Régulation de l'expression de Rnd3 dans les cellules tumorales

282 Pages·2017·14.63 MB·French

by  Leo Piquet

Régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules
tumorales
Leo Piquet
To cite this version:
Leo Piquet. Régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules tumorales. Médecine humaine et
pathologie. Université de Bordeaux, 2016. Français. ￿NNT: 2016BORD0272￿. ￿tel-01531834￿
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THÈSE PRÉSENTÉE
POUR OBTENIR LE GRADE DE :

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE
DE BORDEAUX
ÉCOLE DOCTORALE Science de la vie et de la santé
SPÉCIALITÉ Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Par Léo Piquet
Régulation de l’expression de Rnd3 dans les
cellules tumorales
Sous la direction du Dr. Violaine Moreau

Soutenue le 1er décembre 2016 à Bordeaux

Membres du jury :
Dr. Violaine Moreau...................................................................................................................Directrice de thèse
Directrice de recherche, INSERM, BORDEAUX
Pr. Martin Teichmann.................................................................................................................Président du jury
Professeur des Universités, INSERM, BORDEAUX
Dr. Athanassia Sotiropoulos.......................................................................................................Rapporteur
Directrice de recherche, INSERM, PARIS
Dr. Cécile Gauthier-Rouvière......................................................................................................Rapporteur
Directrice de recherche, CNRS, MONTPELLIER
Régulation de l’expression de Rnd3 dans les cellules tumorales
La protéine Rnd3 est un membre atypique de la famille des Rho GTPases. Dénuée
d’activité GTPasique, elle est ainsi constitutivement sous forme active et liée au GTP. La
régulation de cette protéine ne passe donc pas par le cycle classique des Rho GTPases mais
par d’autres mécanismes transcriptionnels, post-transcriptionnels ou encore traductionnels.
Dans le carcinome hépatocellulaire (CHC), Rnd3 est significativement sous-exprimée, et cette
sous-expression procure un avantage invasif aux hépatocytes. Ce projet de thèse avait pour
objectif de déterminer plus précisément les mécanismes à la base de la régulation de Rnd3
dans les cellules tumorales, et notamment les cellules dérivées de carcinome hépatocellulaire.
Les travaux de cette thèse ont été divisés en deux axes principaux. Dans une première partie,
la régulation de Rnd3 par la β-caténine a été étudiée. En effet, la β-caténine est retrouvée
mutée dans plus d’un tiers des CHC, et la présence de mutations activatrices de la β-caténine
corrèle avec un faible niveau d’expression de Rnd3 dans les CHC. L’établissement d’un modèle
original dans les cellules de CHC, HepG2, a permis d’étudier indépendamment l’implication de
la β-caténine sauvage et la β-caténine mutée dans la régulation d’expression de Rnd3. Ce
modèle a permis de mettre en évidence une régulation différentielle de Rnd3 par les deux
formes de la β-caténine, la forme sauvage régulant Rnd3 au niveau transcriptionnel, et la
forme mutée régulant Rnd3 au niveau post-transcriptionnel. La deuxième partie de ce travail,
qui constitue la partie principale du projet, s’est intéressée à la régulation de Rnd3 par la voie
de mécanotransduction MRTF/SRF. L’activation de cette voie de signalisation est très
intimement reliée à l’organisation du cytosquelette d’actine, et cette voie régule en retour
l’expression de nombreux gènes impliqués dans la dynamique de l’actine. Les résultats
obtenus ont permis de déterminer Rnd3 comme une nouvelle cible directe de la voie
MRTF/SRF dans les cellules tumorales, et placent Rnd3 au centre d’une boucle de régulation
de cette voie de mécanotransduction. L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet
de thèse ont permis de mieux caractériser la régulation de l’expression de Rnd3 dans les
cellules tumorales.

