Qualitative und quantitative Analytik von Pflanzen aus der Traditionellen Chinesischen Medizin am

306 Pages·2014·10.58 MB·German

Qualitative und quantitative Analytik von Pflanzen aus der
Traditionellen Chinesischen Medizin am Beispiel von
Artemisiae scopariae herba, Saposhnikoviae radix und
Siegesbeckiae herba

Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) der Fakultät für
Chemie und Pharmazie der Universität Regensburg

vorgelegt von
Rosmarie Barbara Scherübl
aus Regensburg
2014
Diese Arbeit widme ich meinen Eltern und meiner Schwester Christina
Diese Arbeit wurde im Zeitraum von Mai 2010 bis Dezember 2013 unter der Leitung von
Herrn Prof. Dr. Jörg Heilmann am Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie der Universität
Regensburg angefertigt

Das Promotionsgesuch wurde eingereicht am: 23.01.2014
Tag der mündlichen Prüfung: 07.03.2014

Prüfungsausschuss: Prof. Dr. Sigurd Elz (Vorsitzender)
Prof. Dr. Jörg Heilmann (Erstgutachter)
PD Dr. Detlef Manns (Zweitgutachter)
Prof. em. Dr. Gerhard Franz (dritter Prüfer)
Danksagung
Bei Prof. Dr. Jörg Heilmann und Prof. em. Dr. Gerhard Franz möchte ich mich für die
Möglichkeit an diesem interessanten Thema zu arbeiten, die fachliche Betreuung und stets
gute Kommunikation bedanken.
Darüber hinaus geht mein Dank an:
Das Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte für den Auftrag zur Erarbeitung
der DAB Monographien und die Finanzierung des Projekts, ins besondere an PD Dr. Detlef
Manns.
Gabi Brunner und Anne Grashuber für eure praktische Hilfe und freundliche
Zusammenarbeit. Ich hoffe, ich habe alles wieder zurückgebracht was ich in den 3,5 Jahren
ausgeliehen habe.
Prof. Dr. Fatih und Prof. Dr. Betül Demirci (Anadolu University, Eskişehir) für die GC-FID, GC-
MS Messung und Auswertung des ätherischen Öls, sowie bei Hale Gamze Duymus, H. Tuba
Kiyan, Dr. Fatih Göger für die besonders schöne Zeit in Eskişehir.
Annika Orland und Prof. Werner Knöss (Universität Bonn) für die genetische Untersuchung
der Artemisiae scopariae herba Proben und die freundliche Korrespondenz.
Dr. Heidi Heuberger (Bayerische Landesanstalt für Landwirtschaft, Institut für Pflanzenbau
und Pflanzenzüchtung) für die informativen Gespräche, den Wissensaustauch, zur Verfügung
stellen von Proben aus deutschem Anbau und der speziellen Ernte von Artemisia scoparia
Proben.
Dr. Birgit Kraus und Marcel für intensive Gespräche und gute Zusammenarbeit im PB1
Praktikum. Ich hoffe, die PB1-Hitliste wird weitergeführt.
Die Mitarbeiter der Zentralen Analytik, besonders Herr Kiermaier für die Aufnahme der MS-
und Herrn Dr. Shenderovich für die Aufnahme der NMR-Spektren.
Meine alte „Laborgang“ Kathi, Susanne und Sebastian für das gute Arbeitsklima, nette
Gespräche und die eine oder andere Labordisko ab 17 Uhr.
Inhaltsverzeichnis

