Rapid Identification of Plant Species and iFlora: Application of DNA Barcoding in a Large Temperate Genus Pedicularis (Orobanchaceae)

2013·3.7 MB·

by  Liu Min-Lu-

植 物 分 类 与 资 源 学 报 ,35 ( ):
摇 2013 6 707~714
Plant Diversity and Resources :
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI 10.7677/ynzwyj201313168
植物物种的快速鉴定与 iFlora: DNA 条形码在马先蒿属中的应用*
刘珉璐1,2, 郁文彬1, 王 红1**
摇
中国科学院昆明植物研究所生物多样性与生物地理学重点实验室 云南昆明
(1 , 摇 650201;
中国科学院大学 北京
2 , 摇 100049)
摘要: 条形码技术就是利用一段较短的标准 序列对物种进行快速鉴定 与基于植物外部形态特
DNA DNA 。
征的传统分类鉴定方法相比 条形码具有高效 准确 且易于实现自动化和标准化的特点 马先蒿属
, DNA 、 , 。
Pedicularis 植物具对生 轮生 叶的种类 以上分布在中国 近缘种间形态上非常相似 鉴定较
( L.) ( ) 70% , ,
为困难 研究选取马先蒿属具对生 轮生 叶类群 种 份样品 利用叶绿体基因 rbc mat
。 ( ) 43 164 , ( L、 K、
trn psb 和核基因 条形码片段 采用建树法和距离法检验 个条形码对这些物种的鉴定效果
H鄄 A) (ITS) , 4 。
结果表明 片段用于建树法和距离法的鉴别率分别为 和 其鉴别率高于 个叶绿体基
, ITS 81.40% 89.57%, 3
因片段和任一基因片段的组合条码 另外 利用 成功解决了一些疑难种的分类问题 条形码在马
。 , ITS 。 DNA
先蒿属研究中的实用性为新一代植物志 实现物种的快速和准确鉴定提供了有力支持 并能为分
(iFlora) ,
类学 生态学 进化生物学 居群遗传学和保护遗传学等分支学科的研究提供重要信息
、 、 、 。
关键词: 条形码 快速鉴定 马先蒿属 列当科
DNA ; ; iFlora; ;
中图分类号: 文献标识码: 文章编号:
Q781, Q949摇 摇 摇 摇 摇 A摇 摇 摇 摇 摇 2095-0845(2013)06-707-08
Rapid Identification of Plant Species and iFlora Application
:
of DNA Barcoding in a Large Temperate Genus
Pedicularis Orobanchaceae
( )
1,2 1 1**
LIU Min鄄Lu , YU Wen鄄Bin , WANG Hong
KeyLaboratoryofBiodiversityandBiogeography KunmingInstituteofBotany ChineseAcademyofSciences
(1 , , ,
UniversityofChineseAcademyofSciences
Kunming650201,China;2 ,Beijing100049,China)
Abstract
: DNA barcoding involves species identification using a short and standardized DNA region. This method
has manyadvantagesovertraditionalmorphology鄄basedidentification,includinggreatereffectivity,sensitivity,relia鄄
Pedicularis
bility, and standardization. In this study, we used43 whorled鄄/opposite鄄leaved species from the genus
as a model systemtotesttheutilityofDNAbarcodingforrapididentificationofspeciesinthetaxawheretraditional
identification methods are time鄄consuming and inaccurate. Four candidate DNA barcoding loci (three chloroplast:
rbc mat trn psb
L, K, H鄄 A,andonenuclear:ITS) wereevaluatedbytree鄄anddistance鄄basedmethodsusingatotalof
164 accessions. OurresultsshowedthatspeciesidentificationratesusingthenuclearITSlocus(81.40% and89.57%
for tree鄄anddistance鄄basedmethods,respectively) surpassedthoseofthethreechloroplastbarcodesandallcombi鄄
nations of barcodes. In addition, the nuclear ITS locus was able to help identify some species that had previously
been difficult to differentiateusingonlymorphologicaltraits. ThedemonstratedabilityofDNAbarcodingtoefficient鄄
Pedicularis
ly discriminate among these species highlights the practicality and importance of its utility for the next鄄
基金项目 科技部科技基础性工作专项项目 科技部国家高技术研究发展计划 计划 主题项目
* : (2013FY112600); (863 ) (2012AA021801);
中国科学院大科学装置项目 国家自然科学基金
(2009鄄LSFGBOWS鄄01); (31200185,30970201)
通讯作者
** : Authorforcorrespondence;E鄄mail:[email protected]
收稿日期 接受发表
: 2013-08-30, 2013-09-29
作者简介 刘珉璐 女 博士研究生 主要从事马先蒿属系统分类学研究
: (1987-) , , 。 E鄄mail:[email protected]
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇708摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
generationintelligentFlora(iFlora) infulfillingtherapidandaccurateidentificationofspecies. Thisnewidentifica鄄
tion method willprovidekeyinformationfortraditionaltaxonomyandforinvestigationsofecology,evolutionarybiolo鄄
gy, population genetics, and conservation genetics, etc.
Key words Pedicularis
: DNA barcoding; Rapid identification; iFlora; ; Orobanchaceae
对物种的准确鉴定是分类学的主要任务之 等 建议 作为种子植物核心条码
摇 Li (2011a) ITS 。
一 随着对生物多样性认识的深入 基于传统形 尽管目前在 条形码通用性 扩增等方面还
。 , DNA 、
态学特征的物种鉴定在一定程度上已难以满足人 存在一些问题 针对具体类群需要继续探索和选
,
们认知物种的需求 分子水平的鉴定相比传统的 择适合的条码 但在诸多类群中已被证明它们可
。 ,
鉴定方法更为高效 准确 且易于实现自动化和 以有效的应用于植物物种鉴定
、 , 。
标准化 一定程度上突破了对专家和经验的过度 马先蒿属 Pedicularis 是列当科
, ( L.) (Oro鄄
依赖 在物种鉴定和分类方面发挥出不可忽视的 最大的属 广泛分布于北半球的高
, banchaceae) ,
作用 等 等 融合 纬度和高海拔地区 有近 的种类集中于喜马
