Proteome analysis of silkworm (Bombyx mori) midgut proteins related to BmNPV infection resistance or susceptibility

2008·0.49 MB·

by  Xiao-Yong, Liu

昆 虫 学 报 !"#$%&#’(’)’*+"$,+&+"$，!"#$%&’’(，)（* +）：++,-++( .//0’+)+12&32
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家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的
相关蛋白分析
刘晓勇，陈克平!，姚 勤，李 军，蔡克亚
（江苏大学生命科学研究院，江苏镇江 &*&’*,）
摘要：家蚕中肠上皮是病毒经口侵入遇到的第一个组织。昆虫幼虫抵御杆状病毒的感染，可通过选择性的使感染
的中肠上皮细胞发生调亡并在释放病毒粒子进入血淋巴之前使感染的细胞从中肠脱落。为研究家蚕抗核型多角
体病毒（-’(./0(’1+ B>J%H@"@%ALHI#@Q$#>F，6<0RS）病的机制，通过对6<0RS高度抗性和高度敏感性的家蚕品系杂交
和回交构建了近等基因系。本文对家蚕高抗，敏感及近等基因系)龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱进行了二维电
泳（KT@1I$<HBF$@B=% CH% H%HJK#@"L@#HF$F，&1:;）分析，并利用基质辅助激光解吸电离飞行时间（<=K#$?1=FF$FKHI %=FH#
IHF@#"K$@BU$@B$V=K$@B1K$<H@MM%$CLK，W!X:.1NYZ）质谱对差异蛋白进行鉴定。结果发现了)个差异表达的蛋白。推测这
些蛋白可能与家蚕中肠对6<0RS的抗性或感性有关。
关键词：家蚕；中肠；家蚕核型多角体病毒；近等基因系；二维电泳；质谱
中图分类号：[32)\( 文献标识码：! 文章编号：’+)+12&3（2 &’’(）’+1’++,1’2
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6<0RS #HF$FK=BJH KL#@>CL L$CL%A #HF$FK=BK =BI L$CL%A F>FJH"K$a%H "=#HBK FK#=$BFG .B KL$F FK>IA，"#@KH@<H <="F
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家 蚕 抗 核 型 多 角 体 病 毒（ -’(./0 (’1+ &’’2），对于昆虫抗病毒感染机制的研究很少
B>J%H@"@%ALHI#@Q$#>F，6<0RS）病给世界养蚕国家蚕 （R@"L=< 2# $)G，&’’+）。近几年有关抗 0RS活性物
茧生产造成巨大的损失。但在过去的几十年中，对 质有些报道，主要是从家蚕幼虫的中肠肠液中分离
6<0RS的研究主要集中在鉴定，分类，感染途径，生 鉴定了几种蛋白，如红色荧光蛋白（#HI M%>@#HFJHBK
物反应器和杀虫剂的研究（S$=%=#I 2# $)G，*33)； "#@KH$BF，PZRF）（‘=A=FL$A= =BI 0$FL$I=，*32(），脂肪
6%$FF=#IG，*332；P=L<=B 2# $)G，&’’+；9HL%H 2# $)G， 酶（%$"=FH）（R@BB>QH% 2# $)G，&’’,），丝氨酸蛋白酶
基金项目：国家重点基础研究发展计划“34,”项目（&’’)56*&*’’’）；国家 (2, 计划（&’’(!!*’7*+)）；江苏省高校自然科学基金项目
（’289:*(’’+&）
作者简介：刘晓勇，男，*342年3月生，江西都昌人，博士研究生，助理研究员，主要从事家蚕分子生物学研究，;1<=$%：%$>?$=@A@BCD>EFGHI>GJB
!通讯作者 !>KL@#M@#J@##HF"@BIHBJH，NH%G：’)**1((43*3&,；;1<=$%：O"JLHBD>EFGHI>GJB
收稿日期 PHJH$QHI：&’’41*’1*4；接受日期 !JJH"KHI：&’’(1’+1*)
111 昆虫学报 %&"#’(")*)$)+,&#-,(,&# K?卷
