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118 Pages·2015·2.85 MB·French

Mémoire
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MMaaggiisstteerr en Biologie
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Par
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Thème
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Soutenue 09 Mars 2014
Membres de jury :
Président : Pr Senhadji R Université Es-sseenniiaa OOrraann
Examinateur: Pr Fortas Z Université Es-sseenniiaa OOrraann
Examinateur: Pr Belahcene M Centre UUnniivveerrssiittaaiirree AAiinn TTiimmoouucchheenntt
Encadreur : Pr Bensalah F Université Es-sseenniiaa OOrraann

AAnnnnééee UUnniivveerrssiittaaiirree
2013-2014
Remerciements
Ce travail a été effectué au sein du laboratoire de génétique Microbienne, faculté des sciences de la
nature et de la vie, département de biologie, université d’Es-senia Oran.
Je tiens à remercier d’abord, Monsieur le Professeur Bensalah. F qui a bienvoulu diriger ce
travail, pour ses conseils qui m’ont permis de bien mener ce travail.
Je remercie également monsieur le Professeur Oueld Kadda qui n’a pas hésité à tout moment
d’offrir son aide scientifique et ouvrir les portes de son laboratoire à moi et à tous mes collègues, sans
oublier son étudiante Mlle Nabila qui nous a donné l’aide technique nécessaire.
Mes remerciements les plus respectueux s’adressent aussi à Monsieur SENHADJI R, Professeur
à l’université de d’Es-senia qui me fait l’honneur de présider le jury.
Mes plus vifs remerciements s’adressent aux Professeurs : Madame FORTAS Z et Monsieur
BELAHCENE M pour avoir accepté d’être membres de ce jury.
J’associe à mes remerciements à l’équipe du laboratoire de Génétique Microbienne Mlle
Bekenniche et Mme Kouadri pour leur soutien et leur solidarité.
Dédicaces
Je dédié ce modeste travail :
À mes parents, mais aucune dédicace ne serait témoin de mon profond amour, mon immense
gratitude et mon plus grand respect ;
A mes chers frères et sœurs : Amine, Abderrahmane, Haoua et Mekka ;
A mes chers Amis : Abderrahmane, Toufik, Hamza, Kadda, Younes, Zoheir, Boubaker et
Chouaib ;
A mes sœurs et collègues Nahla et Nacima, avec qui j’ai passé les meilleurs 3 ans de ma vie ;
A mes chers enseignants sans exception.
Résumé :
La présence des Streptomycètes dans les différents sols de la région ouest de l’Algérie a
été investiguée par l’isolement de ce genre bactérien à partir des échantillons de sols prélevés
de différents biotopes ; Cet isolement a été fait sur plusieurs milieux de culture comme ISP2,
GLM et Bennett. La mise en évidence de l’activité antibactérienne (premier criblage) des 85
souches isolées et suspectées être Streptomycètes a été faite par la méthode de la double
couche ; plus de 25% des souches isolées avaient un effet antibactérien contre au moins une
seule souche bactérienne pathogène et seulement 3 ont été sélectionnées pour les prochains
tests.
L’extraction des métabolites secondaires des souches sélectionnées (SM2.2, SM1B1 et
TB1) a été faite par solvant (chloroforme) et leur concentration par un Rotavapor.
L’évaluation de l’effet antibactérien de l’extrait était réalisée par la méthode des disques
contre les mêmes souches pathogènes utilisées dans le premier criblage. Seule l’isolat TB1 a
présenté un effet satisfaisant lors du deuxième criblage. Les différents extraits ont subis une
analyse UV-visible ainsi qu’une pré-identification des molécules présentes par
chromatographie sur couche mince (CCM), là où les taches des molécules ont été bien claires
surtout pour l’isolat TB1.
L’extraction de l’ADN des souches sélectionnées a été faite par un kit, et une
amplification (PCR) du gène ADNr 16S a été réalisée avec un programme approprié, des
amorces universelles ont été utilisées et la détection sur gel d’agarose a donné des fragments
de 1500 pb référant à la longueur du gène amplifié.
Mots clé : Streptomycètes, activité antibactérienne, extraction, CCM, PCR.
Abstract :
The presence of Streptomyces in different soils of the Western region of Algeria was
investigated by the isolation of these bacteria from soil samples from different biotopes; the
isolation was made in various media like ISP2, Bennett and GLM. The demonstration of
antibacterial activity (first screening) of the 83 isolates suspected to be Streptomyces was
made by the method of the double layer; more than 25% were actives against at least one
pathogenic strain and only 3 were selected for the next tests.
