recombinante de Pleurotus ostreatus como alternativa

163 Pages·2016·4.17 MB·English

by  Claudia Rivera

Expresión y producción de la lacasa POXA 1B
recombinante de Pleurotus ostreatus como alternativa
para el tratamiento de los subproductos líquidos que se
obtienen en el proceso de blanqueamiento de pulpa de
celulosa

Claudia Marcela Rivera Hoyos, Biól., M.Sc.

Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Doctorado en Ciencias Biológicas
Bogotá D.C.
Julio de 2016
1
Expresión y producción de la lacasa POXA 1B
recombinante de Pleurotus ostreatus como alternativa
para el tratamiento de los subproductos líquidos que se
obtienen en el proceso de blanqueamiento de pulpa de
celulosa

Claudia Marcela Rivera Hoyos, Biól., M.Sc.

Tesis presentada como requisito parcial para optar al título de:
Doctor en Ciencias Biológicas – Biotecnología

Director
Raúl A. Poutou-Piñales, Bq., M.Sc., Ph.D.

Co-Directora
Aura Marina Pedroza Rodríguez, Bact., M.Sc., Ph.D.

Laboratorio de Biotecnología Molecular
Laboratorio de Microbiología Ambiental y Suelos
Grupo de Biotecnología Ambiental e Industrial (GBAI)

Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Doctorado en Ciencias Biológicas
Bogotá D.C.
Julio de 2016
2
3
Expresión y producción de la lacasa POXA 1B
recombinante de Pleurotus ostreatus como alternativa
para el tratamiento de los subproductos líquidos que se
obtienen en el proceso de blanqueamiento de pulpa de
celulosa

Claudia Marcela Rivera Hoyos, Biól., M.Sc.

ACEPTADO

_____________________________ ___________________________
Dra. Alba A. Trespalacios Rangel. Dra. Concepción J. Puerta Bula.
Bact. M.Sc., Ph.D. Bact. M.Sc., Ph.D.
Directora de Posgrado, Facultad de Ciencias Decana Facultad de Ciencias
Pontificia Universidad Javeriana (PUJ) Pontificia Universidad Javeriana (PUJ)
4
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946.

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velará por qué no se publique nada contrario al dogma y a la moral
católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien
se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia”.

5
A Dios, porque es amor.
Y el amor revela y desvela,
porque por amor se vive y se muere…
Y a mis padres,
por su amor, por ser mi mundo y mi luz.

6
Agradecimientos

A mis padres, por ser mi soporte y mi motor para transitar en la vida, por acompañarme y apoyarme siempre
en cada locura que se me ha ocurrido (eso incluye las locuras deportivas y académicas), por ser los padres más
orgullosos y cariñosos, y por enseñarme el valor de la disciplina, la honradez, la lealtad y a hacer todo en la vida
con amor. Y a mi mamita (Mita), por su ternura, su fe y porque a través de su bondad y su piedad, me ha
mostrado siempre cómo ser una mejor persona con todos a mi alrededor.

A mi tutor, Raúl, por confiar y creer ciegamente en mí, porque además de transmitirme sus conocimientos
académicos, me ha enseñado para la vida (de eso se trata, de buscar ser mejor en todo sentido), por sus anécdotas
diarias, sus particulares analogías, por su paciencia y por tolerar mi “velocidad” para realizar cada experimento
y escribir cada documento (parece que al final encontramos un punto intermedio entre su “acelere” y mi
parsimonia), es decir, gracias por su amistad. A Aura, mi cotutora, a quien admiro profundamente por ser una
gran investigadora y porque aun en los momentos difíciles, siempre fueron prioridad la responsabilidad, la
dedicación y el trabajo en equipo (la conclusión más importante en este proceso fue descubrir que somos personas
disfuncionales que como grupo, ¡funcionamos muy bien!). A mis Jurados, por su tiempo, su dedicación, su buena
disposición y sus valiosos aportes que contribuyeron significativamente a la construcción de la versión final de mi
tesis. A David, por ser un gran compañero en la academia y en la vida, por alegrarse con mis triunfos y
apoyarme en mis fracasos, por escucharme y valorar en todo momento mi punto de vista personal y académico,
por tanto amor y porque comprendimos juntos el verdadero significado de la familia y de la amistad.