（!"#$%" &#’(")!"!）（*)+),)-) !" #$.，/001）以 及 暗的光周期和桑叶饲养至K龄起蚕。分别收集K条
*2345氧化还原酶（6"7’( !" #$.，/008）。在鳞翅目 K龄起蚕的中肠组织。0N/ D中肠组织用液氮研磨，
昆虫幼虫血淋巴中有种酚氧化酶（&9"%’7’:$;)!"）可 用冷的含 ?0S的丙酮和 K <<’7QG 3TT 沉淀蛋白。
能可以作为一种持续的体液抗病毒免疫反应起作用 置于U/0V / 9，BK 000OD离心B0 <$%。沉淀用含K
（4’&9)< !" #$.，/001）。 <<’7QG 3TT，? <<’7QG 4W6R和 / <<’7QG X3T2的丙
家蚕抗 =<*4>病是一种重要的经济性状（陈克 酮洗两次，最后用真空冷冻干燥。粉末状蛋白样品
平等，?@@A），我们实验室有对 =<*4>高度抗性的家 用 0NK <G 含 8 <’7QG J#")，/ <’7QG (9$’J#")，1S
蚕品系*=和高度敏感的家蚕品系B0A，并由此构建 H5246，0N/S =$’CGY(" &5 B Z ?0，? <<’7QG 4W6R，/
了一个对 =<*4> 高度抗性的近等基因系（%")#C <<’7QG X3T2和AK<<’7QG 3TT，&5 PNK的裂解液溶
$!’D"%$E 7$%"，*FG）。所谓的近等基因系在许多物种 解。溶液超声波处理/ <$%，BK 000O D离心 B0 <$%。
中都是通过基因渗透的方式得以构建，这种基因渗 蛋白浓度用 =#);[’#（; ?@8A）法测定。
透是通过重复的将带有目标基因的供体和不带此基 !"% 二维凝胶电泳
因的循环母本进行回交。每次回交后，子代通过是 用/1 E<（&5 BU?0）F4\胶条在/0V条件下按
否拥有目标基因特性而加以选择。由此就会产生出 照操作规程（4]^TX2* &7J! 3’;"E) H"77，=$’C]);）进
带有供体目标基因的一个小片段，但其他遗传背景 行等电聚焦。每根胶条的上样量为/ <D，每个样品
与轮回杂交的母本高度一致的子代品系。根据这个 重复两次。上样后胶条在 K0 >水化 ?B 9。编制一
原理，我们构建了第 @ 代近等基因系 =H ，即对 个电压梯度方式等电聚焦，在/K0 >，K00 >，?000 >，
@
=<*4>高度抗性但基因遗传背景却与高度感性的 1000 > 和 ?0 000 > 电压下各聚焦 ? 9，然后在
B0A一致。 ?0 000 >下维持至 P0 +> O 9。聚焦好的胶条在含
我们利用上述近等基因系已经发现了几个与家 /S3TT，A <’7QG J#")，0NB8K <’7QG T#$!C5H7，/0S
蚕 *4> 抗性相关的基因和分子标记（IJ !" #$.， D7YE"#’7，/S 636和痕量溴酚兰的平衡缓冲液中平衡
/00K；L)’ !" #$.，/00K）。为研究抗性的遗传特性和 ?K <$%，然后用/NKS碘乙酰胺取代3TT的平衡缓冲
家蚕抗=<*4>的抗性机理，在本研究中，我们分析 液处理 ?K <$%。处理后的胶条转移至 ?/S的 636C
了高抗 *=、高感 B0A 及其近等基因系 =H B 个家蚕 42\X胶上，每根胶K _电泳10 <$%，?K _电泳至溴
@
品系的K龄起蚕中肠组织的蛋白质表达谱，并利用 酚兰接近胶的底部。胶取下后用考马斯亮兰染色。
质谱技术分析鉴定了差异蛋白，期望找到与抗性或 染色后的胶用高精度的扫描仪（6E)%W)+"# @800IG，
感性相关的中肠组织蛋白。 W$E#’("+）扫描，用 43‘J"!(（=$’C]);）软件进行图像
分析。
! 材料和方法 !"& 胶内消化
胶内蛋白点用取点器挖取。含蛋白的胶点的脱
!"! 家蚕亲本 色、还原、烷化和胰酶消化参照文献处理（W$#,) !"
本实验用到高度抗性家蚕品系*=（G3（K0）M/NK #$.，/000）。所用溶液试剂均购自 6$D<)。蛋白胶点
O?0P病毒QK龄起蚕幼虫）和高度感性家蚕品系 B0A 加入纯水，碳酸氢铵，K0S乙腈和 ?00S乙腈振荡进
（G3（K0）MBN1O?0K 病毒QK龄起蚕幼虫）两种亲本。 行脱色和清洗。用 3TT还原和碘乙酰胺处理后，胶
!"# 构建近等基因系 点用新鲜配制的 /0 DQ<G 胰酶（4#’<"D)）溶液（10
!