Die Mädls (Anne, Beata, Kathi, Magda) für unsere Horrorfilmabende, die meist ohne Film
endeten (Stößchen).
Dr. Martin Rothenhöfer für viele „Arbeitsbesprechungen“ in der Primo Espressobar.
Dr. Tobias Brem für die Einarbeitung in das Thema.
Dr. Guido Jürgenliemk, Susann, Regina, Sarah, Matej, Daniel, Moni, Markus, Stefan, Edna,
Hieu und Ilya für die reibungslose Zusammenarbeit und unterhaltsame Kaffeerunden am
Lehrstuhl.
Unsere Sekretärinnen Frau Ohli und Frau Wolf für ihre Hilfe im Bürokratiedschungel.
Die Firma Camag für das zur Verfügung stellen der HPTLC-Geräte, sowie ins besonderen Dr.
Eike Reich und Dr. Anita Ankli für die fachliche Diskussionen und Unterstützung.
Die Firmen SinoPhytoMed, Lian Chinaherb und Plantasia (Erich Stöger) für das kostenlose zur
Verfügung stellen von Pflanzenmaterial und die Firma Phytolab für Referenzsubstanzen.
Meinen Masterstudent Andrew Beggs und meine Wahlpflichtstudenten Daniela Pemp,
Mario Eichenseer und Christina Baur.
Meine Freunde Angelika Falzboden und Tobias Hartl, sowie Amelie und Benni Kaufner, die
immer für pharmazeutische und rechtliche Fragen aller Art zu haben sind.
Ein besonderer Dank gilt meinen Eltern und meiner Schwester Christina für die
Unterstützung während des Studiums und meiner Doktorarbeit, obwohl es kein
„Synthesethema“ geworden ist.
Publikationsliste
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht:
Publikationen
R. Scherübl, D. Manns, J. Heilmann, G. Franz, Chromatographia 76 (2013) 1537–1543,
Comparison of HPLC versus HPTLC-Densitometry for the Quantification of Chromone
Glucosides in Saposhnikoviae divaricatae radix
Scherübl R, Orland A, Demirci B, Knöss W, Heuberger H, Başer K, Manns D, Franz G,
Heilmann J, in preparation 2014, Morphological, genetic and phytochemical analysis of
Artemisiae scopariae herba from different growing areas

