go jednak z listy dopuszczalnych
preparatów leczniczych. Obiecuj(cid:8)c(cid:8) pochodn(cid:8) 1-nitroakrydyny był zwi(cid:8)zek o symbolu
C-857, ró(cid:2)ni(cid:8)cy si(cid:10) od Ledakrinu struktur(cid:8) ła(cid:1)cucha bocznego, który wykazywał lepsze
wła(cid:3)ciwo(cid:3)ci farmakologiczne, ale nie został poddany badaniom klinicznym [11].
Poszukiwania nowych, mniej toksycznych analogów 1-nitroakrydyny doprowadziły do
wyłonienia nowej generacji pochodnych – zwi(cid:8)zków z dodatkowym podstawnikiem
w pier(cid:3)cieniu akrydyny, grup(cid:8) metylow(cid:8) w pozycji 4 [12]. Jeden z nich, zwi(cid:8)zek C-1748,
wykazał wysok(cid:8) aktywno(cid:3)(cid:11) przeciwnowotworow(cid:8) w stosunku do kilku
ksenoprzeszczepów ludzkich raków prostaty u bezgrasiczych myszy: LnCAP, JCA, PC-3,
TSU oraz ludzkiego raka jelita grubego HCT-8 [12,14]. Badania przedkliniczne zwi(cid:8)zku
C-1748 dowiodły, (cid:2)e jest on aktywny nie tylko w stosunku do raka gruczołu prostaty, który
według najnowszych danych stanowi drug(cid:8) po nowotworze płuc przyczyn(cid:10) zgonów
m(cid:10)(cid:2)czyzn w USA [1], ale tak(cid:2)e wobec: komórek białaczki, raka płuc, jajnika, nerki, jelita
grubego oraz komórek czerniaka [15]. Aktywno(cid:3)(cid:11) przeciwnowotworowa wobec ci(cid:8)gle
trudnych w terapii wymienionych powy(cid:2)ej nowotworów litych, ni(cid:2)sza aktywno(cid:3)(cid:11)
mielosupresyjna w porównaniu z innymi stosowanymi chemoterapeutykami
przeciwnowotworowymi oraz słabsze działanie mutagenne [15-18], pozwoliły
wyselekcjonowa(cid:11) zwi(cid:8)zek C-1748 ( Capridine b ) do I fazy bada(cid:1) klinicznych. Istotn(cid:8)
1
Wst(cid:1)p
cech(cid:8) tego zwi(cid:8)zku jest wykazana znacznie obni(cid:2)ona w stosunku do Ledakrinu i C-857
toksyczno(cid:3)(cid:11) ogólna na zwierz(cid:10)tach [15].
Badania nad mechanizmem działania pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny
pozwoliły m.in. sformuowa(cid:11) hipotez(cid:10), i(cid:2) ulegaj(cid:8) one w organizmie metabolicznej aktywacji
[5-7]. Aktywacja ta prowadzi do powstania analogów o silniejszym działaniu biologicznym,
które nast(cid:10)pnie zdolne s(cid:8) do bezpo(cid:3)redniej reakcji z biomolekułami np. z DNA, przy czym
przebieg tego ostatniego etapu jest odpowiedzialny za ko(cid:1)cowy efekt biologiczny.
Oddziaływanie pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny z DNA w warunkach redukcyjnych,
enzymatycznych i chemicznych prowadzi do kowalencyjnego wi(cid:8)zania si(cid:10) tych zwi(cid:8)zków
do DNA. Obserwuje si(cid:10) równie(cid:2) mi(cid:10)dzyła(cid:1)cuchowe wi(cid:8)zanie sieciuj(cid:8)ce DNA [7]. Wobec
powy(cid:2)szego stanu wiedzy o aktywno(cid:3)ci biologicznej i biochemicznym mechanizmie
działania pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny oraz udziału w tym mechanizmie
procesów metabolicznej aktywacji, przedmiotem niniejszej pracy s(cid:8) badania przemian
metabolicznych pochodnych 9-amino-1-nitroakrydyny w ró(cid:2)nych układach modelowych.
Badanie metabolicznej aktywacji potencjalnych leków, a w szczególno(cid:3)ci zwi(cid:8)zków
przeciwnowotworowych, zmierzaj(cid:8) do poznania chemicznych i biochemicznych szlaków
przemian tych zwi(cid:8)zków oraz do okre(cid:3)lenia chemicznych struktur powstaj(cid:8)cych
metabolitów, które mog(cid:8) powstawa(cid:11) w organizmie człowieka. Jednak realizacja takiego
celu w skomplikowanym układzie biologicznym wymaga wst(cid:10)pnych bada(cid:1) modelowych
poniewa(cid:2):
a) produkty aktywacji metabolicznej czyli tzw. reakcji metabolicznych I fazy
odpowiedzialne za mechanizm działania leku s(cid:8) zwykle bardzo reaktywne,
a ilo(cid:3)ci ich nie pozwalaj(cid:8) na przeprowadzenie pełnych bada(cid:1) strukturalnych
b) wyizolowanie trwałych produktów detoksykacji ksenobiotyków powstaj(cid:8)cych
w wyniku reakcji II fazy metabolizmu, które s(cid:8) pochodnymi kwasów
glukuronowych czy konjugatami z glutationem, pozwala na wysuni(cid:10)cie jedynie
po(cid:3)rednich wniosków o strukturach reaktywnych metabolitów.
Wobec tego, zgodnie z aktualnym stanem wiedzy, badania nad przemianami
metabolicznymi leków prowadzi si(cid:10) w kilku etapach pocz(cid:8)wszy od prostych układów
modelowych do skomplikowanych układów w organizmie człowieka [19,20]. Przemiany
metaboliczne bada si(cid:10) :
1. w obecno(cid:3)ci wyizolowanych specyficznych enzymów
2. w obecno(cid:3)ci ró(cid:2)nych czynników chemicznych
3. z zastosowaniem wyizolowanych frakcji enzymów komórek w(cid:8)troby
4. w komórkach hodowanych in vitro, np. hepatocytach czy komórkach
nowotworowych
5. w organizmie zwierz(cid:8)t i człowieka
2