近等基因系依据该抗性的遗传规律构建（陈克平 <<’7QG碳酸氢铵Q?0S乙腈）浸润，在 B8V消化过
等，/00?）。亲本*=作为供体与作为轮回亲本的B0A 夜。胶点用KS甲酸溶液（纯水Q乙腈，?a?）提取肽
杂交产生子代幼虫，K龄起蚕添加病毒（KO?0/ 病毒Q 段。
幼虫），选择雄性抗性个体与雌性的轮回亲本B0A回 !"’ 质谱分析
交，产生的子代幼虫再添加病毒筛选，由此不停的回 每个胶点的肽段混合物（? G）与同体积的 ?0
!
交至第@代（=H@），选择抗性子代后经过两代自交。 <DQ<G基质"CEY)%’C1C9Y;#’:YE$%%)<$E )E$;（6$D<)）混
!"$ 蛋白样品制备 合，基质先用K0S乙腈含0N?S三氟乙酸溶液配制。
B个品系的家蚕———*=、B0A 及近等基因系子 点样至WT4 2%E9’# H9$&（=#J+"#）板上，用基质辅助
二代（=H CR ），同时在相同条件下，?/ 9光照Q?/ 9黑 激光解吸粒子C飞行时间电离质谱（=#J+"#，b7(#)[7":
@ /
(期 刘晓勇等：家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析 ((@
!"#$!"#）鉴定，得到分子量% &&&’( &&& )*范围内的 点，大部分蛋白集中于>?@’A之间区域。B个样品
质谱图。用标准肽段作为外标，基质和胰酶自切肽 之间不同的蛋白点所在区域用方框指示，计有5，:，
段的峰值作为质谱校正的内参。 6，)，< @个，不同表达的蛋白点分别由 %’@ 标示，
!"# 蛋白鉴定 这些蛋白在不同品系中表达的差异在重复实验中得
利用质谱得到的肽质量指纹图谱进行蛋白鉴 到了一致的结果，其他的差异蛋白被排除。其中 %
定，用+*!,-. /0-1201 3!4授权的+5/678软件比对一 和C为抗性品系9:和抗性近等基因系 :6 表达或
D
个最近96:; 版本蛋白数据库，另外还对我们实验 表达量远高于在感性品种的表达；B，(，@ 为感性品
室收集构建的家蚕蛋白数据库和家蚕 </8 翻译数 种B&E中表达，而在抗性品系中不表达或表达量低。
据库进行了比对，以鉴定目的蛋白。 @个蛋白点进行质谱鉴定后，在数据库中没有
找到与这些差异蛋白点相匹配的蛋白数据，为证明
$ 结果与分析 这样的结果不是质谱仪或人为原因造成的差错，我
们还切取了图% 5方框中的 ;，;;，;;; B个蛋白点，作
$"! 二维凝胶电泳的比较分析 为对照也进行了同样的质谱鉴定。
图%显示中肠组织中表达的=&&个左右的蛋白
图% B个家蚕品系中肠组织的蛋白质表达谱
F-GH % 8I1>,"!1-21.>,1JJ-"2>,"#-K1-2!I1L-4GM!"#!I,11J-KNO",LJ!,*-2J
9:：高度抗性品种?-GIKP,1J-J!*2!J-KNO",LJ!,*-2；B&E：高度感性品种?-GIKPJMJ01>!-QK1J-KNO",LJ!,*-2；:6：抗性近等基因系D代8I1
D
2-2!IG121,*!-"2"#21*,R-J"G12-0K-21H 5S<@个框指示蛋白点%S@在B个中肠组织样品中表达量有差异；5方框中的;、;;和;;;B个蛋
白点切取出来用作质谱鉴定的对照。T*215S<-24-0*!14!I1>,"!1-2J>"!J%S@!I*!1.>,1JJ144-##1,12!KP*L"2G!I,11L-4GM!!-JJM1J*L>K1JH
T,"!1-2J>"!J;，;;*24;;;-2>*215O1,1>-0N14M>，*24!I12J1,U14*J!I10"2!,"K"#L*JJJ>10!,"L1!,-0-412!-#-0*!-"2H
@个差异点所在的方框根据蛋白着色的深浅用 的!，"和#这 B 个蛋白点在同样的条件下进行质
T)VM1J!（:-"RW*4）软件生成了相应的B)图（图C）。 谱分析，有意义的是得到的数据却得到了很好的比
$"$ 质谱数据分析 对结果。其中!和"分别对应家蚕的甘油醛RBR磷
从二维凝胶上切取的@个差异蛋白点，用质谱 酸脱氢酶（GKP01,*K41IP41RBR>I"J>I*!1 41IP4,"G12*J1），
分析后得到的质谱图见图 B，质谱数据详细列于表 96:;登录号：G-Y%&D%%DD&B，和家蚕的细胞质型苹果
%。比对的数据库主要有 96:; 的蛋白数据库和 酸脱氢酶（0P!"J"K-0 L*K*!1 41IP4,"G12*J1），96:; 登录
:X;R家蚕基因组数据库（I!!>：$$J-KNO",LH G12"L-0JH 号：G-Y%%(&@C@E%，得分分别为 %DD和 %CC，T值远远