(Hebert , 2004; Li , 2011b, c)。 , 2/3
了分类学 分子生物学 生物信息学和计算机科 拉雅 横断山区 该地区是其物种多样化和特有中
、 、 - ,
学的新一代植物志 开始成为物种快速 心之一 等 吴征镒等 马先
(iFlora) (Yang , 1998; , 2003)。
鉴定的新工具 一方面 提供了更多的分 蒿属植物叶为互生 对生或轮生 以
。 , iFlora 、 。 Li (1951)
类性状 将使鉴定结果更加客观 可靠 另一方 叶序为属下基本分类依据 分为轮叶群 Cyclo鄄
, 、 , , (
面 能够对鉴定物种在数据库中进行智能化的比 phyllum 异叶群 Allophyllum 和变叶群 Po鄄
, )、 ( ) (
对和搜索 完成物种鉴定和相关信息的提取 ecilophyllum 认为具不同叶序的群是各自独立演
, ),
李德铢等 这种快速和准确的鉴定途径 化的 而且对生 轮生 叶类最为原始 钟补求
( , 2012)。 , ( ) 。
不仅可以服务于分类学 生态学 进化生物学 则认为互生叶类较早分化 对生 轮生
、 、 、 (1955) , ( )
居群遗传学和保护遗传学等分支学科 还将应用 叶类由互生叶类演化而来 钟补求 系统
, 。 (1963)
于科普教育 检验检疫 产业部门等相关领域 将国产 种马先蒿分为 个群 其中
、 、 329 13 (Group),
高连明等 曾春霞等 个群为对生 轮生 叶类 而在以互生叶种类
( , 2012; , 2012)。 7 ( ) ,
条形码是基于标准基因片段而实现的物 为主的长茎群 Dolichomiscus 中混杂着假对生
DNA ( )
种鉴定方法 等 是 的关键 和对生种类 近年来 分子系统学研究表明 绝
(Hebert , 2003), iFlora 。 , ,
组成部分 也是联系物种与其他相关信息的纽带 大多数对生 轮生 叶类和互生叶类各自形成分
, ( )
李德铢等 条形码与广义形态性状 支 轮生叶类形成多个单系 如斗叶群 Cya鄄
( ,2012)。 DNA , , (
结合 共同应用于物种鉴定 是对传统鉴定和分 thophora 等 和
, , ) (Yang , 2003; Ree, 2005; Yang
类的有效补充 等 等 等 马先蒿属是典型的辐
(DeSalle , 2005; Kristiansen , Wang,2007; Yu ,2013)。
等 等 射分化类群 种类丰富 分布范围广 形态复杂
2005; Will , 2005; Haase , 2007; Hajibabaei , , , 。
等 和 任保青和陈 该属花部器官高度分化 被作为鉴定的主要性状
,2007; Vogler Monaghan, 2007; ,
之端 王红等 在植物 条形码 依据之一 花期主要集中在 月 在花期外采
,2010; , 2012)。 DNA , 6~8 ,
研究中 学者们对来自叶绿体基因和核基因的大 集到的无花标本难以鉴定 基于外部形态相似性
, 。
量条码进行筛选 等 等 建立的马先蒿属分类系统存在很多问题 较难客
(Kress , 2005; Chase , ,
等 和 观地反映出类群间自然的系统发育关系 一些关
2007; Lahaye , 2008; Kress Erickson, 2007)。 ,
植物工作组 键鉴别性状界限模糊不清 给鉴定带来困难 因
CBOL (CBOL Plant Working Group, , 。
建议将rbc mat 作为陆地植物通用条码 此 有必要利用 条形码方法弥补依据形态鉴
2009) L+ K 。 , DNA
年在墨西哥举行的第三届国际生命条形码大 定的缺陷 等 利用 rbc mat
2009 。 Yu (2011) L、 K、
会 建议在核心条码 rbc mat 之外 增加补充 trn psb 和 这 个条形码片段在马先蒿属中
, L+ K , H鄄 A ITS 4
条码 例如 和 trn psb 随后 等 的研究发现 对该属鉴定效果最理想的单一片段
, ITS H鄄 A。 , Chen ,
和 等 推荐 为通用条码 为 鉴定成功率为 而 rbc 为最
(2010) Yao (2010) ITS2 。 ITS, 78.4%; L+ITS
期 刘珉璐等 植物物种的快速鉴定与 条形码在马先蒿属中的应用
6 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : iFlora: DNA 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇70摇9
佳片段组合 鉴定成功率为 表明 条 组合 rbc 作为马先蒿属植物的鉴定条码 等
, 79.5%, DNA ITS+ L (Yu ,
形码用于马先蒿属物种鉴定是可行的 因此 本研究中只对 个单独片段和片段组合
。 2011)。 , 4
rbc rbc mat 以及 rbc mat trn psb
中国马先蒿属植物约 种 等
L+ITS, L+ K+ITS L+ K+ H鄄 A+
354 (Yu , 2010),
进行分析 新增加的序列用 进
其中对生 轮生 叶类有 种 占世界马先蒿属 ITS 。 SeqMan (DNAstar)
( ) 144 , 行序列的拼接 新拼接的序列和之前的序列构建矩阵
对生 轮生 叶种类的 以上 该类群在横断 。 ,
( ) 70% 。 利用 等 进行序列的
山区分布较多 近缘种形态非常相似 关键鉴定特 MEGA version5.2 (Tamura , 2007)
, , 初步比对 然后在 进
, BioEdit version 7.0 (Hall, 1999)
征 如萼齿数目 花冠管膝屈程度 盔部是否具
行人工调整和校正 将 个片段的 数据进行单独及
, 、 、 。 4 DNA
齿 花丝是否具毛等 依据标本馆存放的标本难 联合构建矩阵 用 软件构建单独片段以及片段
、 , , MEGA
以观察和确定 鉴定尤为困难 本文将以马先蒿 组合的邻接 距离树 靴带值以
, 。 (Neighbor鄄joining, NJ) ,
属对生 轮生 叶类为对象 选取了有多个居 次重复运算 正确鉴定成功率的计算参考
( ) , 1000 。 Holling鄄
群样品且形态鉴定困难的 个种 评价 条 等 的 同种个体分组聚类 标准 即树
sworth (2009) “ 冶 ,
43 , DNA
上同种的个体聚成一支认为该种鉴定正确 对在 树
形码用于物种鉴定的可行性和实用性 为 。 NJ
, iFlora 中鉴定成功率最高的 片段采用
的技术开发和数据整合提供依据 ITS RAxML鄄HPC BlackBox
。 等 构建最大似然树
7.4.4 (Stamatakis , 2008) (Maxi鄄
另外 利用
1摇 材料与方法 mum Likelihood, ML)。 , TaxonDNA (Meier
等 软件中的 最佳匹配 最近
,2006) “ (Best match)冶、 “
1 1摇 研究材料 匹配 和 所有物种条码
. (Best close match)冶 “ (All spe鄄
本研究在前期工作基础上 等 补充了 模式对条码的鉴别力进行评估
(Yu , 2011), cies barcodes)冶 。
个种 个个体样品 研究对象包括马先蒿属对生和轮
7 18 ,
生叶 种 个个体 每个种包括了 个个体 附 2摇 结果
43 164 , 2 ~8 (
录
采用建树法和距离法对马先蒿属的物种鉴定
1, http://journal.kib.ac.cn/UserFiles/File/LMLappen鄄
实验材料均为野外采集后 经硅胶快速干燥
dix.pdf)。 , 成功率进行了分析 在基于单个片段的 树
的叶片 供 提取 凭证标本存放于中国科学院昆明 。 NJ
, DNA 。 中 表现最好 可以区分 种中的 种
植物研究所标本馆 材料保存于中国西南 , ITS , 43 35
(KUN), DNA 图 mat 可以区分 种中的
野生生物种质资源库 (81.40%) ( 1), K 43 24
。 种 trn psb 可区分 种中的
1 2摇 研究方法 (55.81%), H鄄 A 43 22
. 种 rbc 鉴定能力较弱 只能区分
本研究中总 提取采用改良 法 和 (51.16%), L ,
DNA CTAB (Doyle
种中的 种 在 个单独条码
选取的 片段所使用 扩增和测序
43 16 (37.21%)。 4
Doyle,1987), DNA PCR
分别构建的 树中均能鉴定成功的有 种
引物见表 对于 mat 片段 扩增首先选用引物
1。 K , PCR NJ 10
和 对于扩增失败的样品 选用候选引 而采用 个条码均没能鉴定出的种
3F_KIM 1R_KIM, , (23.26%), 4
物mat 和 所有 个片段 扩增反应程 有 种 即P.cymbalaria P.rex P.