Regulation of Rnd3 expression in tumor cells
Rnd3 protein is an atypical member of the Rho GTPase family, devoid of GTPase activity and
constitutively active and bound to GTP. Rnd3 regulation does not occur through the classical
GTPase cycle but is achieved at transcriptional, posttranscriptional or translational level. Rnd3
is underexpressed in hepatocellular carcinoma (HCC), and this down-regulation increases HCC
cell invasion and is linked to HCC progression. The aim of this thesis project was to better
decipher the mechanisms involved in Rnd3 expression in tumor cells, and particularly in HCC
cells. In a first part, Rnd3 regulation by β-catenin was studied. β-catenin is found mutated in
one third of HCC, and activating β-catenin mutations in human HCC correlates with the lowest
levels of Rnd3. An original model established in HepG2 cells allowed the study of the
involvement of WT β-catenin versus mutated β-catenin in the regulation of Rnd3 expression.
Interestingly, our results demonstrated that both forms of ß-catenin independently regulate
Rnd3 mRNA expression. The WT β-catenin regulates Rnd3 at the transcriptional level, whereas
the mutated β-catenin acts through the 3’UTR of Rnd3 mRNA. The second and main part of
this thesis project was the study of the regulation of Rnd3 expression by the
mechanotransduction pathway MRTF/SRF. The activation of this signaling pathway is tightly
regulated by actin cytoskeleton, and the MRTF/SRF pathway directs in return the expression
of a huge number of genes involved in actin dynamics. Our results uncovered Rnd3 as a new
direct target of MRTF/SRF pathway in tumor cells. Indeed, upon actin dynamics changes,
MRTF/SRF is able to bind Rnd3 promoter in order to favor its expression. As Rnd3 also acts as
a regulator of the actin cytoskeleton, our results highlight Rnd3 at the center of a feedback
loop of the MRTF/SRF mechanotransduction pathway. Taken together, all of the results
obtained helped to better decipher the mechanisms of Rnd3 regulation in tumor cells.
Remerciements
Je n’aurais jamais pu effectuer ce travail de thèse sans un grand nombre de personnes,
dont le soutien, la gentillesse, la bonne humeur et les précieux conseils m’ont accompagné au
cours de ces trois années.
Je tiens tout d’abord à remercier le Dr. Jean Rosenbaum de m’avoir accueilli au sein de
son laboratoire, et de m’avoir conseillé tout au long de ma thèse.
Je remercie le Dr. Athanassia Sotiropoulos et le Dr Cécile Gauthier-Rouvière d’avoir
accepté d’être les rapporteurs de mon travail de thèse, et le Professeur Martin Teichmann
d’avoir accepté d’être un membre de mon jury de mi-thèse, puis d’être le président de mon
jury de thèse. Je le remercie également d’avoir mis son laboratoire et son aide à ma disposition
afin que je puisse réaliser certaines expériences. Je tiens également à remercier le Dr. Christine
Varon pour ses précieux conseils au cours de mon jury de mi-thèse.
Je tiens à remercier tout particulièrement ma directrice de thèse, le Dr. Violaine
Moreau. Elle a fait preuve de beaucoup de soutien et d’aide à mon égard. Ses très nombreux
conseils, sa rigueur et sa culture scientifique m’ont permis d’évoluer en tant qu’apprenti-
chercheur. Je la remercie également pour sa grande disponibilité et ses nombreuses qualités
humaines. Enfin, un grand merci pour la relecture et la correction de ce manuscrit. Merci pour
ces trois années, j’ai grandement apprécié travailler dans ton équipe.
Je remercie également le Dr Frédéric Saltel pour ses précieux conseils, aussi bien sur
mes travaux de thèse que sur mon avenir professionnel.
Je remercie également tous les autres membres de l’équipe Moreau/Saltel pour leur
bonne humeur et leur esprit d’équipe. C’était un plaisir de travailler avec vous au quotidien.