A Andrés (Mi Lagart), por tantos años siendo grandes amigos, por crecer y aprender juntos, por su alegría, su
sabiduría, su objetividad, por ser un gran soporte en los momentos difíciles, y por estar presente en cada
momento importante de mi vida.
A mi querido Lunch 2.0 (Angelita, Melissa, David Gómez, Alba, Javier, Laura, Jorge y Lina), porque
aunque nos tardamos varios años en coincidir en la senda de la amistad, llegaron en el momento indicado para
sacarme de mi zona de confort y recordarme la importancia de reír a carcajadas, de la solidaridad, de la
incondicionalidad, de hablar de todo y de nada, de disfrutar de la hora del almuerzo y de un café en compañía y
con la tranquilidad apropiada.
A Alejo, porque sin proponérselo y a causa de los azares o tal vez del destino, estuvo presente nuevamente en mi
camino justo antes de iniciar este reto académico, y justo antes de concluirlo, y porque a su lado (o incluso desde
la distancia) y a lo largo de toda una vida, sigue siendo un vehículo fundamental en mi viaje de
7
autodescubrimiento y una pieza importante en el rompecabezas del que se compone mi historia (mi pasado, mi
presente, y espero que también mi futuro).

A Nara, por su hermosa energía, por su ronroneo sanador en tantas crisis de migraña, por calentar mi regazo
en las noches frías de estudio, lectura y escritura, por su amor, sus caprichos, y por ayudarme a darle verdadera
importancia al descanso, la diversión y a la paciencia.
A Vivaldi, Nina Simone y B.B. King por proveer mi ambiente idóneo para la creación, la concentración y la
inspiración académica y por acompañarme en tantos momentos de soledad que siempre están implícitos en un
proceso largo como el que hoy estoy terminando.

Y a Benedetti, por sacarme tantas veces de la academia para dejar volar mi mente y explotar al máximo ese
lado romántico y soñador que habita en mí. Porque en sus letras descubrí que “el amor es una bahía linda y
generosa que se ilumina y se oscurece según venga la vida… una bahía donde los barcos llegan y se van, llegan
con pájaros y augurios y se van con sirenas y nubarrones…”, pero más importante aun, que esa analogía, no
sólo aplica para el amor, sino para todo en la vida: Porque al final (al menos desde mi perspectiva), somos
producto de cada experiencia vivida y cada persona que se ha cruzado, se ha marchado, o que nos ha
acompañado en algún punto de nuestro camino (algunas con mayor impacto que otras)… Así que gracias, ¡a
todos! (incluso a los que no aparecen en estas líneas, pero que permanecen en mi mente y en mi corazón), porque
indiscutiblemente y sin lugar a dudas, han contribuido a su manera para que hoy sea la persona, la hija, la
amiga, la mujer y la profesional que soy, y para alcanzar este gran sueño académico y personal.

Gracias… ¡Totales!

8
Tabla de contenido

CAPÍTULO 1. DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA TESIS
1.1. Introducción ……………………………………………………………….. 18
1.2. Planteamiento del problema y justificación …………………………….... 18
1.3. Objetivo general …………………………………………………………… 19
1.4. Objetivos específicos ……………………………………………………… 20
1.5. Contexto global de la metodología ……………………………………...... 20
1.6. Referencias ……………………………………………………………….... 20

CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.1. Introducción ………………………………………………………………. 22
2.2. Organismos productores de lacasas y actividad biológica …………………… 23
2.3. Familias de genes de lacasas ………………………………………………… 26
2.4. Fisiología microbiana de la producción de lacasas ……………...…………… 27
2.5. Diversidad estructural de lacasas fungicas; análisis bioinformático ……..…… 29
2.6. Lacasas recombinantes ………………………………………....…………… 38
2.7. Mecanismo de acción ………………………………………………..……… 43
2.8. Lacasas y mediadores químicos: mimetizando la naturaleza ….……………… 45
2.9. Lacasas atípicas ………………………………………………………....…… 46
2.10. Producción heteróloga de lacasas ………………………………..………… 47
2.11. Aplicaciones biotecnológicas ……………………………………………… 53
2.12. Conclusiones …………………………………………………………..… 56
2.13. Referencias …………………………………………………………….… 58

