RNAi-vermittelter knockdown zur Identifikation von Zielgenen für die Verbesserung von ...

225 Pages·2013·13.73 MB·German

RNAi-vermittelter knockdown zur
Identifikation von Zielgenen für die
Verbesserung von Produktionszelllinien
Dissertation
zur Erlangung des Grades Doktor der Naturwissenschaften (Dr.rer.nat)
der
Universität Bielefeld
vorgelegt von
Oliver Krämer, M.Sc.
geboren am 28. Oktober 1983
in Salzkotten
Oktober 2012

Die vorliegende Dissertation wurde in der Arbeitsgruppe Zellkulturtechnik der Tech-
nischen Fakultät der Universität Bielefeld unter Anleitung von Prof. Dr. Thomas Noll
angefertigt.
Gedruckt mit Genehmigung der technischen Fakultät der Universität Bielefeld.
1. Gutachter: Prof. Dr. Thomas Noll
AG Zellkulturtechnik
Technische Fakultät
Universität Bielefeld
2. Gutachter: PD Dr. Andreas Tauch
Medizinische Mikrobiologie und Genomik
Center for Biotechnology – CeBiTec
Universität Bielefeld
3. Gutachter: Prof. Dr. Kristian Müller
AG Zelluläre und molekulare Biotechnologie
Technische Fakultät
Universität Bielefeld
Tag der Disputation: 04.07.2013
Im Rahmen dieser Arbeit entstanden folgende Veröffentlichungen:
Konferenz-Beitrag / Posterpräsentation:
Sandra Klausing*, Oliver Krämer*, Thomas Noll (2011) Bioreactor cultivation of CHO
DP-12 cells under sodium butyrate treatment - comparative transcriptome analysis with CHO
cDNA microarrays. BMC Proc. 2011 Nov 22;5 Suppl 8:P98.; Präsentiert auf der ESACT
2011, Wien (* authors contributed equally)
Veröffentlichung:
Oliver Krämer, Sandra Klausing, Thomas Noll (2010) Methods in mammalian cell line
engineering: from random mutagenesis to sequence-specific approaches. Appl Microbiol Bio-
technol. 2010 Sep;88(2): 425-36.
Patentanmeldung:
Method for recombinant protein production in mammalian cells,ApplicationNo./PatentNo.
13177678.3 - 1403, Date of filing: 23.07.2013
Für meine Eltern und meine Schwester
„Die Neugier ist die mächtigste Antriebskraft im Universum,
weil sie die beiden größten Bremskräfte im Universum
überwinden kann: die Vernunft und die Angst.“
(Walter Moers – Die Stadt der Träumenden Bücher)

Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung 1
2 Abstract 3
3 Theorie 5
3.1 Strategien zur Zelllinienentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.2 RNA-Interferenz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.1 RNA-Interferenz - von der Cosuppression bis zu den ARGONAUT-
Proteinen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
3.2.2 RNAi-vermitteltes silencing einer mRNA . . . . . . . . . . . . . . . 11
3.2.3 Richtlinien für effektive siRNA-Sequenzen . . . . . . . . . . . . . . . 14
3.2.4 RNAi als Methode in biotechnologischen Fragestellungen . . . . . . . 15
3.3 Zinkfinger-Nukleasen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
3.3.1 Gezielter knockout mit ZF-Nukleasen unter Verwendung des context-
depent assembly (CoDA)-Systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
3.3.2 Verwendung von ZF-Nukleasen in biotechnologischen Fragestellungen 23
3.4 Potentielle Ziel- bzw. Produktgene für die Zelllinienentwicklung . . . . . . . 24
3.4.1 SET nuclear oncogene (SET) – ein Inhibitor der Histon-Acetylierung 24
3.4.2 Der pro-apoptotische Bcl-2-associated death promoter (BAD) . . . . 26
3.4.3 Galectin-1 (LGALS1) – Ein Multifunktionsprotein . . . . . . . . . . 29
3.4.4 Das PHD finger protein 3 (PHF3) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
3.4.5 Das Yippee-like 3-Protein (YPEL3). . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
3.4.6 Struktur und Funktion von Erythropoetin und der Glykosylierungs-
variante Darbepoetin alfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
3.5 Motivation der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
4 Material und Methoden 37
4.1 Mikrobiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.1.1 Kultivierung von Escherichiacoli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