K5r 1R_KIM。 4 PCR 8 (18.60%), , ,
序一致 预变性 变性 thamnophlia P.confertiflora P.maxionii P.anas
: 94益 3min, 94益 45 s, 53 ~55 益 , , , ,
退火 延伸 个循环后 延伸 P.rupicola和P.kansuensis 片段组合中 rbc
1min, 72益 1min, 35 , 72益 5 。 L+ITS
扩增反应体系为 含 鉴定成功率为 rbc mat 鉴定成
min。 PCR 21滋L: 1滋L (30~80ng·
79.07%, L+ITS+ K
滋L-1) DNA模板, 10滋L2伊Taq PCR MasterMix (北京天 功率为 rbc mat trn psb 鉴
74.42%, L+ITS+ K+ H鄄 A
根生化科技有限公司 包含
; 0.1 U Taq polymerase/滋L, 定成功率为 表
76.74% ( 1)。
-1 -1
0.5mmol·L dNTP, 20 mmol·L Tris鄄HCl (pH 8.3), 距离法中 单独片段鉴定成功率在 最佳匹
-1 和 -1 双蒸水 , “
100mmol·L KCl 3 mmol·L MgCl2), 9 滋L 配 模式中表现为 最高 为 rbc 最
和正反向引物各 -1 扩增 冶 ITS , 89.57%, L
(ddH2O) 0.5滋L (1滋mol·L )。 低 为 片段组合鉴定成功率rbc mat
得到的 产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后 用 , 46.34%。 L + K
PCR , Ex鄄 trn psb 最高 为 rbc 最低
纯化并测 + H鄄 A+ITS , 90.85%, L+ITS ,
oSAP鄄IT (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA)
为 最近匹配 模式中表现为 最高
序 为保证序列的准确性 所有片段均采用双向测序
74.39%。 “ 冶 ITS ,
。 , 。
1 3摇 数据分析 为 rbc 最低 为 片段组合中
. 88.95%, L , 46.34%。
前期研究中已对 个单独片段条码和 个片段组合 rbc mat trn psb 最高 为 rbc
4 6 L+ K+ H鄄 A+ITS , 90.24%, L+
条码进行了分析 筛选出了最佳的单独片段 和片段 最低 为 在 所有物种条码 模式
, ITS ITS , 74.39%。 “ 冶
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇710摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
中 单独片段鉴定成功率 最高 为 最佳匹配 和 最近匹配 模式中鉴定成功
, ITS , 66.25%, “ 冶 “ 冶
trn psb 最小 为 片段组合中 rbc 率较低 而在 所有物种条码 模式中较高
H鄄 A , 51.87%。 L+ , “ 冶
mat trn psb 最高 为 rbc 可能是rbc 序列在不同物种中拥有
K+ H鄄 A+ITS , 67.07%, L+ITS (65.24%), L
最低 为 表 相同序列的比例很高导致的假阳性鉴定结果
, 37.19% ( 1)。
等 另外 不同片段对物种的鉴
表1摇 四个片段的引物信息表
(Ross , 2008)。 ,
定结果也有冲突 例如 在 中得到 支
Table1摇 PrimerpairsusedforthefourDNAregions 。 , ITS 100%
持的P.comptoniifolia在 个叶绿体片段中都没有
Region Primername Primersequence(5忆to3忆) 3
与P.rigida分开 同样 在 中得到 支持
1F
rbc ATGTCACCACAAACAGAAAC ; , ITS 99%
L 724R 的P.rhynchotricha在 个叶绿体片段中也都没有
TCGCATGTACCTGCAGTAGC
3
3F_KIM
CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG 与P. oliveriana 分开 这种差异可能是由于叶绿
mat 1R_KIM 。
K mat 5r AATATCCAAATACCAAATCC 体基因进化速率与 相比较慢 也可能是杂交
K GTTCTAGCACAAGAAAGTCG ITS ,
trn 或基因渐渗所引起 等 在本研究中
trn psb H2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (Li , 2011a)。
H鄄 A psb
AF GTTATGCATGAACGTAATGCTC 基于形态性状鉴定的 种 有 种在 树和
43 , 8 NJ
ITS4 GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 树中没有构成单系 需要更多样品的形态分
ITS ITS5 TCCTCCGCTTATTGATATGC ML ,
析以及居群遗传学的研究以确定这些种划分的合
对 片段所做的 树显示的鉴定结果与 理性 在构成单系的 种中 有 种得到较高
ITS ML 。 35 , 34
树基本一致 均可鉴定出 种 见黑色标识 的支持率 分子证据与形态鉴定结果
NJ , 35 ( (>70%),
分支 其中 种的支持率在 树和 树中 达到较高的一致性 本研究进一步支持了 作
), 26 NJ ML 。 ITS
均为 种的支持率高于 图 为马先蒿属物种鉴定的主要条形码 能够满足快
100%, 34 70% ( 1)。 ,
鸭首马先蒿 P.anas 舟形马先蒿 P.cymbal鄄 速和准确鉴定的要求
( ), ( 。
aria 甘肃马先蒿 P. kansuensis 大王马先 3 2摇 对疑难种鉴定的作用
), ( ), .
蒿 P.rex 和灌丛马先蒿 P. thamnophila 各 在传统的植物志中 物种的描述和检索表中
( ) ( ) ,
自有部分样品聚在一起 见灰色标识分支 的关键性状通常是遵照原始文献资料 或者依据
( )。 ,
标本的特征记录 形态性状本身存在个体变异
。 ,
3摇 讨论 一些形态性状在物种间存在重叠 或渐变的状
,
3 1摇 物种鉴定成功率的评价 态 在实际应用中 物种的鉴定主要参考植物志
. 。 ,
在 个条形码片段中 的鉴定成功率最 和 或 标本比较 这就要求鉴定人对研究类
4 , ITS ( ) ,
高 成功鉴定的 个种中 近缘种 群相当熟悉 并且具有丰富的经验 与形态性状
(81.40%), 35 , , 。
之间仅利用形态性状鉴定比较困难 特别是琴盔 相比 分子性状较为稳定 而且分子实验和数据
, , ,
系 轮叶系 中 分析过程也更加规范 因此 条形码可有
(Ser.Lyratae)、 (Ser. Verticillatae) , , DNA
的种类 形态上很相似 而 条形码与形态 效地辅助传统植物志对物种进行准确鉴定 李
, 。 DNA (
性状结合 对区分近缘种效果明显 等 洪涛等
, 。 Yu (2011) , 2012)。
的研究中 的鉴定成功率为 可能是样 在本研究中 将 条形码与形态性状和
ITS 78.4%, , DNA
品中互生叶类群有些种界定不清 导致鉴定成功 分布信息结合 可成功解决一些疑难种的归属问
, ,
率略低 rbc 的鉴定成功率最低 题 例如 采自四川雅江的样品 图
。 L (37. 21%), 。 , HW10329 (
在种级水平上 特别是对于近期分化的类群 鉴 其花冠形态与浅黄马先蒿 P. lutescens
, , 2: D), ( )
别能力有限 任保青和陈之端 等 图 相似 如弓曲的盔部 盔端下缘
( , 2010; Yu , ( 2: A, B) , ,
等 的结果也显示 rbc 鉴定 多齿和花冠具紫色斑点等 同时 其圆钝盔端近
2011)。 Yu (2011) L ; ,
成功率较低 但由于 rbc 的引物通用 似于琴盔马先蒿 P.lyrata 图 在地理
(38.6%), L ( ) ( 2: C)。
性和测序质量较好 所以推荐与 作为组合 分布上 浅黄马先蒿分布和琴盔马先蒿不重叠
, ITS , ,
条码 本研究中 rbc 组合也能达到较高的 样品 产地是在琴盔马先蒿的分布范围
。 ITS+ L HW10329
鉴定成功率 距离法中 rbc 在 内 本研究表明 该样品与琴盔马先蒿聚在一起
(79. 07%)。 , L 。 , ,
期 刘珉璐等 植物物种的快速鉴定与 条形码在马先蒿属中的应用
6 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : iFlora: DNA 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇71摇1
图 基于 片段所构建的邻接树 分枝上的数值为邻接法 最大似然法得出的靴带值 黑色标识分支
1摇 ITS , / 。 :
全部样品构成单系的种 灰色标识分支 部分样品聚为一支的种
; :
Fig.1摇 Aneighbor鄄joining(NJ) treeinferringfromthenuclearITSsequences. Bootstrapvaluesindicatedabovethebrancheswerecalculated
usingNJ/Maximumlikelihoodmethods. Blackclades:speciesismonophyletic;greyclades:specieswithpartofitssamplesgroupingtogether
(cid:7738)(cid:7738) (cid:10134)(cid:10134) (cid:1843)(cid:1843) (cid:12712)(cid:12712) (cid:827)(cid:827) (cid:17009)(cid:17009) (cid:9149)(cid:9149) (cid:4243)(cid:4243) (cid:6098)(cid:6098) (cid:12377)(cid:12377) (cid:2212)(cid:2212)
(cid:2450)(cid:2450)(cid:5026)(cid:5026)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:2450)(cid:1318)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2450)(cid:2450) (cid:4617)(cid:4617)(cid:4886)(cid:4886)
(cid:3085)(cid:3085)(cid:8337)(cid:8337) (cid:5057)(cid:5057)(cid:16658)(cid:16658)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295)(cid:871)(cid:871)(cid:10593)(cid:10593)(cid:11265)(cid:11265)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:2323)(cid:2323)(cid:813)(cid:813)(cid:855)(cid:855)(cid:1208)(cid:1208)(cid:4221)(cid:4221)(cid:7004)(cid:7004)(cid:18164)(cid:18164) (cid:5263)(cid:5263)(cid:11185)(cid:11185)(cid:2339)(cid:2339)(cid:10100)(cid:10100)(cid:6354)(cid:6354)(cid:17662)(cid:17662)(cid:955)(cid:955)(cid:6930)(cid:6930)(cid:9876)(cid:9876)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828)(cid:2489)(cid:2489)(cid:13311)(cid:13311)(cid:8456)(cid:8456)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:1010)(cid:1010)(cid:1019)(cid:1019)
(cid:5512)(cid:5512) (cid:6425)(cid:6425) (cid:6425)(cid:6425)
(cid:14103)(cid:14103)(cid:3080)(cid:3080)(cid:4874)(cid:4874)(cid:10547)(cid:10547)(cid:3461)(cid:3461)(cid:11185)(cid:11185)(cid:7524)(cid:7524)(cid:2542)(cid:2542) (cid:3115)(cid:3115) (cid:1699)(cid:1699)(cid:14302)(cid:14302) (cid:5263)(cid:5263)(cid:5422)(cid:5422)(cid:10150)(cid:10150)(cid:5294)(cid:5294)(cid:19435)(cid:19435)(cid:1042)(cid:1042)(cid:1873)(cid:1873)(cid:4295)(cid:4295)(cid:7524)(cid:7524)(cid:2542)(cid:2542) (cid:5057)(cid:5057)(cid:871)(cid:871)(cid:2583)(cid:2583)(cid:855)(cid:855)(cid:12026)(cid:12026)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6601)(cid:6601)(cid:1329)(cid:1329)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2295)(cid:2295) (cid:3965)(cid:3965) (cid:1318)(cid:1318)(cid:6617)(cid:6617) (cid:822)(cid:822)(cid:613)(cid:613)(cid:5512)(cid:5512) (cid:5302)(cid:5302)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6601)(cid:6601)(cid:1329)(cid:1329)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2295)(cid:2295) (cid:5512)(cid:5512)
(cid:1741)(cid:1741)(cid:5263)(cid:5263)(cid:5422)(cid:5422)(cid:17662)(cid:17662)(cid:1129)(cid:1129)(cid:955)(cid:955)(cid:14156)(cid:14156)(cid:5263)(cid:5263)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425) (cid:4830)(cid:4830)(cid:6245)(cid:6245)(cid:4674)(cid:4674)(cid:6407)(cid:6407)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6400)(cid:6400)(cid:5177)(cid:5177)(cid:663)(cid:663)(cid:5408)(cid:5408)(cid:5177)(cid:5177) (cid:3115)(cid:3115) (cid:13625)(cid:13625) (cid:7310)(cid:7310)(cid:5263)(cid:5263)(cid:11566)(cid:11566)(cid:11585)(cid:11585)(cid:12195)(cid:12195)(cid:15765)(cid:15765)(cid:6971)(cid:6971) (cid:16658)(cid:16658)(cid:7524)(cid:7524)(cid:2542)(cid:2542)(cid:5057)(cid:5057)(cid:16658)(cid:16658)(cid:5247)(cid:5247)(cid:4491)(cid:4491)(cid:955)(cid:955)(cid:6930)(cid:6930)
