Proteomic approach to flatfish aquaculture, study of the reproductive

276 Pages·2007·7.5 MB·English

DEPARTMENT of BIOCHEMISTRY and MOLECULAR BIOLOGY

Doctoral Program in Biochemistry and Molecular Biology

"PROTEOMIC APPROACH TO FLATFISH AQUACULTURE.
STUDY OF THE REPRODUCTIVE BIOLOGY OF SOLEA
SENEGALENSIS."

IGNASI FORNÉ i FERRER

MAY, 2007
DEPARTMENT of BIOCHEMISTRY and MOLECULAR BIOLOGY

Doctoral Program in Biochemistry and Molecular Biology

Doctoral thesis presented by

IGNASI FORNÉ FERRER

to obtain the

Ph.D. IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY

This work has been carried out in the Proteomics Laboratory CSIC/UAB and in Oryzon
Genomics under the supervision of Dr. Joaquín Abian and Dr. Joan Cerdà.

Ph.D. candidate Ph.D. Supervisor

IGNASI FORNÉ i FERRER Dr. JOAQUIN ABIAN MOÑUX
CSIC Research Scientist

Department Tutor Ph.D. Supervisor

Dr. JAUME FARRÉS VICÉN Dr. JOAN CERDÀ LUQUE
UAB Biochemistry and Molecular IRTA Research Scientist
Biology Professor

Barcelona, May 2007
Veles e vents han mos desigs complir,
faent camins dubtosos per la mar.
Mestre i ponent contra d'ells veig armar;
xaloc, llevant, los deuen subvenir
ab llurs amics lo grec e lo migjorn,
fent humils precs al vent tramuntanal
que en son bufar los sia parcial
e que tots cinc complesquen mon retorn.

Bullirà el mar com la cassola en forn,
mudant color e l'estat natural,
e mostrarà voler tota res mal
que sobre si atur un punt al jorn.
Grans e pocs peixs a recors correran
e cercaran amagatalls secrets:
fugint al mar, on són nodrits e fets,
per gran remei en terra eixiran.

Ausiàs March (Veles e vents)

No importa el problema, no importa la solución,
me quedo con lo poco que queda, entero en el corazón.
Me gustan los problemas, no existe otra explicación.
Esta sí es una dulce condena, una dulce rendición.

Andrés Calamaro (Dulce condena)
Agraïments

En primer lloc agrair al Dr. Carlos Buesa i al Dr. Joaquin Abián la possibilitat de realitzar
el treball de tesi doctoral conjuntament al Laboratori de Proteómica CSIC-UAB i a
Oryzon Genomics, per la oportunitat que suposa combinar el dia a dia del creixement
d’una empresa biotecnològica i la convivència en un entorn acadèmic de referència en
espectrometria de masses i proteòmica.

Al Dr. Joaquín Abián (de nou) i al Dr. Joan Cerdà per la direcció de la tesis i per la seva
implicació personal, dedicació, suport i esforç en tot moment.

A tota la gent que ha participat en el disseny i realització del projecte Pleurogene, en
especial al Dr. Joan Cerdà per la coordinació general, i a la Dra. Tamara Maes per la
direcció científica des d’Oryzon Genomics.

Al Dr. Jaume Farrés per la tutoria d’aquest treball, per la seva col·laboració i
disponibilitat en tot moment.

A tota la gent que he conegut a Oryzon durant aquests gairebé quatre anys,
especialment a la Maite del Hierro, per ser una persona i companya de laboratori
excel·lent, per la seva responsabilitat i el seu humor (kapasao-i-yokezé!!); al Joaquin
(darrer cop) per la seves dosis de moral, experiència i temps quan les coses anaven
maldades; al Jaume Mercadé per la col·laboració en el darrer capítol i per les converses
sobre cóm canviar el món; al Dr. Toni Espinosa per la seva col·laboració en el primer
capítol i per estar sempre a punt per fer “unas risas”; a la Dra. Elisabet Rosell per la
seva mà esquerra i l’optimisme que transmet; al Xavi Calvo pel seu ajut en l’apartat de
microarrays i per cuidar-me la cadira durant les meves llargues absències; al Jaume, el
Jordi, l’Elena, el Roger i el Ricard per compartir l’experiència de fer una tesi dins de la
empresa (ànims, que hi ha una llum al final!!); i a tots els que heu participat en les
tertúlies després de dinar, en una sessió de youtube o senzillament amb un somriure en
un mal dia.

Als companys del Laboratori de Proteómica CSIC-UAB que ja hi eren quan vaig arribar,
en especial a la Dra. Montse Carrascal pel temps i les energies dedicades (si hay que
hacerlo, se hace…), i a la Dra. Carme Quero pels primers temps al lab; als que han
passat deixant petjada, en especial al Miguel Trigo per la convivència al “zulo”, i als que
Agraïments
us quedeu i encara m’acolliu de bon grat quan vinc de visita: Marina, David, Rebeca,
Vanesa i Cristina.