Je remercie le Dr. Valérie Lagree-Bringtown pour son aide et ses conseils. Je remercie Claire
Peanne pour sa gentillesse, et je lui souhaite le meilleur pour la suite. Je remercie le Dr. Aya
Abouhammoud, que je n’ai pas côtoyé très longtemps, mais ce temps a suffi pour qu’elle
démontre toute sa gentillesse et ses talents culinaires. Je remercie Gaëlle Lachiver pour sa
gentillesse et les anecdotes personnelles qu’elle m’a racontées. Je remercie le Dr. Julie Di
Martino pour les bons moments passés ensemble et pour la très grande quantité de churros
que j’ai mangés. Je remercie le Dr. Zakaria Ezzhoukry pour sa bonne humeur et son humour
au quotidien. Je tiens également à remercier le futur Dr. Elodie Henriet pour ses nombreux
« Sérieux ! », pour son amour intense pour les knackis qui fait plaisir à voir, et pour ses trop
rares démonstrations de saxophone... Je la remercie également pour sa grande gentillesse et
je lui souhaite plein de bonnes choses pour la suite, et notamment pour son rôle de Vera dans
le prochain film Scooby-Doo. Je tiens à particulièrement remercier le Dr. Lisa Paysan qui m’a
formé à mon arrivée au laboratoire, qui m’a prodigué de nombreux conseils au cours de ma
thèse et qui s’est toujours rendue disponible quand j’avais besoin de discuter, que ce soit du
sujet de thèse ou de tout autre sujet. Je remercie grandement le Dr. Caroline Gest, pour la très
grande aide qu’elle m’a apportée, et également d’avoir été une collègue et amie
exceptionnelle tout au long de ces trois années. Je la remercie également d’avoir essayé de
m’apprendre la prononciation typique normande, même si j’ai toujours préféré garder la
prononciation française de référence, à savoir le bordelais...Je ne peux d’ailleurs pas parler de
référence sans remercier le Dr. Fabien Binamé, qui n’a cessé de me répéter qu’il venait de la
région de référence, mais qui est en réalité lui-même une personne de référence, par son
soutien, sa gentillesse, ses dessins humoristiques et ses très nombreuses blagues capables de
redonner le sourire dans n’importe laquelle des situations. Et pour les prochaines fois où l’on
se reverra, je tiens juste à lui rappeler de penser à sa serviette... Lisa, Caro, Fabien, je vous
remercie tous les trois grandement pour tout ce que vous m’avez apporté. Je tiens également
à remercier le futur Dr. Laure Magnan, non seulement pour les nombreux gâteaux qu’elle a
préparés au cours de son stage de Master 2, mais surtout pour sa gentillesse, sa bonne humeur
permanente et pour l’amie qu’elle est devenue. J’ai passé beaucoup de temps à la taquiner
(qui a parlé d’un bac de glace ?), mais c’est parce que je l’apprécie énormément, et je lui
souhaite le meilleur. Je tiens à remercier Margaux Sala pour sa très grande gentillesse et ses
concerts au Connemara, et je lui souhaite la bienvenue dans l’équipe Moreau/Saltel. Je
remercie Léa Bernaleau, venue faire son stage de licence dans l’équipe vers la fin de ma thèse
et qui a été d’une grande aide afin que je puisse terminer les différentes expériences de ce
projet de thèse. Je tiens enfin à remercier très chaleureusement un membre de l’équipe
Moreau/Saltel, à savoir Terezinha Robbe. Je ne saurais la remercier assez pour toute l’aide
précieuse qu’elle m’a apporté au cours de ma thèse. Je n’aurais jamais pu terminer cette thèse
sans elle. Elle s’est toujours rendue disponible pour m’aider, et quand il ne s’agissait pas
d’expérience, les nombreuses attentions qu’elle a eu à mon égard tels que ses délicieux
gâteaux au chocolat m’ont permis d’envisager cette thèse un peu plus sereinement. Un grand
merci à elle.
Je remercie également de nombreux membres des autres équipes pour leur gentillesse
et les bons moments que l’on a passé ensemble, à l’intérieur mais également en dehors du
labo. Merci au très prochainement Dr. Emilie Indersie pour m’avoir prouvé qu’on peut venir
de master génétique et être une personne agréable, modeste et intelligente. Je la remercie
également pour ses dégustations de donuts, et pour avoir révélé au laboratoire qu’il était
possible d’avoir une crampe à la langue. Je remercie le futur Dr JoaQuim Javary d’être
« régulièrement » venu jouer au football et pour tous les bons moments passés ensemble, et
notamment cet anniversaire où sa fameuse soupe angevine lui a fait terminer la soirée avant
qu’elle ait réellement commencée. Je remercie le Dr. Flora Cartier d’être aussi gentille et
surtout dans son monde, ne change surtout pas. Je remercie la jeune Gaëlle Labrunie d’être
une personne avec autant de qualités, même si elle m’a fait perdre un pari que j’aurai préféré
gagner. Je remercie le futur Dr. Caroline Capdevielle pour m’avoir montré que l’expression
rouge comme une tomate n’était pas qu’une expression, pour ses goûts musicaux et pour les
nombreuses séances de badminton qu’elle a organisé pour le labo.