(cid:3965)(cid:3965) (cid:613)(cid:613) (cid:3965)(cid:3965) (cid:6601)(cid:6601)(cid:2730)(cid:2730)(cid:4842)(cid:4842) (cid:5512)(cid:5512)
(cid:6930)(cid:6930)(cid:9876)(cid:9876)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425) (cid:663)(cid:663)(cid:5408)(cid:5408)(cid:2314)(cid:2314)(cid:4170)(cid:4170)(cid:5177)(cid:5177)(cid:4467)(cid:4467)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:3815)(cid:3815)(cid:5408)(cid:5408)(cid:3815)(cid:3815) (cid:3115)(cid:3115) (cid:9876)(cid:9876)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828)
(cid:1318)(cid:1318)(cid:6617)(cid:6617) (cid:4906)(cid:4906)(cid:613)(cid:613)(cid:1820)(cid:1820) (cid:3965)(cid:3965) (cid:613)(cid:613) (cid:3965)(cid:3965) (cid:1318)(cid:1318)(cid:6617)(cid:6617) (cid:222)(cid:222)(cid:613)(cid:613) (cid:6425)(cid:6425)
(cid:2489)(cid:2489)(cid:13311)(cid:13311)(cid:8456)(cid:8456)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425) (cid:6233)(cid:6233)(cid:4467)(cid:4467)(cid:4674)(cid:4674)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:6233)(cid:6233)(cid:4467)(cid:4467)(cid:3815)(cid:3815)(cid:5177)(cid:5177) (cid:3115)(cid:3115) (cid:3085)(cid:3085)(cid:2327)(cid:2327) (cid:4602)(cid:4602) (cid:4602)(cid:4602)(cid:2439)(cid:2439) (cid:5408)(cid:5408)(cid:222)(cid:222)(cid:6400)(cid:6400)(cid:4467)(cid:4467)(cid:663)(cid:663)(cid:5177)(cid:5177)(cid:11185)(cid:11185)(cid:5692)(cid:5692)(cid:886)(cid:886)(cid:827)(cid:827)(cid:4482)(cid:4482)(cid:7240)(cid:7240)
(cid:3965)(cid:3965) (cid:613)(cid:613) (cid:3965)(cid:3965) (cid:1318)(cid:1318)(cid:6617)(cid:6617) (cid:6460)(cid:6460)(cid:613)(cid:613) (cid:3965)(cid:3965) (cid:2436)(cid:2436)
(cid:7222)(cid:7222) (cid:1066)(cid:1066)(cid:7524)(cid:7524)(cid:2542)(cid:2542) (cid:6770)(cid:6770)(cid:7255)(cid:7255)(cid:2098)(cid:2098)(cid:2392)(cid:2392)(cid:3157)(cid:3157)(cid:7257)(cid:7257)(cid:11585)(cid:11585)(cid:12195)(cid:12195)(cid:858)(cid:858) (cid:7524)(cid:7524)(cid:2542)(cid:2542) (cid:7738)(cid:7738)(cid:10134)(cid:10134)(cid:1843)(cid:1843)(cid:12712)(cid:12712)(cid:4243)(cid:4243)(cid:7004)(cid:7004)(cid:7738)(cid:7738)(cid:10134)(cid:10134)(cid:4243)(cid:4243)(cid:2353)(cid:2353)(cid:1843)(cid:1843)(cid:6748)(cid:6748)(cid:4243)(cid:4243)(cid:12030)(cid:12030)(cid:11585)(cid:11585)(cid:12195)(cid:12195)(cid:11185)(cid:11185)(cid:3367)(cid:3367)
(cid:981)(cid:981) (cid:5512)(cid:5512) (cid:613)(cid:613)(cid:6425)(cid:6425)
(cid:855)(cid:855)(cid:1152)(cid:1152)(cid:10828)(cid:10828)(cid:19116)(cid:19116)(cid:8868)(cid:8868)(cid:6145)(cid:6145)(cid:3157)(cid:3157) (cid:4883)(cid:4883)(cid:2336)(cid:2336) (cid:1147)(cid:1147)(cid:11547)(cid:11547)(cid:2489)(cid:2489) (cid:11629)(cid:11629) (cid:827)(cid:827)(cid:1101)(cid:1101)(cid:13324)(cid:13324)(cid:1843)(cid:1843)(cid:12712)(cid:12712)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295)(cid:6886)(cid:6886)(cid:8706)(cid:8706)(cid:11301)(cid:11301)(cid:8449)(cid:8449) (cid:6817)(cid:6817)(cid:2357)(cid:2357)(cid:947)(cid:947)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6601)(cid:6601)(cid:1329)(cid:1329)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2295)(cid:2295) (cid:4043)(cid:4043)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303) (cid:4689)(cid:4689) (cid:5512)(cid:5512) (cid:6425)(cid:6425) (cid:5512)(cid:5512)(cid:5425)(cid:5425)(cid:222)(cid:222)(cid:6419)(cid:6419)(cid:4481)(cid:4481)(cid:664)(cid:664)(cid:5193)(cid:5193) (cid:6601)(cid:6601)(cid:2730)(cid:2730)(cid:4842)(cid:4842)
(cid:17662)(cid:17662)(cid:6925)(cid:6925)(cid:8456)(cid:8456)(cid:11185)(cid:11185)(cid:7738)(cid:7738)(cid:7511)(cid:7511)(cid:6354)(cid:6354)(cid:17662)(cid:17662)(cid:955)(cid:955)(cid:14156)(cid:14156)(cid:5263)(cid:5263)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:1139)(cid:1139)(cid:7004)(cid:7004) (cid:19116)(cid:19116)(cid:7770)(cid:7770)(cid:3123)(cid:3123) (cid:7310)(cid:7310)(cid:5263)(cid:5263)(cid:11566)(cid:11566)(cid:12406)(cid:12406)(cid:6061)(cid:6061)(cid:7260)(cid:7260) (cid:1699)(cid:1699)(cid:1093)(cid:1093)(cid:2028)(cid:2028)(cid:872)(cid:872)(cid:16046)(cid:16046)(cid:7222)(cid:7222) (cid:5400)(cid:5400)(cid:17740)(cid:17740)(cid:2489)(cid:2489)(cid:1779)(cid:1779)(cid:11675)(cid:11675)
(cid:5512)(cid:5512) (cid:5512)(cid:5512) (cid:5512)(cid:5512) (cid:6617)(cid:6617) (cid:981)(cid:981)(cid:613)(cid:613)
(cid:15765)(cid:15765)(cid:1315)(cid:1315)(cid:2439)(cid:2439) (cid:3367)(cid:3367)(cid:955)(cid:955)(cid:5159)(cid:5159)(cid:7486)(cid:7486)(cid:8706)(cid:8706)(cid:2489)(cid:2489)(cid:17162)(cid:17162)(cid:12008)(cid:12008)(cid:8706)(cid:8706)(cid:11185)(cid:11185)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295)(cid:5949)(cid:5949)(cid:1996)(cid:1996)(cid:10420)(cid:10420)
(cid:3071)(cid:3071)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6426)(cid:6426)(cid:6419)(cid:6419)(cid:5364)(cid:5364)(cid:1318)(cid:1318)(cid:2450)(cid:2450) (cid:6619)(cid:6619)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2970)(cid:2970)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:3829)(cid:3829)(cid:2290)(cid:2290)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3965)(cid:3965)(cid:6178)(cid:6178)(cid:613)(cid:613) (cid:6426)(cid:6426)(cid:5193)(cid:5193)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:657)(cid:657)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:664)(cid:664)(cid:5364)(cid:5364)(cid:5364)(cid:5364)(cid:6463)(cid:6463)(cid:6426)(cid:6426)(cid:5193)(cid:5193)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:657)(cid:657)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4275)(cid:4275)(cid:657)(cid:657)(cid:657)(cid:657)(cid:5425)(cid:5425)(cid:3829)(cid:3829)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4275)(cid:4275)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4689)(cid:4689)(cid:5364)(cid:5364)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4184)(cid:4184)(cid:4481)(cid:4481)(cid:657)(cid:657)(cid:3829)(cid:3829)
(cid:5159)(cid:5159)(cid:7486)(cid:7486)(cid:8706)(cid:8706) (cid:865)(cid:865)(cid:10873)(cid:10873)(cid:1385)(cid:1385)
(cid:1350)(cid:1350)(cid:17718)(cid:17718)(cid:5052)(cid:5052)(cid:1860)(cid:1860) (cid:2866)(cid:2866)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4689)(cid:4689)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4184)(cid:4184) (cid:2866)(cid:2866)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4845)(cid:4845)(cid:6419)(cid:6419)(cid:4481)(cid:4481)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4689)(cid:4689)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4184)(cid:4184) (cid:4842)(cid:4842)(cid:6419)(cid:6419)(cid:6419)(cid:6419)(cid:3829)(cid:3829)(cid:6245)(cid:6245)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5425)(cid:5425)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:6426)(cid:6426)(cid:5193)(cid:5193)(cid:664)(cid:664)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4481)(cid:4481)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)