The extraction of secondary metabolites of the selected strains was made by solvent
(chloroform) and their concentration by a Rotavapor. The evaluation of the effect of the
extract was applied by the method of the discs against the same pathogenic strains used in the
first screening and only the TB1 strain showed an effect in the second screening. The various
samples went through UV-visible analysis and a pre-identification of the molecules present,
by a thin layer chromatography (TLC), where the spots were very clear.
The selected strain’s DNA extraction was made by a kit, and amplification (PCR) of the
16S rDNA gene was carried out with universal primers, in order to make a nucleic acids
chromatography on Agarose gel, it gave fragments of 1500 bp referring to the length of the
amplified gene.
Key words: Streptomyces, antibacterial activity, extraction, TLC, PCR.
: اﻟ ﻤﻠ ﺨﺺ
ﻋﻠﻰ ﻣﺴﺘﻮى ﻣﺨﺘﻠﻒ أﻧﻮ ﺎﻋ اﻷﺗﺮﺑﺔ ﺑﺎﻟﻐﺮ ب ا ﻟﺠﺰاﺋﺮي ﺗﻢ Streptomyces اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﻧﻮع و ﺟﻮد اﻟﺒﺤﺚ ﻋﻦ
،ISP2 ھﺬ ا اﻟﻌﺰل ﺗﻢ ﻋﻠﻰ أوﺳﺎط ﻧﻤﻮ ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻣﻨﮭﺎ .اﻟﺘﺤﻘﻖ ﻣﻨﮫ ﺑﻌﺰ ل ھﺬ ا اﻟﻨﻮع ﻣﻦ أوﺳﺎط ﻣﺨﺘﻠﻔﺔ ﻟﻠﺘﺮﺑﺔ
ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺎ ﻣﻌﺰوﻟﺔ اﻟﻤﺸﻜﻮك ﻓﻲ ﻛﻮﻧﮭﺎ 85 ﻟ ﻠـ (أﻮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﻟ اﺧﺘﺒﺎر) اﻟﺒﺤﺚ ﻋﻦ ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﺿﺪ ﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺔ .GLMو ،Bennett
ﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻤﻌﺰوﻟﺔ أﻇﮭﺮت ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﺿﺪﻣﻦ اﻟ % 25 أﻛﺜﺮ ﻣﻦ .ﺗﻢ ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﺗﻘﻨﯿﺔ اﻟﻄﺒﻘﺔ اﻟﻤﺰدوﺟﺔ Streptomyces
.ﻣﻨﮭﺎ ﻟﻼﺧﺘﺒﺎرﺎ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺗ اﻟﻼﺣﻘﺔ 3 ﺳﻮى ا ﺧﺘﯿ ﺎر ﻤﻀﺮ ة، و ﻟﻢ ﯾﺘﻢﺑﻜﺘﯿﺮﯾﺔ ﻋﻠﻰ اﻷﻗﻞ ﻋﻠﻰ واﺣﺪة ﻣﻦ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟ
و ﺗﻢ ﺗﺮﻛﯿ ﺰ (chloroforme) اﻟﻤﺮﻛﺒﺎ ت اﻟﺜﺎﻧ ﻮﯾﺔ ﻟﻠﺒﻜﺘﯿ ﺮﯾﺎ اﻟﻤﺨﺘﺎرة، ﺗﻢ ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﻣﺤﻠﻮل ﻣﺬﯾﺐ اﺳ ﺘﺨ ﻼص