Poster
R. Scheruebl, A. Orland, B. Demirci, W. Knoess, K.H. Başer, G. Franz, J. Heilmann, Planta Med
77 (2011), Comprehensive Analysis of Artemisiae scopariae herba from different growing
areas, 59th International Congress and Annual Meeting of the Society for Medicinal Plant
and Natural Product Research, Antalya
R. Scherübl, A. Beggs, G. Franz, J. Heilmann, D. Manns, Planta Med 78 (2012), Analysis of
chromone glycosides in saposhnikovia divaricata for the establishment of a monograph of
the german pharmacopoeia, 60th International Congress (Joint Meeting with ASP, AFERP,
PSE and SIF) and Annual Meeting of GA, New York
Masterarbeit
Andrew Gaeme Beggs, University of Aberdeen, Department of Chemistry, 2012
Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis
1 ALLGEMEINE EINLEITUNG ....................................................................................................................... 1
1.1 TRADITIONELLE CHINESISCHE MEDIZIN ............................................................................................................... 1
1.1.1 Geschichte und aktuelle Lage .......................................................................................................... 1
1.1.2 Philosophische Grundlagen der TCM ............................................................................................... 2
1.1.3 Wissenschaftlich dokumentierte Erfolge der TCM .......................................................................... 4
1.2 AKTUELLE PROBLEMATIK VON TCM-DROGEN DES EUROPÄISCHEN MARKTES ............................................................ 5
1.2.1 Identifizierung ................................................................................................................................. 5
1.2.2 Processing........................................................................................................................................ 6
1.2.3 Verunreinigung mit Schwermetallen, Pestiziden und synthetischen Arzneimitteln ........................ 7
1.2.4 Toxikologie ...................................................................................................................................... 8
1.3 RECHTLICHE EINORDNUNG VON TCM-DROGEN................................................................................................. 10
1.4 ANFORDERUNGEN DES ARZNEIBUCHES ............................................................................................................. 11
1.5 IMPLEMENTIERUNG VON TCM-DROGEN IN DAS DEUTSCHE UND EUROPÄISCHE ARZNEIBUCH ..................................... 12
2 ZIELSETZUNG ......................................................................................................................................... 17
3 MATERIAL UND METHODEN ................................................................................................................. 18
3.1 VERWENDETE CHEMIKALIEN .......................................................................................................................... 18
3.2 VERWENDETE REFERENZSUBSTANZEN .............................................................................................................. 19
3.3 VERWENDETE MATERIALIEN .......................................................................................................................... 19
3.4 VERWENDETES DROGENMATERIAL .................................................................................................................. 20
3.4.1 Artemisiae scopariae herba ........................................................................................................... 20
3.4.2 Saposhnikoviae radix ..................................................................................................................... 21
3.4.3 Siegesbeckiae herba ...................................................................................................................... 22
3.5 VERWENDETE GERÄTE .................................................................................................................................. 23
3.6 VERWENDETE METHODEN ............................................................................................................................. 24
3.6.1 Makroskopische Beschreibung ...................................................................................................... 24
3.6.2 Mikroskopische Beschreibung ....................................................................................................... 24
3.6.3 Dünnschichtchromatographie (DC und HPTLC) ............................................................................. 25
3.6.3.1 Durchführung: ..................................................................................................................................... 25
3.6.3.2 Derivatisierungsreagenzien ................................................................................................................. 25
3.6.4 Reinheitsbestimmungen ................................................................................................................ 26
3.6.4.1 Bestimmung des Trocknungsverlustes ................................................................................................ 26
3.6.4.2 Bestimmung der Asche ........................................................................................................................ 27
3.6.4.3 Bestimmung der Salzsäureunlöslichen Asche...................................................................................... 27
3.6.5 Gehaltsbestimmungen .................................................................................................................. 27
3.6.5.1 Gehaltsbestimmung mit HPLC ............................................................................................................. 27