(cid:3071)(cid:3071)(cid:664)(cid:664)(cid:5364)(cid:5364)(cid:5364)(cid:5364)(cid:6463)(cid:6463) (cid:3071)(cid:3071)(cid:4184)(cid:4184)(cid:664)(cid:664)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:4184)(cid:4184)(cid:4481)(cid:4481)(cid:6419)(cid:6419)(cid:657)(cid:657)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5425)(cid:5425)
(cid:6426)(cid:6426)(cid:5193)(cid:5193)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:657)(cid:657) (cid:6372)(cid:6372)(cid:6178)(cid:6178) (cid:2909)(cid:2909)(cid:6619)(cid:6619) (cid:4842)(cid:4842)(cid:6619)(cid:6619) (cid:6476)(cid:6476)(cid:6619)(cid:6619) (cid:2909)(cid:2909)(cid:6619)(cid:6619) (cid:4842)(cid:4842)(cid:6619)(cid:6619) (cid:6476)(cid:6476)(cid:6619)(cid:6619) (cid:2730)(cid:2730)(cid:6476)(cid:6476) (cid:2909)(cid:2909)(cid:6619)(cid:6619) (cid:4842)(cid:4842)(cid:6619)(cid:6619) (cid:6476)(cid:6476)(cid:6619)(cid:6619) (cid:2730)(cid:2730)(cid:6476)(cid:6476)
(cid:6619)(cid:6619)(cid:3071)(cid:3071)(cid:2909)(cid:2909) (cid:2310)(cid:2310)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:1303)(cid:1303) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:4886)(cid:4886) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:5026)(cid:5026) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:4043)(cid:4043) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2310)(cid:2310) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:4886)(cid:4886) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:4043)(cid:4043) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2310)(cid:2310) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:981)(cid:981) (cid:6391)(cid:6391)(cid:6391)(cid:6391)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:4886)(cid:4886) (cid:4617)(cid:4617)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:1303)(cid:1303) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1318) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:981)(cid:981)
(cid:4674)(cid:4674)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6233)(cid:6233)
(cid:6385)(cid:6385) (cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:981)(cid:981) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:5026)(cid:5026) (cid:5026)(cid:5026)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:5026)(cid:5026) (cid:1318)(cid:1318)(cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:5026)(cid:5026) (cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886) (cid:5026)(cid:5026)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:5026)(cid:5026) (cid:1318)(cid:1318)(cid:4617)(cid:4617)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:4886)(cid:4886) (cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:981)(cid:981) (cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886)(cid:4886) (cid:4043)(cid:4043)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:4886)(cid:4886) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:6391)(cid:6391) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:981)(cid:981)
(cid:663)(cid:663)(cid:6407)(cid:6407)(cid:4830)(cid:4830)
(cid:5302)(cid:5302) (cid:4617)(cid:4617)(cid:5026)(cid:5026)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:981)(cid:981) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:1303)(cid:1303) (cid:4043)(cid:4043)(cid:6391)(cid:6391)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:4043)(cid:4043) (cid:4886)(cid:4886)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:981)(cid:981) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:4617)(cid:4617) (cid:4043)(cid:4043)(cid:6391)(cid:6391)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:4043)(cid:4043) (cid:4886)(cid:4886)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:4617)(cid:4617) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303) (cid:6391)(cid:6391)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:4043)(cid:4043) (cid:4617)(cid:4617)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:2310)(cid:2310) (cid:4617)(cid:4617)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:4886)(cid:4886) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303)
(cid:6233)(cid:6233)(cid:663)(cid:663)(cid:4261)(cid:4261) (cid:6227)(cid:6227)(cid:3815)(cid:3815)(cid:6407)(cid:6407)
(cid:822)(cid:822)(cid:6463)(cid:6463) (cid:4842)(cid:4842) (cid:4043)(cid:4043)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:4043)(cid:4043) (cid:4617)(cid:4617)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5026)(cid:5026)(cid:4886)(cid:4886) (cid:5026)(cid:5026)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1318)(cid:1318) (cid:981)(cid:981)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303) (cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:5026)(cid:5026) (cid:5026)(cid:5026)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1318)(cid:1318) (cid:981)(cid:981)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5026)(cid:5026)(cid:4886)(cid:4886) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1318)(cid:1318) (cid:4886)(cid:4886)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:5026)(cid:5026) (cid:4043)(cid:4043)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303)(cid:1303) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:1303)(cid:1303) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1318)(cid:1318)
(cid:663)(cid:663)(cid:6407)(cid:6407)(cid:4830)(cid:4830)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:1389)(cid:1389)(cid:6619)(cid:6619)(cid:3071)(cid:3071)(cid:2909)(cid:2909) (cid:5026)(cid:5026)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:5026)(cid:5026) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:2295)(cid:2295) (cid:5026)(cid:5026)(cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:2295)(cid:2295) (cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:5026)(cid:5026) (cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5026)(cid:5026)(cid:4617)(cid:4617) (cid:5026)(cid:5026)(cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:2295)(cid:2295) (cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:5026)(cid:5026) (cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5026)(cid:5026)(cid:4617)(cid:4617) (cid:1303)(cid:1303) (cid:2450)(cid:2450) (cid:4617)(cid:4617)(cid:5026)(cid:5026)(cid:2436)(cid:2436)(cid:981)(cid:981)(cid:2295)(cid:2295) (cid:6391)(cid:6391)(cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4886)(cid:4886)(cid:2310)(cid:2310) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:981)(cid:981) (cid:1303)(cid:1303) (cid:2450)(cid:2450)