",GH02$），本实验室构建的适合本地 +5/678程序的 小于&Z&%。
家蚕</8数据库。本实验室构建数据库的方法是，
从96:;下载的全部家蚕 </8数据并按E种 7WF的 % 讨论
可能进行翻译，然后转成本地 +5/678程序所能识
别的格式，最后形成的家蚕 </8数据库。但遗憾的 鳞翅目昆虫经口感染杆状病毒后，中肠组织的
是切取的这@ 个蛋白点的质谱数据经过比对，没能 一个或多个细胞被感染，然后从这些最初的病灶蔓
找到可信的与之匹配的蛋白或</8。 延到其他组织，进入血淋巴导致最后死亡（<2G1KI*,4
为了验证质谱数据是否有差错，我们将方框中 *24 ["KNL*2， %DD@； \-,N>*!,-0N !" #$H， %DDA；
MMK 昆虫学报 %&"#’(")*)$)+,&#-,(,&# ":卷
图! "个方框所示的#个家蚕品系差异蛋白及其#$图
%&’( ! )*+,&--+.+/01.20+&/3452/’0*.++3&6782.530.4&/3&/-&9+14/+34/,0*+&.#$9&+83
#个样品在图:中所示的"个方框分别被放大（图的上部）及其相应的#$图（图的下部）。%&9+14/+3&/0*+%&’( :2-0*.++34516+38+.+
+/64.’+,.+31+;0&9+6<（0*+4=29+14.0），3>116+5+/0+,8&0*0*+&.;2..+312/,&/’#$9&+83（0*+628+.14.0）(
图# 二维电泳胶上"个差异蛋白点的肽指纹图谱
%&’( # ?@%2--&9+31203+A0.4;0+,-.25!B$C’+63
D43*=>./ !" #$(，!EE:）。家蚕的中肠上皮组织，如 景非常一致，但带有抗性基因。从图 :中可以看出
围食膜和消化道的中肠上皮细胞是鳞翅目昆虫抵御 GF 的中肠组织蛋白表达谱和 #EK的蛋白表达谱相
J
杆状病毒经口感染的第一道防线（F2.< 4/, @<+.3， 似性非常高，大于与抗性品系 HG 的相似性，利用
!EE#）。 ?$L>+30软件分析的结果也证明了这点，表明近等基
我们利用对 G5H?I病毒高抗和高敏的家蚕品 因系的构建是成功的。
系构建了近等基因系，经过J代的培育和筛选，抗性 本研究鉴定了中肠组织 " 个差异表达的蛋白，
的近等基因系GF 理论上与感性品系#EK的遗传背 其中:和!为抗性品系HG和 GFJ表达量高于#EK，
J
3期 刘晓勇等：家蚕中肠组织抗核型多角体病毒病的相关蛋白分析 338
表! "个差异蛋白点的质谱信息
#$%&’! ($)))*’+,-./’,-0+1’,$0&).2*-.,’03)2-./204’)*’+0$&)*.,)
点号 质谱峰值
!"#$%#& ’()))"*+$,#-*$,.+/*$(.0)
123456177，1289561::，129156296，117:56732，11;356711，114856;:4，118956362，11:856444，172858287，17;75646:，
17;4549;1，173356:14，178858;:6，1;2:56992，1;1658:77，1;71569:3，1;37581;1，1;4358732，1;4656868，1;6158:1;，
1 1;:658164，138158;37，138858;2:，13915848:，139;584;1，14785917;，162:5:;28，164459623，164:5:846，16:65::43，
18215:813，18165:497，18;15::48，183;523;9，183:5936;，186259392，188659386，189759781，1:8151;98，7238527:7，
724652644，726452347，71:351639，7729571::，77115199;，77;751:12，;7265:7;4
7 123454882，1:;859417，192959969，727151174，724252846，771151724，7;;;51;24
; 1172582:8，118956693，1;1;564:;，1;98584:9，1319581:4，1391586;8，141;58;2:，726457668，771157728
126854672，111154:89，114456241，119956;;3，171254443，171154;:4，171456292，173;56643，174956;83，17:856:47，