Je tiens à remercier l’ensemble des membres des autres équipes, passés et présents,
pour leur gentillesse et leurs nombreux conseils tout au long de ma thèse. Merci Dr. Véronique
Veillat, Dr. Stéphanie Lhomond, Dr. Anne-Aurélie Raymond, Héléna Fazli, Angélique Desplat,
Amani Ghousein, Dr Samira Benhamouche, Dr. Katarzyna Hooks, Nathalie Dugot-Senant,
Nathalie Courtois, Véronique Neaud, Sarah Lesjean, Dr. Francis Sagliocco, Dr. Christophe
Grosset, Dr. Eric Chevet, Dr. Charles Balabaud et Dr. Paulette Bioulac-Sage.
Je remercie également l’ensemble du personnel technique et administratif pour leur
gentillesse et leur disponibilité. Merci Franck Pégorier, Cathy, Hélène Aouizerate, Gina
Rasanjivelo, Virginie Rocher.
Je remercie tous les précieux amis avec qui j’ai passé de supers moments en dehors du
laboratoire et qui m’ont permis d’évacuer la pression de la thèse. Je remercie Léa et Lucas,
que je n’ai pas réussi à voir souvent au cours de la thèse mais qui sont de véritables amis.
Merci à Camille de supporter en soirée les discussions de labo. Merci également à tous les
footballeurs, Thibault, Nico, Pipi, Jean William, Matthieu, Jacques, Antonin, Alan, Léa, Nestor,
Josselin, les sessions du mercredi soir vont me manquer. Je tiens à particulièrement remercier
Nestor Pallares Lupon, pour la découverte de l’Espagne et de Bujaraloz, pour les nombreux
moments passés ensemble, pour m’avoir fait goûter les meilleures tortillas du monde, et sans
qui ces trois dernières années auraient été bien plus difficiles. C’est promis, un jour je
t’accompagnerai chasser le hérisson. Je remercie également Josselin « mollets d’acier »
Galman, un ami de très longue date et dont le statut de grand chef d’entreprise ne l’a pas
empêché d’être toujours présent afin que l’on passe de super moments ensemble. Merci aussi
d’être un sniper d’élite sans qui la campagne de Halo aurait duré bien plus longtemps.
Je tiens à remercier tous les membres du master Biologie Cellulaire, Physiologie et
Pathologie, merci de faire partie du Master BCPP, universellement reconnu comme le meilleur
Master. J’aimerai remercier spécialement le futur Dr. Kévin Boyé, mon super binôme de
master.
Je remercie l’ensemble de ma famille pour leur soutien et les bons moments passés
ensemble.
Je tiens à grandement remercier mes parents, sans qui je n’aurais pas pu entreprendre
ni terminer cette thèse. Ils ont fait preuve d’un énorme soutien, ont toujours été disponibles
et ont répondu présents dès que j’avais le moindre besoin. Je tiens à les remercier pour tout
ce qu’ils ont fait pour moi non seulement au cours de ces trois années de thèse, mais
également depuis ma naissance. Merci d’être les parents que vous êtes.
Je remercie particulièrement l’ingénieur et futur Dr. Anne-Sophie Gary, pour sa
gentillesse, son humour, son intelligence, son soutien, ses conseils, ses talents culinaires, sa
beauté, son amour...Les raisons de la remercier sont trop nombreuses pour être entièrement
énumérées ici, mais je tiens à lui dire qu’elle est en grande partie responsable de mon bonheur
et de la personne que je suis aujourd’hui. Merci de m’avoir supporté à tout moment, même
lors de mes périodes les plus pénibles, et de m’avoir aidé pendant la thèse et lors de la
rédaction de ce manuscrit. Je te le redirai souvent au cours des nombreuses années qui nous
attendent, mais saches que je t’aime mon Cacamour, tu es l’amour de ma vie et la chérie
idéale. Merci également à toute sa famille pour la gentillesse dont ils font preuve à mon égard.