إﺛﺒﺎت ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ اﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺺ ﺗﻤﺖ ﻋﻦ ﻃﺮﯾﻖ اﺳﺘﻌﻤﺎل ﻃﺮﯾﻘﺔ اﻷﻗﺮﺎ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺻ و . Rotvapor اﻟﻤﺮﻛﺒﺎت ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﺟﮭﺎز
ﺧ ﻼل ﺟـ ﯿﺪة ﺔﯿﻟأﻇﮭﺮت ﻓﻌﺎ TB1 ﻓﻘﻂ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ .ﺿﺪ ﻧﻔﺲ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻤﻀﺮ ة اﻟﻤﺴﺘﻌﻤﻠﺔ ﻓﻲ اﻻﺧﺘﺒﺎ ر اﻷﻮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﻟ
و ﻛﺬا (ﻲﺋﺮﻣ -ﻣﺎ ﻓﻮق ﺑﻨﻔﺴﺠ ﻲ) اﺳﻄﺔ ﻣﺎﺳﺢﺗﺤﻠﯿﻞ ﺗﻜﻮﯾﻦ اﻟﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎ ت اﻟﺜﻼث ﺑ ﻮ اﻻﺧﺘﺒﺎ ر اﻟﺜﺎﻧﻲ ، و ﻗﺪ ﺗﻢ
.ﺑﻮاﺳﻄﺔ ﺗﺤﻠﯿﻞ ﻛﺮوﻣﺎﺗﻮﻏﺮاﻓﻲ ﻣﺤﺎوﻟﺔ اﻟﺘﺤﻘﻖ اﻷوﻟﻲ ﻣﻦ ﻧﻮ ع اﻟﻤﺮﻛﺒﺎ ت اﻟﻤ ﻜﻮﻧﺔ ﻟﻠﻤﺴﺘﺨﻠﺼﺎت
ﻋﺪد ﻧﺴﺦ اﻟﻤﻮﺮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺛ دوﺎ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺗ، ﺗﻢ ﺗﻜﺜﯿﺮﻣﺠﻤ ﻮع ﻣﻦ اﻷ ﺔﻨﻮﻮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﯾ ﻟﻠﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻤﺨﺘﺎرة ﺗﻢ ﺑﻮاﺳﻄاﻟﺤﻤﺾ اﻟ اﺳ ﺘﺨ ﻼص
ﻛﺸﻒ ﻃﻮ ل اﻟﻤﻮﺮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺛ اﻟﺬي ﯾﻮاﻓﻖ ﻓﻲ ﻃﻮﻟﮫ وﻓﻖ ﺑﺮﻧﺎﻣﺞ ﺗﻮاﻓﻘﻲ و ﺑﺎﺳﺘﻌﻤﺎل ﻣﺬﺧﺮﺎ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺗ ﻋﺎﻟﻤﯿﺔ و ﺗﻢ ADNr 16S
.ﻣﺎ ھﻮ ﻣﻮﺟﻮد ﻓﻲ اﻟﻤﺮاﺟﻊ
.ﻓﻌﺎﻟﯿﺔ ﺿﺪ ﺑﻜﺘﯿ ﺮﯾﺔ ، اﺳﺘﺨﻼص، ﻣﻮﺮ(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)(cid:1127)ﺛ، ﻣﺴﺢ، ﺗﻜﺜﯿﺮ ، : اﻟﻜﻠﻤﺎ ت اﻟﻤﻔﺘﺎﺣﯿﺔ
Liste des Abréviation
Liste des Abréviations :
ADN : Acide Désoxyribonucléique
ARNr : Acide Ribonucléique Ribosomique
ATCC : American Type Culture Collection
ATP :Adénosine triphosphate
BET : Bromured’Ethidium
CCM : Chromatographie sur Couche Mince
CCR : Répression du Catabolite Carboné
CG : Chromatographie à phase Gaseuse
ddNTP :didésoxycléoside triphosphate
dNTP :désoxycléoside triphosphate
EDTA: Ethylene diamine Tetra-acetic acid
GOGAT : Glutamate : 2-OxoGlutarate TransAminase
GS : Glutamate Synthétase
HPLC : Chromatographie Liquide à Haute Pression
mM : milli-molaire
NCTC : National Culture Type Collection
pb : paire de bases.