1;2;56696，1;;158111，1;3856:37，1;4956:7:，1;8458381，1;9158116，1319586;2，13;45837;，136;58978，138756473，
3
138958481，14285:772，1417581:8，147:58168，14415:38:，146256;68，1461567:9，192459:26，192659:76，71;359426，
771152437，736752684，741957274，;287537:2
127854797，12;;547:;，12;854342，123454:68，112854617，113154176，118956;77，11:;587:9，119;56377，119356742，
119:58;8:，172;54967，176;58742，178858373，1;2758;48，1;2:56946，1;7256;22，1;795823:，1;;75676:，1;4356811，
4
1;:;587;4，1;9;58871，13845:186，139158997，139:5:181，142858::7，14995:828，16;:5:9:3，181659162，1:7252491，
1:;:59:41，199352433，71:357229，771151864，7;:352396，7::95428;
可能与抗%<=的特性是相关的；而;，3和4号这; =/0&’$>)5802(0 #,(00L.D#+A0($*/O.$G 15#$*/2>’2&2)06$/(0&2 ’DA+0*(,
种蛋白在感性 ;26 中表达较高，是否与感病性有关 "#0LG*/,#).)B.,A)& ?0/$)$*"，729：;:3E;:95
R(L()G.L(H，%.)G./(V，196:5 ZD(+$.B($.#D#TDA+0*(,"#0LG*/,#).)B.,A).D
还有待于进一步鉴定。
$G*/.M*)$.B*#T 0(,B(*,*(,*/ #DD($A,(0 (D/ (,$.T.+.(0 /.*$)& 4& 1>>)&
虽然鉴定了4种差异表达的蛋白，但并没有得
<(#$,$)& @$$)&，17：1:9E19;5
到这些蛋白的序列信息，质谱鉴定的对照样品证明 V*G0*V[，>0.))(,/?@，>#DD.DM>F，F#,LV!，R*,D.#AX[，72265 \D$G*
不是人为造成质谱数据的差错，因此无法对这些蛋 +0()).T.+($.#D(D/D#-*D+0($A,*#TS(+A0#B.,A)*)：(",#"#)(0T#,,*B.).#D&
白的功能作用做进一步研究验证。随着家蚕基因组 1/&’& ?0/$)&，14（1 8）：1748E17665
H.,N"($,.+N>[，@()GSA,DV\，=#0N-(DIX，199:5 [+’%<="($G#M*D*).)
和蛋白质组的进一步解析和家蚕序列数据库的不断
(D/ /*B*0#"-*D$(0 ,*).)$(D+* .D T.T$G .D)$(, A%)0$#’08 :0/%8&%(8& 4&
完善，相信这些质谱数据很快就会找到与之匹配的
B(:%/#%-/& C2#’$)&，87：6;E875
蛋白。家蚕的其他组织，如血淋巴，脂肪体等等，利
’.,](^[，I.AKR，W(DMVW，<#,$*,U，>#D/#+I，FG*D?，<,(-(D.N>[，
用我们构建的近等基因系也可以开展这方面的研 %(M(SGA)G(DWI，72225 X_$,(+$.#D (D/ +G(,(+$*,.]($.#D #T (/*D#B.,A)
究。 ",#$*.D)T,#-)#/.A-/#/*+L0)A0T($*"#0L(+,L0(-./*M*0*0*+$,#"G#,*).)SL
-($,._C()).)$*/ 0()*, /*)#,"$.#D‘.#D.]($.#D -()) )"*+$,#-*$,L& 4& 1,&
参 考 文 献（5’2’-’3+’)） 3$&& D2883>%&#/$,&，11：;46E;615
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对核型多角体病的抗性及遗传规律的研究& 蚕业科学，77（;）： (D$.B.,(0(+$.B.$L(M(.D)$DA0+*#"#0LG*/,#).)B.,A)& 4& ?0/$)&，88（19）：
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Q@0R，<8A; SR，T,: U，M+@ QT，’((%) K-@:.A97A;? /+33A.A;?+,- /+9N-,E （责任编辑：黄玲巧）