J’aimerais finir par remercier une personne qui représente beaucoup pour moi et que
j’admire énormément, mon petit frère Numa Piquet. Depuis que tu es né, tu as fait de moi le
frère le plus heureux du monde, et chaque jour où tu grandis ne cesse de confirmer ce
sentiment. Tu es quelqu’un d’exceptionnel et j’ai une chance énorme d’être ton frère. Je n’ai
pas toujours pu être présent au cours de ces trois ans, mais chaque moment partagé avec toi
me fait un bien fou. J’en profite également pour remercier Léa, que tu as très bien choisi et
qui est une personne d’une grande gentillesse et très agréable. Numa, je pourrais te remercier
pour les matchs de tennis et de foot qu’on a faits ensemble, pour les parties de Xbox, pour les
pizzas et les hamburgers qu’on a mangés, pour tous les matchs qu’on a regardés, ou pour plein
d’autres raisons...mais je préfère simplement te remercier d’être le frère parfait. Merci mon
frère que j’aime ! Ps : Non je rigole hein, en vrai tu es un gros boulet trop relou...^^
Table des matières
Chapitre I : Introduction ............................................................................................................... 1
I- Le cytosquelette d’actine ............................................................................................... 1
1- Dynamique des filaments d’actine ................................................................................. 1
2- Les fonctions de l’actine ................................................................................................. 2
3- Protéines associées à l’actine ......................................................................................... 3
A- Protéines de nucléation ............................................................................................. 4
B- Protéines de coiffe ..................................................................................................... 6
C- Les protéines de fragmentation des filaments d’actine ................................................ 8
D- Protéines de liaison aux monomères d’actine ............................................................. 9
E- Protéines impliquées dans les structures d’actine d’ordre supérieur .......................... 10
F- L’actine en tant que plateforme mécanique .............................................................. 11
G- Composés naturels ciblant l’actine ........................................................................... 14
4- Voies de signalisation régulant la dynamique de l’actine ............................................... 16
A- Les GTPases de la famille Rho ................................................................................... 17
a- Membres de la famille des Rho GTPases ............................................................... 17
b- Régulation cyclique de l’activité des Rho GTPases ................................................. 18
c- Fonctions biologiques des Rho GTPases ................................................................ 20
B- Récepteurs couplés aux protéines G ......................................................................... 22
C- Récepteurs à activité tyrosine kinase ........................................................................ 22
D- Voie des intégrines ................................................................................................... 23
E- Voie du TGFβ ........................................................................................................... 24
F- Voie de la E-cadhérine .............................................................................................. 26
G- Voie Wnt non canonique .......................................................................................... 26
5- Lien entre dynamique d’actine et transcription génique ............................................... 27
A- Actine nucléaire ....................................................................................................... 30
B- Voie de signalisation NF-κB ...................................................................................... 30
C- Récepteurs nucléaires aux hormones........................................................................ 31
D- Réponse aux dommages à l’ADN, voies Nck et JMY ................................................... 33
E- Protéines à domaine LIM .......................................................................................... 33
F- Voie de Mécanotransduction YAP/TAZ ..................................................................... 34
G- Voie de mécanotransduction MRTF/SRF ................................................................... 39
II- Voies de mécanotransduction MRTF/SRF ..................................................................... 42
1- Fonctions biologiques et moléculaires de SRF ............................................................... 42
A- Comparaison des co-activateurs de la famille TCF et MRTF ........................................ 42
B- Les co-activateurs MRTFs ......................................................................................... 44
2- Régulation de l’échange cytoplasme-noyau de MRTF par l’actine .................................. 46
3- Régulateurs positifs et négatifs de l’activité de la voie MRTF/SRF.................................. 49
4- Fonctions des gènes cibles de la voie MRTF/SRF ........................................................... 54
A- Gènes contractiles et spécifiques du muscle ............................................................. 56
B- Gènes modulant la dynamique de l’actine et la motilité cellulaire ............................. 57
C- Rôle des micro ARNs dans la régulation de la voie MRTF/SRF .................................... 60
5- Implication de la voie actine-MRTF/SRF en pathologie .................................................. 62
A- Maladies cardiovasculaires ....................................................................................... 62
B- Cancers .................................................................................................................... 63
6- Découverte de nouvelles cibles potentielles de la voie MRTF/SRF ................................. 67
III- La Rho GTPase atypique Rnd3 ...................................................................................... 69
1- Caractéristiques de Rnd3 ............................................................................................. 69
2- Régulation de Rnd3 ..................................................................................................... 70
A- Régulation transcriptionnelle ................................................................................... 70
B- Régulation post-transcriptionnelle ........................................................................... 72
C- Régulation de Rnd3 au niveau protéique .................................................................. 73