(cid:663)(cid:663)(cid:6407)(cid:6407)(cid:4830)(cid:4830) (cid:4674)(cid:4674)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6233)(cid:6233)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:1389)(cid:1389) (cid:6385)(cid:6385)(cid:1389)(cid:1389)(cid:6619)(cid:6619)(cid:3071)(cid:3071)(cid:2909)(cid:2909) (cid:5026)(cid:5026)(cid:4043)(cid:4043)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:1318)(cid:1318) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:6391)(cid:6391) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:981)(cid:981) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303) (cid:981)(cid:981)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:5026)(cid:5026) (cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2310)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4043)(cid:4043)(cid:981)(cid:981) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303) (cid:981)(cid:981)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:4617)(cid:4617)(cid:6391)(cid:6391) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303) (cid:4886)(cid:4886)(cid:5026)(cid:5026)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:1318)(cid:1318) (cid:4617)(cid:4617)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:4617)(cid:4617) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:1318)(cid:1318) (cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:6391)(cid:6391)(cid:1303)(cid:1303)
(cid:663)(cid:663)(cid:6407)(cid:6407)(cid:4830)(cid:4830) (cid:4674)(cid:4674)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6233)(cid:6233)
(cid:5302)(cid:5302)(cid:1389)(cid:1389) (cid:6385)(cid:6385)(cid:1389)(cid:1389)
(cid:6233)(cid:6233)(cid:663)(cid:663)(cid:4261)(cid:4261) (cid:6227)(cid:6227)(cid:3815)(cid:3815)(cid:6407)(cid:6407) (cid:5026)(cid:5026)(cid:6391)(cid:6391)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5026)(cid:5026)(cid:4043)(cid:4043) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:1303)(cid:1303) (cid:2295)(cid:2295)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:4886)(cid:4886) (cid:1303)(cid:1303) (cid:2450)(cid:2450) (cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:981)(cid:981)(cid:4043)(cid:4043) (cid:2295)(cid:2295)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:4043)(cid:4043) (cid:1303)(cid:1303) (cid:2450)(cid:2450) (cid:5026)(cid:5026)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2295)(cid:2295)(cid:1318)(cid:1318) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:1318)(cid:1318) (cid:6391)(cid:6391)(cid:5026)(cid:5026)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1303)(cid:1303)(cid:5026)(cid:5026) (cid:1318)(cid:1318)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:6391)(cid:6391) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:1318)(cid:1318) (cid:981)(cid:981)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2310)(cid:2310)(cid:1318)(cid:1318)
(cid:822)(cid:822)(cid:6463)(cid:6463) (cid:4842)(cid:4842)(cid:1389)(cid:1389)(cid:6619)(cid:6619)(cid:3071)(cid:3071)(cid:2909)(cid:2909)
(cid:8725)(cid:8725) (cid:5949)(cid:5949)(cid:1996)(cid:1996)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295) (cid:8014)(cid:8014)(cid:12791)(cid:12791)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295) (cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295)(cid:3678)(cid:3678)(cid:16978)(cid:16978) (cid:8654)(cid:8654)(cid:7222)(cid:7222)(cid:2150)(cid:2150)(cid:18042)(cid:18042)
(cid:6617)(cid:6617) (cid:3965)(cid:3965)(cid:2909)(cid:2909)(cid:6619)(cid:6619)(cid:613)(cid:613)(cid:2847)(cid:2847) (cid:3965)(cid:3965)(cid:4842)(cid:4842)(cid:6619)(cid:6619)(cid:613)(cid:613)(cid:2847)(cid:2847) (cid:3965)(cid:3965)(cid:6476)(cid:6476)(cid:6619)(cid:6619)(cid:613)(cid:613)(cid:2847)(cid:2847) (cid:3965)(cid:3965)(cid:2730)(cid:2730)(cid:6476)(cid:6476)(cid:613)(cid:613)
(cid:2730)(cid:2730)(cid:4481)(cid:4481)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5364)(cid:5364)(cid:6617)(cid:6617)(cid:2909)(cid:2909)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6617)(cid:6617)(cid:3829)(cid:3829)(cid:2290)(cid:2290)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:2970)(cid:2970)(cid:2290)(cid:2290)(cid:6419)(cid:6419)(cid:5425)(cid:5425)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2970)(cid:2970)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2847)(cid:2847)(cid:4842)(cid:4842)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6617)(cid:6617)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4689)(cid:4689)(cid:6426)(cid:6426)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2657)(cid:2657)(cid:2290)(cid:2290)(cid:4481)(cid:4481)(cid:2290)(cid:2290)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5425)(cid:5425)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2970)(cid:2970)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2847)(cid:2847)(cid:6476)(cid:6476)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6617)(cid:6617)(cid:4689)(cid:4689)(cid:5425)(cid:5425)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5425)(cid:5425)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2970)(cid:2970)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2847)(cid:2847)(cid:2730)(cid:2730)(cid:6476)(cid:6476)(cid:6617)(cid:6617)(cid:4275)(cid:4275)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4689)(cid:4689)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4184)(cid:4184)
(cid:3115)(cid:3115) (cid:7310)(cid:7310)(cid:5263)(cid:5263)(cid:11566)(cid:11566)(cid:5949)(cid:5949)(cid:1996)(cid:1996)(cid:10837)(cid:10837)(cid:955)(cid:955)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828)(cid:4491)(cid:4491)(cid:10942)(cid:10942)(cid:19435)(cid:19435)(cid:12026)(cid:12026)(cid:18337)(cid:18337)(cid:4295)(cid:4295)(cid:875)(cid:875)(cid:1208)(cid:1208)
(cid:1318)(cid:1318)(cid:2450)(cid:2450) (cid:6601)(cid:6601)(cid:2730)(cid:2730)(cid:4842)(cid:4842)
(cid:8818)(cid:8818)(cid:21489)(cid:21489)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:8818)(cid:8818)(cid:21489)(cid:21489)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:10593)(cid:10593)(cid:11265)(cid:11265)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:14156)(cid:14156)(cid:5263)(cid:5263)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:6930)(cid:6930)(cid:9876)(cid:9876)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828) (cid:13311)(cid:13311)(cid:8456)(cid:8456)(cid:20377)(cid:20377)(cid:1653)(cid:1653)(cid:14828)(cid:14828)
(cid:4842)(cid:4842)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:2866)(cid:2866)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:2304)(cid:2304)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:6601)(cid:6601)(cid:2436)(cid:2436) (cid:822)(cid:822)(cid:1778)(cid:1778)(cid:981)(cid:981)(cid:1303)(cid:1303)(cid:4617)(cid:4617)(cid:1318)(cid:1318)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2847)(cid:2847) (cid:4906)(cid:4906)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:222)(cid:222)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:6460)(cid:6460)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2847)(cid:2847) (cid:822)(cid:822)(cid:2436)(cid:2436) (cid:5302)(cid:5302)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6601)(cid:6601)(cid:1329)(cid:1329)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2295)(cid:2295)
(cid:1751)(cid:1751)(cid:5347)(cid:5347)(cid:656)(cid:656)(cid:5408)(cid:5408)(cid:4830)(cid:4830)(cid:2281)(cid:2281)(cid:6400)(cid:6400)(cid:5177)(cid:5177)(cid:663)(cid:663)(cid:5408)(cid:5408)(cid:3815)(cid:3815)