4.1.2 Herstellung chemisch kompetenter E.coli-Zellen . . . . . . . . . . . . 38
4.1.3 Hitzeschocktransformation chemisch kompetenter Bakterien . . . . . 39
II Inhaltsverzeichnis
4.2 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2.1 Polymerasekettenreaktion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
4.2.1.1 PCR mit der proofreading KAPAHiFiTM-DNA-Polymerase 40
4.2.1.2 Kolonie-PCR und analytische PCRs mit der DreamTaqTM-
Green-DNA-Polymerase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
4.2.1.3 PCR-Mutagenese mit dem Change-ITTM Multiple Mutation
Site Directed Mutagenesis Kit . . . . . . . . . . . . . . . . 42
4.2.2 Oligonukleotid-Hybridisierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
4.2.3 Verwendete Primer, Plasmide und Oligonukleotide . . . . . . . . . . 45
4.2.4 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . 45
4.2.5 Restriktionsspaltung und Dephosphorylierung . . . . . . . . . . . . . 46
4.2.6 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
4.2.7 Agarosegelelektrophorese. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
4.2.8 DNA-Extraktion aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.2.9 Reinigung von Plasmid-DNA und PCR-Ansätzen zur Entfernung von
DNA-Fragmenten oder Abreicherung von Enzymen . . . . . . . . . . 49
4.2.10 Plasmidisolierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.2.11 RNA-Isolierung aus eukaryotischen Zellen . . . . . . . . . . . . . . . 51
4.2.12 Herstellung von complementary-DNA durch reverse Transkription . . 52
4.2.13 Quantitative real-time-PCR (qRT-PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . 53
4.2.14 Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur-Material . . . . . . . . . 56
4.2.15 SURVEYOR(cid:13)R-Nuklease-Assay zur Detektion von knockout-Mutatio-
nen in genomischer DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
4.2.16 Vorbehandlung von PCR-Amplifikaten zur direkten Sequenzierung . 58
4.2.17 DNA-Sequenzierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.2.18 Sequenzvergleich mit dem BLAST-Algorithmus . . . . . . . . . . . . 59
4.3 Zellkultur-Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.3.1 Zelllinien und Kulturmedien . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
4.3.2 Stammhaltung und Zellpassagierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
4.3.3 Automatische Zelldichte- und Viabilitätsbestimmung mit dem Cedex 63
4.3.4 Kryokonservierung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
4.3.5 Fed-Batch Kultivierung im Shaker-Maßstab . . . . . . . . . . . . . . 64
4.3.6 Durchflusszytometrische Analyse von Zellkulturen (FACS) . . . . . . 64
4.3.7 Transfektion durch Nukleofektion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
4.3.8 Herstellung pseudotypisierter Lentiviren . . . . . . . . . . . . . . . . 66
4.3.9 Virusernte und Transduktion von CHO-Zellen . . . . . . . . . . . . . 67
Inhaltsverzeichnis III
4.4 Bioreaktorkultivierung und differentieller Microarray . . . . . . . . . . . . . 68
4.4.1 Kultivierung von tierischen Zellen im geregelten Bioreaktor . . . . . 68
4.4.2 Probenahme während der Bioreaktorkultivierung und Injektion von
Natriumbutyrat . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4.4.3 DifferentielleAnalysederGenexpressionmiteinemcustom-cDNA-Mi-
croarray . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.5 Analytik der Zellkulturprozesse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.5.1 Glukose- / Laktat-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.5.2 Aminosäure-Konzentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.5.3 Antikörperbestimmung durch Protein A-Affinitätschromatographie . 72
4.5.4 Bestimmung der EPO/DARBE-Produktkonzentration . . . . . . . . 72
4.6 Berechnung zellspezifischer Parameter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
4.6.1 Berechnung der spezifischen Wachstumsrate µ . . . . . . . . . . . . . 73