Al Dr. Francesc Canals per facilitar-me l’ús del Laboratori de Proteómica de Vall
d’Hebrón, a la Núria per les classes de Decyder i, junt amb la Cristina, per fer les hores
de Decyder/Typhoon molt més amenes.

Al Dr. Jaume Planas per la cessió dels resultats de microarrays del segon capítol.

Al Miquel Daura de “Common Sense” pel disseny de la portada i del CD.

A tots els que m’heu ajudat a créixer dins del món de la investigació en els diferents
centres on he tingut la sort de treballar, en especial al Dr. Cándido Juarez del
Departament d’Immunologia de l’Hospital de Sant Pau, per les primeres passes en el
món de la proteómica.

A tots els amics que heu col·laborat desinteressadament en el meu suport psicològic
durant aquests anys, a la Cristina i al Miquel per la Vila del Pingüí (i per tantes altres
coses…), a la Sónia i al Pedro per Madrids, Lisboas, París i Basileas, i a tots quatre
per uns quants Munichs; al Jordi i al Natxo per estar sempre a punt; a la colla de l’ESM
(ja sabeu qui sou…), per tant anys d’històries.

Al meu germà Oriol per tots els moments junts a casa, pistes, pavellons, gimnasos, bars
i festes majors: per ser com és.

Als meus pares, Anna i Ernest, per educar-me i fer-me créixer amb generositat,
convicció i amor, donant-me totes les oportunitats i les eines que m’han permès arribar
fins aquí.

A la meva dona Alexandra, per tenir les mides perfectes de “Cherry Blossom Girl”, de
“Limón y Sal” i d’“Alegria”; i a la meva filla Paula pels moments únics que he viscut i
espero viure. A totes dues, “I just want say “Hi” to the ones I love”.
Table of Contents
TOC
Abbreviations

Introduction…………………………………………………………………………………………… 1

I.1 Flatfish species…………………………………………………………………………… 1

I.1.1 Flatfish aquaculture………………………………………………………. 2
I.1.2 Teleost spermatogenesis………………………………………………… 3
I.1.3 Special features of Solea senegalensis spermatogenesis………….. 9
I.1.4 Steroid role during spermatogenesis and spermiation in teleosts…… 12
I.1.5 Hormone treatment approaches on flatfish spermatogenesis……….. 16

I.2 Proteomics………………………………………………………………………………… 17

I.2.1 Mass-spectrometry based proteomics…………………………………. 17
I.2.2 Differential expression analysis in proteomics………………………… 21
I.2.3 Annotation of DNA databases using peptidic ESTs…………………. 26

I.3 Applying proteomics to Solea senegalensis………………………………….............. 28

Objectives…………………………………………………………………………………………….. 29
About the Pleurogene Project: understanding the frame of this PhD work…………… 29

Chapter 1 De novo peptide sequencing of S. senegalensis larva and testis proteome using
two-dimensional liquid chromatography coupled to tandem mass
spectrometry…………………………………………………………………………….. 33

1.1 Materials and methods…………………………………………………………………. 35
1.1.1 Sample processing ………………………………………………………. 35
1.1.2 Two-dimensional LC MS-MS……………………………………………. 35
1.1.3 Data processing and refinement………………………………………... 39
1.2 Results…………………………………………………………………………………… 44
1.2.1 Two-dimensional LC, de novo sequencing and BLAST comparison.. 44
1.2.2 Methodological analysis: peptide charge distribution among 2-D LC.. 45
1.2.3 Biological analysis: GO charts………………………………………….. 45
1.3 Discussion………………………………………………………………………………. 52
1.3.1 Methodological analysis…………………………………………………. 52
1.3.2 Biological analysis………………………………………………………... 55
TOC
Chapter 2 Proteomic analysis of differentially expressed proteins in wild and cultured Solea
senegalensis during the spermatogenesis process…………………………………. 59

2.1 Materials and methods………………………………………………………………….. 60
2.1.1 Biological samples………………………………………………………… 60
2.1.2 Histological analysis………………………………………………………. 60
2.1.3 Protein extraction………………………………………………………….. 61
2.1.4 Two-dimensional electrophoresis……………………………………….. 62
2.1.5 Differential expression analysis and clustering………………………… 63
2.1.6 Determination of gel variation: Mr and pI variation……………………. 64
2.1.7 Determination of gel variation: Normalized volume variation………… 64
2.1.8 Protein identification………………………………………………………. 65
2.1.9 Bioinformatic analysis of MS/MS spectra………………………………. 66
2.1.10 Comparing sequenced peptides and identified proteins with S.
senegalensis ESTs……………………………………………………….. 67
2.2 Results……………………………………………………………………………………. 69
2.2.1 Histological analysis………………………………………………………. 69
2.2.2 Two-dimensional electrophoresis……………………………………….. 69
2.2.3 Differential expression analysis and clustering………………………… 70
2.2.4 Mass spectrometry and bioinformatic analysis………………………… 88
2.2.5 Comparison of sequenced peptides and identified proteins with S.
senegalensis ESTs……………………………………………………….. 97
2.3 Discussion……………………………………………………………………………….. 100
2.3.1 Gel Reproducibility………………………………………………………... 102
2.3.2 Expression analysis………………………………………………………. 103
2.3.3 Protein identification……………………………………………………… 106
2.3.4 Use of genomic ESTs for annotation cross-validation………………… 108
2.3.5 Biological implications of variations in testis proteome……………….. 112
2.3.6 Relationships between 2-D protein gel analysis and RNA microarray
data in F0 ………………………………………………………………….. 119