(cid:222)(cid:222)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2657)(cid:2657)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1318)(cid:1318)(cid:2450)(cid:2450) (cid:3071)(cid:3071)(cid:2314)(cid:2314)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5193)(cid:5193)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:4481)(cid:4481)(cid:2970)(cid:2970) (cid:3829)(cid:3829)(cid:6245)(cid:6245)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5425)(cid:5425)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4689)(cid:4689)(cid:6245)(cid:6245)(cid:6419)(cid:6419)(cid:5364)(cid:5364)(cid:2856)(cid:2856)(cid:5193)(cid:5193)(cid:664)(cid:664)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:2290)(cid:2290)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:3829)(cid:2970)(cid:2970)(cid:2290)(cid:2290)(cid:6419)(cid:6419)(cid:6419)(cid:6419)(cid:6263)(cid:6263)(cid:5425)(cid:5425)(cid:657)(cid:657)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2970)(cid:2970)(cid:5425)(cid:5425)(cid:5364)(cid:5364)(cid:657)(cid:657)(cid:2290)(cid:2290)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2657)(cid:2657)(cid:6251)(cid:6251)(cid:4184)(cid:4184)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2290)(cid:2290)(cid:4845)(cid:4845)(cid:6419)(cid:6419)(cid:5364)(cid:5364)(cid:5193)(cid:5193)(cid:664)(cid:664)(cid:6619)(cid:6619)(cid:3071)(cid:3071)(cid:2909)(cid:2909)(cid:3829)(cid:3829)(cid:5364)(cid:5364)(cid:2358)(cid:2358)(cid:2290)(cid:2290)(cid:5364)(cid:5364)(cid:4275)(cid:4275)(cid:4845)(cid:4845)(cid:5364)(cid:5364)(cid:3829)(cid:3829)
(cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:6400)(cid:6400)(cid:2281)(cid:2281)(cid:6233)(cid:6233)(cid:5347)(cid:5347)(cid:3815)(cid:3815)(cid:4830)(cid:4830)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:3815)(cid:3815) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:6400)(cid:6400)(cid:2281)(cid:2281)(cid:6233)(cid:6233)(cid:5347)(cid:5347)(cid:3815)(cid:3815)(cid:4830)(cid:4830)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:3815)(cid:3815) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:6400)(cid:6400)(cid:6245)(cid:6245)(cid:663)(cid:663)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6233)(cid:6233)(cid:5177)(cid:5177)
(cid:4842)(cid:4842)(cid:2436)(cid:2436) (cid:222)(cid:222)(cid:664)(cid:664)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4275)(cid:4275)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4184)(cid:4184)(cid:2436)(cid:2436) (cid:5364)(cid:5364)(cid:2856)(cid:2856)(cid:6476)(cid:6476)(cid:5193)(cid:5193)(cid:2856)(cid:2856)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4689)(cid:4689)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2847)(cid:2847)(cid:2866)(cid:2866)(cid:2436)(cid:2436) (cid:222)(cid:222)(cid:664)(cid:664)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4275)(cid:4275)(cid:4845)(cid:4845)(cid:4184)(cid:4184)(cid:2436)(cid:2436) (cid:5364)(cid:5364)(cid:2856)(cid:2856)(cid:6476)(cid:6476)(cid:5193)(cid:5193)(cid:2856)(cid:2856)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4689)(cid:4689)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2847)(cid:2847)(cid:2304)(cid:2304)(cid:2436)(cid:2436) (cid:1760)(cid:1760)(cid:664)(cid:664)(cid:5193)(cid:5193)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4275)(cid:4275)(cid:5364)(cid:5364)(cid:2856)(cid:2856)(cid:6476)(cid:6476)(cid:5193)(cid:5193)(cid:2856)(cid:2856)(cid:5425)(cid:5425)(cid:4689)(cid:4689)(cid:2436)(cid:2436)(cid:2847)(cid:2847)(cid:6601)(cid:6601)(cid:2436)(cid:2436) (cid:822)(cid:822)(cid:1778)(cid:1778)(cid:981)(cid:981)(cid:1303)(cid:1303)(cid:4617)(cid:4617)(cid:1318)(cid:1318)(cid:2295)(cid:2295)(cid:2847)(cid:2847)
(cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:4830)(cid:4830)(cid:6245)(cid:6245)(cid:4674)(cid:4674)(cid:6407)(cid:6407)(cid:5177)(cid:5177)(cid:6400)(cid:6400)(cid:5177)(cid:5177)(cid:663)(cid:663)(cid:5408)(cid:5408)(cid:5177)(cid:5177) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:663)(cid:663)(cid:5408)(cid:5408)(cid:2314)(cid:2314)(cid:4170)(cid:4170)(cid:5177)(cid:5177)(cid:4467)(cid:4467)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:3815)(cid:3815)(cid:5408)(cid:5408)(cid:3815)(cid:3815) (cid:1751)(cid:1751)(cid:2425)(cid:2425)(cid:6233)(cid:6233)(cid:4467)(cid:4467)(cid:4674)(cid:4674)(cid:5347)(cid:5347)(cid:4261)(cid:4261)(cid:6233)(cid:6233)(cid:4467)(cid:4467)(cid:3815)(cid:3815)(cid:5177)(cid:5177)
(cid:4906)(cid:4906)(cid:2436)(cid:2436) (cid:2866)(cid:2866)(cid:4481)(cid:4481)(cid:4275)(cid:4275)(cid:5193)(cid:5193)(cid:6251)(cid:6251)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2847)(cid:2847)(cid:222)(cid:222)(cid:2436)(cid:2436) (cid:822)(cid:822)(cid:2436)(cid:2436)(cid:1760)(cid:1760)(cid:2436)(cid:2436) (cid:597)(cid:597)(cid:5193)(cid:5193)(cid:4275)(cid:4275)(cid:2657)(cid:2657)(cid:2847)(cid:2847)(cid:6460)(cid:6460)(cid:2436)(cid:2436) (cid:822)(cid:822)(cid:2436)(cid:2436)(cid:5302)(cid:5302)(cid:2436)(cid:2436) (cid:5302)(cid:5302)(cid:5425)(cid:5425)(cid:2847)(cid:2847)(cid:822)(cid:822)(cid:2436)(cid:2436) (cid:5302)(cid:5302)(cid:6619)(cid:6619)(cid:6601)(cid:6601)(cid:1329)(cid:1329)(cid:981)(cid:981)(cid:1318)(cid:1318)(cid:1303)(cid:1303)(cid:2295)(cid:2295)
期 刘珉璐等 植物物种的快速鉴定与 条形码在马先蒿属中的应用
6 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 : iFlora: DNA 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇71摇3
的物种鉴定 不仅分类学家可以使用 也适合于 sources 植物分类与资源学报 34
, , ( ), :532—538
非专业人员利用 可用于辅助传统方法难以 GaoLM(高连明),LiuJ(刘杰), Cai J (蔡杰) et al.,2012. A
; 2)
鉴定的疑难种 发现新种和隐形种 揭示物 synopsisoftechnical notes on the standard for plants DNA bar鄄
; 3) , PlantDiversityandResources 植物分类与资源学
种多样性 进行分类修订 当然 条形码 coding [J]. (
, 。 , DNA 报 34
), :592—606
也存在一些不足 如 分子鉴定与形态鉴定结果 Bythinel鄄
, : HaaseM,WilkeT,MildnerP,2007. Identifyingspeciesof
存在一定的冲突 进化速率的差异导致不同来源 la
; (Caenogastropoda:Rissooidea):apleaforan integrative ap鄄
的条形码鉴定结果不完全一致 条形码研 Zootaxa 1563
proach [J]. , :1—16
。 DNA
etal
究仍是以形态鉴定为基础 同时又可以对形态鉴 HajibabaeiM,SingerGAC,HebertPDN .,2007. DNAbarcod鄄
,
定进行检验 任保青和陈之端 分子性 ing: how it complements taxonomy, molecular phylogenetics and
( , 2010)。 TrendsinGenetics 23
populationgenetics [J]. , :167—172
状与形态性状相辅相成 是 中最重要的两
, iFlora HallTA,1999. Bioedit: a user friendly biological sequences align鄄
种鉴定途径 方伟和刘恩德 条形
( , 2012)。 DNA menteditor and analysis program for Windows95/98/NT [J].
码作为 的核心组件 配合其他关键形态学 NucleicAcidsSymposiumSeries 41
, :95—98
iFlora ,
et al
特征 植物图像 分布信息和分子系统发育等数 HebertPDN,CywinskaA,Ball SL .,2003. Biological identifi鄄
、 、 Proceedings of the Royal
据 实现综合的智能化物种鉴定 陆露等 cations through DNA barcodes [J].
, ( ,2012)。 SocietyofLondonSeriesB鄄BiologicalSciences 270
, :313—321
随着物种 条形码数据库及相关数据的不断
et al
DNA HebertPDN, Penton EH, Burns JM ., 2004. Ten species in
积累和完善 在未来对植物物种的鉴定中
, iFlora one: DNA barcoding reveals cryptic species in the neotropical
将发挥出重要作用 为分类学和其他学科的研究 Astraptesfulgerator ProceedingsoftheNa鄄
skipperbutterfly [J].
,
tionalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica 101
奠定基础 并充分的为社会和公众所用 , :
, 。
14812—14817
etal
HollingsworthML,ClarkAA,ForrestLL .,2009. Selectingbar鄄
致谢 本研究群体高连明 蔡杰 张书东 张挺 陆
摇 、 、 、 、 codinglociforplants:evaluationofsevencandidatelociwithspe鄄
露 刘杰和何华杰提供部分实验材料 吴丁 蒋伟和骆
、 ; 、 cies鄄levelsampling in three divergent groups of landplants [J].