4.6.2 Berechnung der Produkt- und Substratbildungs- bzw. -verbrauchsrate 73
5 Ergebnisse und Diskussion 75
5.1 Etablierung von Methoden für die nachfolgenden RNAi-Experimente . . . . 76
5.1.1 Ermittlung geeigneter Nukleofektionsparameter für die Modell-Zellli-
nie CHO DP-12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5.1.2 Kill curve-ExperimentzurErmittlungdereinzusetzendenPuromycin-
Konzentration zur Selektion in CHO DP-12-Zellen . . . . . . . . . . 77
5.1.3 Erzeugung von stabilen pLVX-shRNA1-CHO DP-12-Zellen . . . . . 80
5.1.4 Verifikation der Spezifität der für die qRT-PCR eingesetzten Primer 81
5.2 RNAi-knockdown von Zielgenen für die Zelllinienentwicklung . . . . . . . . . 83
5.2.1 Knockdown der Set-mRNA in CHO DP-12-Zellen . . . . . . . . . . . 83
5.2.1.1 Herstellung der lentiviralen shRNA-Expressionsvektoren ge-
gen die Set-mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
5.2.1.2 Evaluation der knockdown-Effizienz verschiedener shRNA-
Sequenzen gegen Set . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.2.1.3 Persistenter knockdown von Set durch lentivirale Transduk-
tion eines shRNA-exprimierenden Plasmids . . . . . . . . . 88
5.2.2 Knockdown der Bad-mRNA in CHO DP-12-Zellen . . . . . . . . . . 91
5.2.2.1 Herstellung der lentiviralen shRNA-Expressionsvektoren ge-
gen die Bad-mRNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
5.2.2.2 Transienter knockdown von Bad zur Beurteilung der silen-
cing-Effizienz der shRNAs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
IV Inhaltsverzeichnis
5.2.2.3 Etablierung eines stabilen anti-Bad-shRNA-exprimierenden
CHO DP-12-Zellpools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
5.2.3 Knockdown der Lgals1-mRNA in CHO DP-12-Zellen . . . . . . . . . 97
5.2.3.1 Konstruktion lentiviraler Transfervektoren mit shRNA-Se-
quenzen zum knockdown von Lgals1 . . . . . . . . . . . . . 98
5.2.3.2 Evaluation des transienten knockdowns von Lgals1 . . . . . 99
5.2.3.3 Erzeugung von stabil anti-Lgals1-shRNA exprimierenden
CHO DP-12-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
5.2.4 Test der knockdown-Effizienz verschiedener shRNAs gegen die mRNA
von Ypel3 und Phf3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103
5.2.5 Batch-Kultivierung der CHO DP-12-Parentalzelle, der pLVX-, Set-
kd-, Bad-kd- und Lgals1-kd-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
5.2.6 Shaker-Fed-Batch-Parallelkultivierung der CHO DP-12-Parentalzelle,
des pLVX-, Set-kd-, Bad-kd- und Lgals1-kd-Zellpools . . . . . . . . . 119
5.2.7 ZusammenfassendeInterpretationderErgebnisseausBatch-undFed-
Batch-Kultivierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 127
5.2.8 Stabilitätstests der genetischen Modifikation einer Zelllinie durch len-
tiviralen Transfer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 134
5.3 Alternative Strategie zum knockout eines Gens mittels der ZFN-Technologie 136
5.3.1 Erzeugung der ZFN-Expressionsvektoren . . . . . . . . . . . . . . . . 138
5.3.2 Transfektion adhärenter CHO K1-Zellen mit ZFN-Expressionsplasmi-
den und Evaluation eines möglichen knockouts . . . . . . . . . . . . 139
5.4 Herstellung von Erythropoetin- und Darbepoetin alfa-produzierenden CHO-
Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
5.4.1 Erzeugung des eukaryotischen Expressionsvektors pCMVMIE basie-
rend auf pcDNATM3.1(+) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
5.4.2 Konstruktion von pCMVMIE-Epo und pCMVMIE-Darbe . . . . . . 146
5.4.3 Ermittlung geeigneter Nukleofektionsparameter und kill curve-Expe-
riment mit Geneticin in CHO K1-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . 147
5.4.4 Herstellung der stabilen CHO-EPO und CHO-DARBE-Zellpools . . 150
5.4.5 Batch-Parallelkultivierung der verschiedenen CHO-EPO- und CHO-
DARBE-exprimierenden Zellpools . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153
6 Ausblick 163
7 Literaturverzeichnis 167