Inhaltsverzeichnis
3.6.5.2 Gehaltsbestimmung mit HPTLC/Densitometrie .................................................................................. 27
3.6.6 Genetische Untersuchung der verschiedenen Artemisia spec. Herkünfte .................................... 28
3.6.6.1 DNA Isolierung und Amplifizierung ..................................................................................................... 28
3.6.6.2 Probenaufarbeitung und Sequenzierung............................................................................................. 28
3.6.6.3 Auswertung ......................................................................................................................................... 29
3.6.7 Gaschromatographische Untersuchungen .................................................................................... 29
3.6.7.1 Gehaltsbestimmung des Ätherischen Öls ............................................................................................ 29
3.6.7.2 GC-FID Untersuchung .......................................................................................................................... 29
3.6.7.3 GC-MS Identifizierung ......................................................................................................................... 30
3.6.8 TLC-MS Kopplung .......................................................................................................................... 31
3.6.9 Isolierung und Identifizierung des charakteristischen Flavonoids aus Artemisiae scopariae herba
aus deutschem Anbau ................................................................................................................................. 32
3.6.9.1 Extraktherstellung ............................................................................................................................... 32
3.6.9.2 Isolierung ............................................................................................................................................. 32
3.6.9.3 NMR-Spektroskopie ............................................................................................................................. 33
3.6.9.4 Massenspektrometrie ......................................................................................................................... 33
3.6.10 Validierung der Prüfung auf Identität mit Hilfe der Dünnschichtchromatographie ................. 33
3.6.10.1 Methodenbeschreibung ...................................................................................................................... 33
3.6.10.2 Validierung .......................................................................................................................................... 35
3.6.11 Validierung von Gehaltsbestimmungen mit Hilfe der Flüssigkeitschromatographie ................ 39
3.6.11.1 Methodenbeschreibung ...................................................................................................................... 39
3.6.11.2 Validierung .......................................................................................................................................... 40
3.6.12 Validierung der Gehaltsbestimmung mit Hilfe der
Dünnschichtchromatographie/Densitometrie ............................................................................................. 52
3.6.12.1 Methodenbeschreibung ...................................................................................................................... 52
3.6.12.2 Validierung .......................................................................................................................................... 54
4 HAARIGES BESENBEIFUßKRAUT ............................................................................................................ 61
4.1 EINLEITUNG ................................................................................................................................................ 61
4.2 METHODEN ................................................................................................................................................ 65
4.2.1 Dünnschichtchromatographie ....................................................................................................... 65
4.2.2 Flüssigkeitschromatographie ........................................................................................................ 69
4.3 MAKROSKOPISCHE BESCHREIBUNG .................................................................................................................. 71
4.4 MIKROSKOPISCHE BESCHREIBUNG ................................................................................................................... 73
4.5 DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG ..................................................................................... 74
4.5.1 Untersuchung verschiedener Fingerprints der vorhandenen Inhaltsstoffe ................................... 74
4.5.1.1 Flavonoidglykoside .............................................................................................................................. 74
4.5.1.2 Sesquiterpenlactone ............................................................................................................................ 75
4.5.1.3 Ätherisches Öl ..................................................................................................................................... 76
4.5.2 Evaluation der neuen Monographie ChP 2010 .............................................................................. 77
4.5.2.1 Mianyinchen (Frühjahrsdroge) ............................................................................................................ 77
Inhaltsverzeichnis