洋在野外工作中提供帮助 杨俊波 黄盼辉 张娟红 MolecularEcologyResources 9
; 、 、 、 , :439—457
曾春霞和杨静为实验工作提供支持
。 KressWJ,EricksonDL,2007. A two鄄locus global DNA barcode for
rbc
landplants: The coding L gene complements the non鄄coding
也参 考 文 献页 trnH鄄psbAspacerregion [J]. PloSONE,2:e508
摇 摇 摇 etal
KressWJ,WurdackKJ,ZimmerEA .,2005. UseofDNAbar鄄
ProceedingsoftheNation鄄
吴征镒 路安民 汤彦承等 中国被子植物科属综论 codestoidentifyfloweringplants [J].
, , , 2003. al Academy of Sciences of the United States of America 102
北京 科学出版社 , :
[M]. :
8369—8374
CBOLPlantWorking Group,2009. A DNA barcode for land plants etal
KristiansenKA,CilieborgM,DrabkovaL .,2005. DNAtaxono鄄
ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnit鄄
[J]. Oxychloe Systematic Botany
my鄄theriddleof (Juncaceae) [J]. ,
edStatesofAmerica 106
, :12794—12797 30
:284—289
et al
ChaseMW,Cowan RS, Hollingsworth PM .,2007. A proposal etal
LahayeR,VanderBankM,BogarinD .,2008. DNAbarcoding
Tax鄄
forastandardisedprotocoltobarcodeall land plants [J]. ProceedingsoftheNation鄄
theflorasofbiodiversityhotspots [J].
on,56:295—299 al Academy of Sciences of the United States of America, 105:
etal
ChenSL,YaoH,HanJP .,2010. ValidationoftheITS2region 2923—2928
etal
asanovel DNA barcode for identifying medicinal plant species LiDZ,GaoLM,LiHT .,2011a. Comparativeanalysisofalarge
PloSONE 5
[J]. , :e8613 datasetindicatesthatinternaltranscribedspacer(ITS) shouldbe
Proceed鄄
DeSalleR,EganMG,SiddallM,2005. Theunholytrinity:taxono鄄 incorporatedintothecorebarcodeforseedplants [J].
Philosophical ingsofthe National Academy of Sciences of the United States of
my,speciesdelimitationandDNAbarcoding [J].
Transactionsof the Royal Society of London Series B鄄Biological America 108
, :19641—19646
Sciences 360 etal
, :1905—1916 LiDZ,LiuJQ,ChenZD .,2011b. PlantDNAbarcodinginChi鄄
JournalofSystematicsandEvolution 49
DoyleJ,Doyle J,1987. A rapid DNA isolation procedure for small na [J]. , :165—168
Phytochemistry 19 李德铢 王雨华 伊廷双 et al
quantitiesoffreshleaftissue [J]. , :11—15 LiDZ( ), Wang YH ( ), Yi TS ( ) .,
方伟 刘恩德 Plant Diversity
FangW( ), Liu ED ( ), 2012. The development of 2012. The next generation Flora: iFlora [J].
PlantDiversityandRe鄄 andResources 植物分类与资源学报 34
classicalplanttaxonomyandiFlora [J]. ( ), :525—531
植 物 分 类 与 资 源 学 报 第 卷
摇714摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 35
Pedicularis Evolution
LiHL,1951. Evolutionintheflowersof [J]. , Vogler AP,MonaghanMT,2007. RecentadvancesinDNAtaxonomy
5 Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Re鄄
:158—164 [J].
李洪涛 曾春霞 高连明 et al search 45
LiHT( ),ZengCX( ), Gao LM ( ) ., , :1—10
王红 王雨华 杨祝良 etal
2012. Genetic information and technologies related to iFlora WangH( ),WangYH( ),YangZL( ) .,
Plant Diversity and Resources 植物分类与资源学报
[J]. ( ), 2012. iFlora: opportunities and challenges for botanists [J].
34 PlantDiversityand Resources 植物分类与资源学报 34
:585—591 ( ), :
etal mat
LiY,GaoLM,PoudelRC .,2011c. High universalityof K I—III
Journal of Systematics
primersforbarcoding gymnosperms [J]. WillKW,MishlerBD,Wheeler QD,2005. The perils of DNA bar鄄
andEvolution 49 SystematicBi鄄
, :169—175 codingandtheneedforintegrativetaxonomy [J].
陆露 王红 李德铢 ology 54
LuL( ), Wang H ( ), Li DZ ( ), 2012. Some , :844—851
considerations on data integration for the next鄄generation Flora YangFS,Wang XQ, Hong DY,2003. Unexpected high divergence
Gaultheria
(iFlora) and Flora revision—A case study of (Eri鄄 innrDNAITS and extensive parallelism in floral morphology of
PlantDiversityandResources 植物分类与资源 Pedicularis Plant Systematics and Evo鄄
caceae) [J]. ( (Orobanchaceae) [J].
学报 34 lution 240
), :562—584 , :91—105
etal
MeierR,KwongS,VaidyaG .,2006. DNAbarcodingandtax鄄 YangFS,WangXQ,2007. Extensivelength variation in thecpDNA
trn trn Pedicularis
onomyinDiptera:ataleof high intraspecific variability and low T鄄 Fregionofhemiparasitic anditsphylogenetic
Systematic Biology 55 PlantSystematicsandEvolution 264
identificationsuccesstransactions [J]. , : implications [J]. , :251—
715—728 264
Pe鄄 Pedicularis
ReeRH,2005. Phylogenyandtheevolutionoffloraldiversityin YangHB, Holmgren NH, Mill RR, 1998. Linn [A].
dicularis International Journal of Plant FloraofChina
(Orobanchaceae) [J]. In:WuZY,RavenPH(eds.), ,Vol.18 [M].
Sciences 166
, :595—613 St. Louis, Beijing: Missouri Botanical Garden Press, Science
任保青 陈之端
RenBQ( ), Chen ZD ( ), 2010. DNA barcoding Press,97—209
Chinese Bulletin of Botany 植物学报 45 etal
plantlife [J]. ( ), : YaoH,SongJY,LiuC .,2010. UseofITS2 regionastheuni鄄
PLoSONE 5
1—12 versalDNAbarcodeforplantsandanimals [J]. , :
RossHA,MuruganS,LiWLS,2008. Testingthereliabilityofgenet鄄 e13102
System鄄 etal Pedicularis
icmethodsofspeciesidentification viasimulation [J]. YuWB,HuangPH,LiDZ .,2010. Anewspeciesof
aticBiology 57
, :216—230 (Orobanchaceae) from the Hengduan Mountains, Southwest
Novon 20
StamatakisA,HooverP,RougemontJ,2008. Arapidbootstrapalgo鄄 China [J]. , :512—518
SystematicBiology 57 etal Pedic鄄
rithmfortheRAxMLwebservers [J]. , : YuWB,HuangPH,ReeRH .,2011. DNAbarcodingof
ularis
758—771 Linn. (Orobanchaceae):testingfourcandidateDNAbar鄄
钟补求 Pedicularis Journal of
TsoongPC( ),1955. Anewsystemforthegenus codinglociinalargeand hemiparasiticgenus [J].
ActaPhytotaxonomicaSinica 植物分类学报 4 SystematicsandEvolution 49
[J]. ( ), :71— , :425—437
etal
147 YuWB,HuangPH,WangH .,2013. Incongruencebetweennu鄄
钟补求 Pedicularis
TsoongPC( ),1963. Scrophulariaceae(Part II) [A]. In: clear and chloroplast DNA phylogenies in section
FloraReipublicaePopularis Sinicae 中国植物志 Cyathophora PLoS ONE
( ) [M]. Bei鄄 (Orobanchaceae) [J]. , doi: 10.
68
jing:SciencePress, :1—378 1371/journal.pone.0074828
etal 曾春霞 杨俊波 杨静 et al
TamuraK,DudleyJ,NeiM .,2007. MEGA4:Molecularevolu鄄 ZengCX( ), Yang JB ( ), Yang J ( ) .,
PlantDiversityand
tionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. 2012. AproposedframeworkforiFlora [J].
MolecularBiologyandEvolution 24 Resources 植物分类与资源学报 34
, :1596—1599 ( ), :555—561