3- Fonctions biologiques de Rnd3 ..................................................................................... 75
A- Régulation du cytosquelette d’actine ........................................................................ 75
B- Polarité cellulaire dans le développement du système nerveux ................................. 77
C- Apoptose et survie cellulaire .................................................................................... 77
D- Régulation du cycle cellulaire ................................................................................... 79
E- Différenciation cellulaire .......................................................................................... 81
F- Implication dans le métabolisme glucidique ............................................................. 82
4- Implication de Rnd3 en pathologie ............................................................................... 82
A- Rnd3 et développement ........................................................................................... 82
B- Désordres cardiovasculaires ..................................................................................... 84
C- Cancers .................................................................................................................... 85
IV- Le carcinome hépatocellulaire ...................................................................................... 87
1- Epidémiologie .............................................................................................................. 87
2- Facteurs de risque ....................................................................................................... 87
3- Survenue et progression du carcinome hépatocellulaire ............................................... 88
4- Diagnostic et suivi des patients .................................................................................... 89
5- Traitements proposés .................................................................................................. 90
6- Voies de signalisation impliquées ................................................................................. 92
A- Altérations génomiques ........................................................................................... 92
B- TP53 ........................................................................................................................ 94
C- Voie de signalisation Wnt/β-caténine ....................................................................... 94
D- Mutations dans le promoteur de TERT et autres voies de signalisation impliquées .... 96
7- Classification des CHC .................................................................................................. 98
V- Objectifs ..................................................................................................................... 101
Chapitre II- Résultats ................................................................................................................. 102
Partie I : Régulation de Rnd3 par la β-caténine dans le carcinome hépatocellulaire ..................... 102
I- Introduction et résultats préliminaires ........................................................................ 102
1- Lien entre Rnd3 et β-caténine dans le CHC humain ...................................................... 102
2- Mise en place du modèle HepG2 ................................................................................. 103
3- Caractérisation du modèle de double extinction de la β-caténine................................. 104
II- Interaction de la E-cadhérine avec la β-caténine .......................................................... 107
III- Etude de la régulation transcriptionnelle de Rnd3 par la β-caténine ............................. 109
IV- Etude de la régulation de la stabilité de l’ARNm de Rnd3 par la β-caténine .................. 110
V- Facteurs à l’origine de la régulation différentielle de Rnd3 par la β-caténine ................ 112
Partie II- La voie de signalisation MRTF/SRF régule les processus mécanosensibles à travers sa
nouvelle cible Rnd3. .................................................................................................................. 118
Chapitre III- Discussion .............................................................................................................. 155
Partie I- Régulation de Rnd3 par la β-caténine ........................................................................ 155
Partie II- La voie de signalisation MRTF/SRF régule les processus mécanosensibles à travers sa
nouvelle cible Rnd3. .............................................................................................................. 160
Chapitre IV- Conclusion générale ............................................................................................... 168
Chapitre V- Références bibliographiques .................................................................................... 170
Chapitre VI- Annexes ................................................................................................................. 201
Matériel et méthodes ............................................................................................................ 201
I- Culture cellulaire ........................................................................................................ 201
II- Transfections .............................................................................................................. 201
1- Transfection de plasmide ............................................................................................ 201
2- Transfection de siARN ................................................................................................. 202
III- Transduction lentivirale .............................................................................................. 203
IV- Extraction protéique ................................................................................................... 203
V- Western Blot .............................................................................................................. 203
VI- Immunoprécipitation .................................................................................................. 204
VII- Pulldown RhoA actif ................................................................................................... 205
VIII- Extraction d’ARN ........................................................................................................ 206
IX- RT-qPCR ..................................................................................................................... 206
X- Immunofluorescence .................................................................................................. 208