PCR : Polymerization Chain Reaction
pH : Potentiel d’Hydrogène
qsp : Quantité suffisante pour
Rf ; Rapport frontale
rpm : Rotation par minute
UFC : Unité Formant Colonie
UI : Unité Internationale
V/V : Volume par volume
G+C : Guanine + Cytosine
NCTC : National Culture Type Collection
Liste des tableaux

Liste des tableaux

Tableau 01 : Tableau illustrant les différentes propriétés des Streptomycètes 07
Tableau 02 : Les différentes méthodes moléculaires d’identification des Streptomycètes 12
Tableau 03 : représentation des différents milieux de culture utilisés pour la culture des
20
Streptomycètes
Tableau 04 : Principales différences entre les métabolites primaires et secondaires 23
Tableau 05 : Propriétés physicochimique des solvants utilisés dans l’extraction des
26
métabolites secondaires
Tableau 06 : Tableau qui présente les antibiotiques les plus utilisés 29
Tableau 07 : Lieux de prélèvement des échantillons 34
Tableau 08 : Quelques caractéristiques des souches pathogènes utilisées dans cette étude 39
Tableau 09 : Les ingrédients de la PCR pour chaque échantillon 48
Tableau 10 : Tableau représentant les caractéristiques et le diamètre des zones d’inhibition
63
en millimètre des souches sélectionnées lors du criblage primaire
Tableau 11 : Résultats des tests des 3 souches 67
Tableau 12 : Les pics des courbes d’absorbance des extraits 72
Liste des figures
Liste des figures

Figure 1 : diagramme d’une section verticale à travers le centre de
6
sporulation de S. coelicolor
Figure 2 : Colonies de l’espèce type Streptomyces coelicolor 6
Figure 3 : endommagement de la pomme de terre à cause de S. scabies 9
Figure 4 : classification du genre Streptomyces 12
Figure 5 : Schéma du cycle de vie des Streptomyces dans les conditions
13
neturelles
Figure 6 : Cycle de vie des Streptomyces 14
Figure 7 : Morphologies rencontrées aux cours de cultures liquides 15
Figure 8 : Couleur du mycélium aérien et des pigments diffusible S.
glaucescens 16
Figure 9 : Morphologie du mycélium aérien de Streptomyces 16
Figure 10 : hyphes végétatives et conidiospores de S. coelicolor 17
Figure 11 : développement du mycélium secondaire en spores 17
Figure 12 : Schéma général conduisant à l’obtention des antibiotiques à
28
l’état pur
Figure 13 : lieu de prélèvement Ech 02 35
Figure 14 : lieu de prélèvement Ech 03 35
Figure 15 : dilution des échantillons 36
Figure 16 : Rotavapor utilisé pour la concentration des métabolites
44
secondaires
Figure 17 : illustration de la CCM 46
Figure 18 : thermocycler (TECHNE TC-312) 49
Figure 19 : exemple sur le résultat d’une éléctrophorèse des acides
50
nucléiques
Figure 20 : électrophorèse pour la séparation des fragments d’ADN 51
Figure 21 ; plaque UV 52
Figure 22 : les colonies suspectées être des Streptomycètes 54
Figure 23 : colonies de Streptomyces 54
Figure 24 : observation macroscopique de SB1 54
Figure 25 : observation de la colonie de SB1 54
Figure 26 : observation macroscopique de CB5 55
Figure 27 : observation de la colonie de CB5 55
Figure 28 : observation de la colonie de CQ 55
Figure 29 : observation macroscopique de CQ 55
Figure 30 : observation de la colonie de SB4 55
Figure 31 : observation macroscopique de SB4 55
Figure 32 : observation de la colonie de BN1 55
Figure 33 : observation macroscopique de BN1 55
Figure 34 : observation de la colonie de N3 56
Liste des figures
Figure 35 : observation macroscopique de N3 56
Figure 36 : souche SM2.2 56
Figure 37 : souche BN1 56
Figure 38 : souche SM2.6 56
Figure 39 : souche 2.11 56
Figure 40 : souche SM2.3 56
Figure 41 : souche SM X4.2 56
Figure 42 : souche SM2.8 57
Figure 43 : souche B6 57
Figure 44 : pigments diffusibles produises par les souches de Streptomycètes 58
Figure 45 : Pourcentage des souches isolées selon les types de sol 59
Figure 46 : Coloration de Gram des souches 60
Fihure 47 : l’activité antibactérienne des souches isolées 62
Figure 48 : la non-hydrolyse de l’amidon 64
Figure 49 : la non dégradation de la caséine 64
Figure 50 : l’absence de l’uréase chez SM2.2 65
Figure 51 : l’absence de l’uréase chez TB1 65
Figure 52 : la non dégradation du tween 80 par les 3 souches 65
Figure 53 : dégradation des sucres par la souche SM2.2 66
Figure 54 : extraction des métabolites secondaires 68
Figure 55 : effet des l’extraits sur E.coli 69
Figure 56 : courbe d’absorbance de l’extrait de la souche TB1 70
Figure 57: courbe d’absorbance de l’extrait de la souche SM2.2 71
Figure 58 : courbe d’absorbance de l’extrait de la souche SM1B1 71
Figure 59 : Visualisation de la CCM avec UV de l’extrait de la souche TB1 73
Figure 60 : Chromatographie des extriats des souches SM2.2 et SM1B1 75
Figure 61 : électrophorèse des acides nucléiques sur gel d’Agarose à 1.5% 76