4.5.2.2 Huayinchen- Yinchenhao (Herbstdroge) ............................................................................................. 78
4.5.3 Chlorogensäure als analytischer Marker ....................................................................................... 79
4.5.3.1 Fließmittelsysteme in der Ph. Eur ........................................................................................................ 79
4.5.3.2 Validierung .......................................................................................................................................... 81
4.5.4 Chromatographische Unterscheidung (Fingerprint) der verschiedenen Erntezeitpunkte von
Artemisiae scopariae herba ......................................................................................................................... 89
4.6 REINHEITSUNTERSUCHUNGEN ........................................................................................................................ 91
4.6.1 Trocknungsverlust ......................................................................................................................... 91
4.6.2 Asche ............................................................................................................................................. 92
4.6.3 Salzsäureunlösliche Asche ............................................................................................................. 94
4.7 GEHALTSBESTIMMUNG MITTELS HPLC ............................................................................................................. 96
4.7.1 Chlorogensäure: Evaluation von Gehaltsbestimmungen nach ChP und Ph. Eur ........................... 96
4.7.2 Validierung .................................................................................................................................... 96
4.7.2.1 Stabilität des Extraktes ........................................................................................................................ 97
4.7.2.2 Spezifität .............................................................................................................................................. 97
4.7.2.3 Kalibrierung ......................................................................................................................................... 99
4.7.2.4 Wiederholpräzision ........................................................................................................................... 102
4.7.2.5 Laborpräzision ................................................................................................................................... 103
4.7.2.6 Probenauswertung und Prognoseintervall ........................................................................................ 104
4.7.2.7 Robustheit ......................................................................................................................................... 104
4.7.2.8 Wiederfindung ................................................................................................................................... 105
4.7.2.9 Nachweisgrenze ................................................................................................................................ 105
4.7.2.10 Quantifizierungsgrenze ..................................................................................................................... 105
4.8 CHROMATOGRAPHISCHE UNTERSCHEIDUNG VON ARTEMISIA CAPILLARIS THUNB. UND ARTEMISIA SCOPARIA WALDST. ET KIT.
105
4.8.1 HPTLC .......................................................................................................................................... 106
4.8.2 HPLC ............................................................................................................................................ 106
4.9 ANALYSE DES GENETISCHEN FINGERPRINTS VON ARTEMISIAE SCOPARIAE HERBA VERSCHIEDENER HERKÜNFTE .............. 108
4.10 GASCHROMATOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNG DES ÄTHERISCHEN ÖLS VON ARTEMISIAE SCOPARIAE HERBA ............ 112
4.10.1 Gehaltsbestimmung des ätherischen Öls ............................................................................... 112
4.10.2 GC-FID Untersuchung ............................................................................................................. 113
4.10.3 GC-MS Identifizierung der Bestandteile des ätherischen Öls .................................................. 115
4.11 ISOLIERUNG UND IDENTIFIZIERUNG EINES CHARAKTERISTISCHEN FLAVONOIDS AUS ARTEMISIAE SCOPARIAE HERBA AUS
BAYERISCHEM ANBAU .......................................................................................................................................... 122
4.12 DISKUSSION DER ERGEBNISSE-HAARIGES BESENBEIFUßKRAUT ........................................................................ 125
5 SAPOSHNIKOVIAWURZEL .................................................................................................................... 131
5.1 EINLEITUNG .............................................................................................................................................. 131
5.2 METHODEN .............................................................................................................................................. 135
5.2.1 Dünnschichtchromatographie ..................................................................................................... 135
Inhaltsverzeichnis
5.2.2 Flüssigkeitschromatographie ...................................................................................................... 137
5.3 MAKROSKOPISCHE BESCHREIBUNG ................................................................................................................ 138
5.4 MIKROSKOPISCHE BESCHREIBUNG ................................................................................................................. 139
5.5 DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAPHISCHE UNTERSUCHUNGEN ............................................................................... 140
5.5.1 Untersuchung verschiedener Fingerprints ................................................................................... 140
5.5.1.1 Ätherisches Öl: Nachweis von Panaxynol .......................................................................................... 140
5.5.1.2 ChP 2010: Chromonglucoside als Markersubstanzen........................................................................ 141
5.5.1.3 Fließmitteloptimierung der DC-Trennung ......................................................................................... 141
5.5.1.4 Validierung ........................................................................................................................................ 142
5.6 REINHEITSUNTERSUCHUNGEN ...................................................................................................................... 151
5.6.1 Trocknungsverlust ....................................................................................................................... 151
5.6.2 Asche ........................................................................................................................................... 152
5.6.3 Salzsäureunlösliche Asche ........................................................................................................... 153
5.7 GEHALTSBESTIMMUNGEN ............................................................................................................................ 154
5.7.1 HPLC ............................................................................................................................................ 154
5.7.1.1 Optimierung ...................................................................................................................................... 154
5.7.1.2 Validierung ........................................................................................................................................ 155
5.7.1.3 Stabilität des Extraktes ...................................................................................................................... 156
5.7.1.4 Spezifität ............................................................................................................................................ 156
5.7.1.5 Kalibrierung ....................................................................................................................................... 156
5.7.1.6 Wiederholpräzision ........................................................................................................................... 162
5.7.1.7 Laborpräzision ................................................................................................................................... 163
5.7.1.8 Probenauswertung und Prognoseintervall ........................................................................................ 163
5.7.1.9 Robustheit ......................................................................................................................................... 164
5.7.1.10 Wiederfindung ................................................................................................................................... 165
5.7.1.11 Nachweisgrenze ................................................................................................................................ 165
5.7.1.12 Quantifizierungsgrenze ..................................................................................................................... 165
5.7.2 HPTLC/Densitometrie .................................................................................................................. 166
5.7.2.1 Optimierung der HPTLC Methode ..................................................................................................... 166
5.7.2.2 Validierung ........................................................................................................................................ 167
5.7.2.3 Spezifität ............................................................................................................................................ 169
5.7.2.4 Kalibrierung ....................................................................................................................................... 170
5.7.2.5 Wiederholpräzision ........................................................................................................................... 175
5.7.2.6 Laborpräzision ................................................................................................................................... 176
5.7.2.7 Probenauswertung und Prognoseintervall ........................................................................................ 176
5.7.2.8 Robustheit ......................................................................................................................................... 177
5.7.2.9 Wiederfindung ................................................................................................................................... 178
5.7.2.10 Nachweisgrenze ................................................................................................................................ 178
5.7.2.11 Quantifizierungsgrenze ..................................................................................................................... 178
5.8 UNTERSUCHUNGEN DES ÄTHERISCHEN ÖLS ..................................................................................................... 179
5.8.1 Gehaltsbestimmung des ätherischen Öls .................................................................................... 179
5.8.2 GC-FID Untersuchung .................................................................................................................. 179