CAPÍTULO 3. ANÁLISIS COMPUTACIONAL Y EXPRESIÓN CONSTITUTIVA A
BAJA ESCALA DEL GEN SINTÉTICO DE LA LACASA POXA 1B DE Pleurotus ostreatus
EN Pichia pastoris
3.1. Introducción ………………………………………………….…………… 69
3.2. Materiales y métodos ……………………………………………………... 72
3.2.1. Optimización y diseño de la secuencia sintética de la lacasa de P. ostreatus
………………………………………………………………………….. 72
3.2.2. Modelación 3D ………………………………………………….... 72
3.2.3. Evaluación y análisis del modelo ............................................................. 73
3.2.4. Modelación de ligandos y Docking molecular …………………….. 73
3.2.5. Clonación y expresión del gen sintético laccPost-Stop ............................ 74
3.2.5.1. Cepas, plásmidos y medios de cultivo …………………... 74
3.2.5.2. Construcción del vector de expresión para la lacasa POXA 1B de P.
ostreatus ………………........................................................................... 74
3.2.5.3. Screening de los transformantes en P. pastoris X-33 …….. 75
3.2.6. Determinación de actividad enzimática ………………………………….... 75
3.2.7. Estudios preliminares de expresión de la lacasa recombinante en Pichia pastoris
.................................................................................................................................. 76
3.3. Resultados .................................................................................................................. 78
3.3.1. Optimización y diseño del gen laccPost-Stop ………………….…….. 78
3.3.2 Análisis estructural del modelo construido por homología ……...….. 79
3.3.3 Validación del model LaccPost …………………………………….. 81
3.3.4. Docking molecular del ligando en el sitio activo del modelo LacPost
9
...................................................................................................................... 83
3.3.5. Construcción del vector pGAPZαA-laccPost-Stop y screening de clones para la
expresión de las lacasas recombinante ……………………….……….. 85
3.3.6. Estudios preliminares de expresión constitutiva de la lacasa LaccPost
...................................................................................................................... 86
3.4. Discusión ..................................................................................................................... 88
3.4.1. Optimización y diseño del gen laccPost-Stop ……………………….... 88
3.4.2. Análisis estructural del modelo construido por homología ……….... 89
3.4.3. Validación del modelo ……………………………………...…….... 90
3.4.4. Docking molecular del ligando en el sitio activo de la lacasa modelada
...................................................................................................................... 91
3.4.5. Construcción del vector pGAPZαA-laccPost-Stop y screening de clones para la
expresión de la lacasa recombinante …………………………...……….... 93
3.4.6. Estudios preliminares de expresión constitutiva de la lacasa LaccPost
…………………………………………………………………… 93
4.5. Conclusiones .............................................................................................................. 95
4.6. Referencias ................................................................................................................. 97

CAPÍTULO 4. OPTIMIZACIÓN DE MEDIO, PRODUCCIÓN A BAJA ESCALA,
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LA LACASA RECOMBINANTE POXA
1B EXPRESADA EN Pichia pastoris
4.1. Introducción ............................................................................................................... 103
4.2. Materiales y métodos ............................................................................................... 107
4.2.1. Cepa ............................................................................................................... 107
4.2.2. Preparación del inóculo .............................................................................. 107
4.2.3. Diseño experimental Plackett-Burman (PBED) ………………….... 107
4.2.4. Diseño experimental One Factor (OFED) ……………………….... 108
4.2.5. Concentración del sobrenadante ………………………....……......... 108
4.2.6. Caracterización del sobrenadante concentrado …………………….. 109
4.2.6.1. SDS-PAGE e identificación functional de la enzima ............ 109
4.2.6.2. Estabilidad a temperatura ………………………....…….... 109
4.2.6.3. Estabilidad a pH ………………………………………..... 109
4.2.6.4. Constantes cinéticas …………………………………….... 110
4.2.7. Técnicas analíticas ………………………………………………..... 110
4.2.7.1. Determinación de la concentración de azúcares reductores totales
residuales .................................................................................................... 110
4.2.7.2. Determinación de la concentración de proteínas totales extracelulares
............................................................................................. 110
4.2.7.3. Determinación de actividad enzimática …………...…….... 111
4.3. Resultados ……………………………………………………….....…….... 112
4.3.1. Diseño estadístico ………………………....……………………..... 112
4.3.1.2. Diseño experimental Plackett-Burman (PBED) …….….... 112
4.3.1.3. Diseño experimental One Factor (OFED) ………….….... 117
4.3.2. Caracterización del sobrenadante concentrado ………….……......... 119
4.3.2.1. Identificación functional de la enzima recombinante …...... 119
4.3.2.2. Estabilidad a temperatura y pH …………………...…….... 120
4.3.2.3. Caracterización cenética del sobrenadante concentrado
…………………………………… ………………………............ 121
10