Chapter 3 Effect of hormone treatments into testis proteome in cultured Solea
senegalensis. Study by 2-D DIGE………………………………………………… 121

3.1 Materials and methods………………………………………………………………….. 122
3.1.1 Fish hormone treatments………………………………………………… 122
3.1.2 Biological samples………………………………………………………… 122
3.1.3 Histological analysis………………………………………………………. 123
3.1.4 Determination of sperm density and motility…………………………… 123
TOC
3.1.5 Protein extraction………………………………………………………… 124
3.1.6 Two-dimensional DIGE…………………………………………………. 124
3.1.7 Differential expression analysis and clustering………………………. 127
3.1.8 Protein identification…………………………………………………….. 128
3.1.9 Microarray analysis of testis transcriptome in hormone-treated fish… 128
3.2 Results…………………………………………………………………………………… 130
3.2.1 Effect of hormone treatments on spermatogenesis…………………… 130
3.2.2 Determination of GSI, sperm density and motility……………………... 131
3.2.3 Two-dimensional DIGE: self-to-self analysis…………………………… 131
3.2.4 Two-dimensional DIGE: evaluation experiment……………………….. 134
3.2.5 Two-dimensional DIGE and clustering: hormone treatment analysis.. 142
3.2.6 Mass spectrometry and Bioinformatic analysis………………………… 154
3.2.7 Comparison of sequenced peptides and identified proteins with S.
senegalensis ESTs……………………………………………………….. 170
3.2.8 Relationships between 2-D protein gel analysis and mRNA
microarray data of testis from fish treated with hormones……………. 170
3.3 Discussion………………………………………………………………………………... 173
3.3.1 Effect of the hormone treatments on sperm and testis physiological
features…………………………………………………………………….. 173
3.3.2 Evaluating DIGE for expression changes in testis proteome………… 174
3.3.3 DIGE of testis proteome after hormone treatment…………………….. 175
3.3.4 Combining Mr, pI and sequencing information to validate protein
identification……………………………………………………………….. 175
3.3.5 Biological implications…………………………………………………….. 181
3.3.6 Complementing proteomic data with transcriptomic analysis………… 185

Chapter 4 Database for 2-D LC MS/MS and 2-D gel-experiments of S. senegalensis…. 189

4.1 Materials and methods………………………………………………………………….. 190
4.1.1 Biological data…………………………………………………………….. 190
4.1.2 Protein module database organization…………………………………. 190
4.1.3 Application architecture and implementation…………………………... 192
4.2 Results……………………………………………………………………………………. 194
4.2.1 Pleuromold interfaces…………………………………………………….. 194
4.2.2 Pleuromold queries……………………………………………………….. 195
4.3 Discussion………………………………………………………………………………... 202

Conclusions…………………………………………………………………………………………... 203
TOC
References…………………………………………………………………………………………….. 205

Annexes……………………………………………………………………………………………….. 219
Annex I………………………………………………………………………………………… 219
Annex I.1 GO charts comparison between S. senegalensis and O.
mykiss ……………………………………………………............ 219
Annex I.2 GO charts of the proteins characterized by 2-D LC in S.
senegalensis……………………………………………………. 221
Annex I.3 Peptide charge distribution for the S. senegalensis
sequenced peptides…………………………………………….. 223
Annex II……………………………………………………………………………………….. 224
Annex II.1 Alignment of sequenced peptides over the identified proteins
for spots in chapter 2……………………………………………. 224
Annex II.2 Variation between experimental and theoretical Mr and pI
values for spots in chapter 2……………………………………. 231
Annex II.3 Variations between experimental and theoretical pI values
for spots in chapter 2……………………………………………. 233
Annex II.4 Variations between experimental and theoretical Mr values
for spots in chapter 2……………………………………………. 234
Annex III………………………………………………………………………………………. 235
Annex III.1 Effect of GnRHa with or without OA on GSI, milt production
and sperm motility in the Senegal sole………………………... 235
Annex III.2 Alignment of sequenced peptides over the identified proteins
for spots in chapter 3……………………………………………. 236
Annex III.3 Variation between experimental and theoretical Mr and pI
values for spots in chapter 3……………………………………. 245
Annex III.4 Variations between experimental and theoretical pI values
for spots in chapter 3……………………………………………. 247
Annex III.5 Variations between experimental and theoretical Mr values
for spots in chapter 3……………………………………………. 248
Annex III.6 Detailed results for the transcriptomic analysis performed
using the testis tissue from F1 S. senegalensis……………… 249

Compact Disc Detailed file with the 1298 sequences from 2-D LC MS/MS
analysis
PDF files containing Index, Introduction, Objectives,
Chapters 1-4, Conclusions and Annexes I-III