Protein-Ligand-, Protein-Inhibitor- und Protein-Protein-Wechselwirkungen: Einsatz analytischer Methoden zu deren Bestimmung

94 Pages·2020·5.686 MB·German

by  Sabine Helmsen

BestMasters
Sabine Helmsen
Protein-Ligand-,
Protein-Inhibitor-
und Protein-Protein-
Wechselwirkungen
Einsatz analytischer Methoden zu
deren Bestimmung
BestMasters
Mit „BestMasters“ zeichnet Springer die besten Masterarbeiten aus, die an renom-
mierten Hochschulen in Deutschland, Österreich und der Schweiz entstanden sind.
Die mit Höchstnote ausgezeichneten Arbeiten wurden durch Gutachter zur Veröf-
fentlichung empfohlen und behandeln aktuelle Themen aus unterschiedlichen
Fachgebieten der Naturwissenschaften, Psychologie, Technik und Wirtschaftswis-
senschaften. Die Reihe wendet sich an Praktiker und Wissenschaftler gleicherma-
ßen und soll insbesondere auch Nachwuchswissenschaftlern Orientierung geben.
Springer awards “BestMasters” to the best master’s theses which have been com-
pleted at renowned Universities in Germany, Austria, and Switzerland. The studies
received highest marks and were recommended for publication by supervisors.
They address current issues from various fields of research in natural sciences,
psychology, technology, and economics. The series addresses practitioners as well
as scientists and, in particular, offers guidance for early stage researchers.
Weitere Bände in der Reihe http://www.springer.com/series/13198
Sabine Helmsen
Protein-Ligand-,
Protein-Inhibitor-
und Protein-Protein-
Wechselwirkungen
Einsatz analytischer Methoden zu
deren Bestimmung
Mit einem Geleitwort von PD Dr. Carsten Zeilinger
Sabine Helmsen
Biomolekulares Wirkstoffzentrum
Leibniz Universität Hannover
Hannover, Deutschland
ISSN 2625-3577 ISSN 2625-3615 (electronic)
BestMasters
ISBN 978-3-658-30150-7 ISBN 978-3-658-30151-4 (eBook)
https://doi.org/10.1007/978-3-658-30151-4
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Geleitwort
Frau Sabine Helmen hat in meiner Arbeitsgruppe ihre Masterarbeit zu dem The-
ma: „Einsatz analytischer Methoden zur Bestimmung von Protein-Ligand, Pro-
tein-Inhibitor und Protein-Protein- Wechselwirkungen“ angefertigt und sich da-
bei sehr tiefgreifend mit dem Thema Hsp90 und Hsp70 auseinandergesetzt. Dazu
wurde in meiner Arbeitsgruppe eine Mikroarray-basierte Methode entwickelt,
um diese Wechselwirkungen an mehreren ähnlichen Targets wie Hitzeschock-
proteinen simultan und effizient durchzuführen. Dies nutzte Frau Helmsen dann,
um nach neuen Verbindungen zu suchen, die diese Wechselwirkungen beeinflus-
sen und testete eine Substanzbibliothek von etwa 50 Proben und Fraktionen aus
Pilzextrakten erfolgreich mit einem interessanten Ergebnis, das eine Substanz
(Rickenyl D) lieferte, das ATP-kompetitiv an Hsp70 ist. Sehr schön wurde in der
Arbeit auch dargelegt, welche Möglichkeiten das hoch-miniaturisierte Test-
system liefert und hier konnte Frau Helmsen einen Interaktionstest von Hsp90 an
Hsp70 nutzen, um auch daran Substanzen zu testen. Zusätzlich konnte in der
Arbeit gezeigt werden, dass die Position des cyanogenen Fluoreszenzfarbstoffs
Cy5 am ATP ausschlaggebend die Bindung am Hsp90 beeinflusst. Neben weite-
ren anderen, sehr interessanten Ergebnissen hat es Frau Helmsen geschafft, einen
hohen interdisziplinären Ansatz umzusetzen, und hat einen Bogen von der che-
mischen Analytik bis hin zur Biochemie und Biotechnologie geschlagen. Die
Arbeit selbst ist sehr schön illustriert, gut geschrieben mit vertiefter Hintergrund-
information, facettenreich, deshalb sind auch zwei Publikationen mit Beteiligung
hervorgegangen.
Hannover PD Dr. Carsten Zeilinger
Inhaltsverzeichnis
Geleitwort ............................................................................................................ V
Abbildungsverzeichnis ........................................................................................ IX
Tabellenverzeichnis ......................................................................................... XIII
Abkürzungsverzeichnis ...................................................................................... XV
1 Einleitung und Zielsetzung ..................................................... 1
2 Theoretischer Hintergrund .................................................... 3
2.1 Die Hitzeschockproteine ....................................................................... 3
2.2 Das Hitzeschockprotein Hsp70 ............................................................. 4
2.2.1 Struktur von Hsp70 .................................................................... 5
2.2.2 ATP-abhängiger Faltungsmechanismus von Hsp70 .................. 6
2.3 Das Hitzeschockprotein Hsp90 ............................................................. 8
2.3.1 Struktur von Hsp90 .................................................................... 9
2.3.2 ATP-abhängiger Faltungsmechanismus von Hsp90 ................ 10
2.4 Hitzeschockproteine in der Krebsforschung ....................................... 12
2.5 Inhibierung der Chaperonfunktion ...................................................... 12
2.5.1 Hemmung der ATPase-Aktivität ............................................. 13
2.5.2 Konformationsänderungen ....................................................... 14
2.5.3 Interaktionen mit Co-Chaperonen ............................................ 14
2.6 Fungi als Quelle biochemischer Diversität ......................................... 15
2.7 Hypoxylon rickii: Naturstofferzeuger mit einem besonderen
Sekundärmetabolismus ....................................................................... 16
2.8 Die Microarray-Technologie als Plattform komplexer Analysen ....... 18
2.9 Molekularbiologischer Teil: pET SUMO HsHsp70 Vektor ................ 22
3 Praktische Arbeiten............................................................... 23
3.1 Bioinformatische Analysen zu Hsp70 und Hsp90 .............................. 23
3.1.1 Funktionelle Interaktionspartner .............................................. 23
3.1.2 3D-Strukturen der N-terminalen ATP-Bindetasche ................. 25
3.2 Experimentelle Arbeiten ..................................................................... 26
3.2.1 Transformation und Kultivierung von HsHsp70...................... 26
3.2.2 Zelllyse und Reinigung vom HsHsp70 .................................... 27
3.2.3 Fraktionierung und Probenvorbereitung des H. rickii
Rohextraktes AM 5.1 ............................................................... 28
3.2.4 Durchführung der Analysen mit der Microarray-Technologie 30
VIII Inhaltsverzeichnis
4 Ergebnisse............................................................................... 33
4.1 Reinheit vom HsHsp70 ....................................................................... 33
4.2 Aktivitätstest der produzierten Proteine .............................................. 34
4.3 Kompetitiver Verdrängungstest mit isolierten Naturstoffen ............... 35
an der ATP-Bindestelle des humanen Hsp70s ............................................ 35
4.4 Analyse von der ATP-Verdrängung ................................................... 40
durch den H. rickii Rohextrakt AM 5.1 und dessen Fraktionen ................ 40
4.5 Interaktionsanalyse zwischen humanem Hsp70 und Hsp90 ............... 44
4.6 Die Anwendungsbreite des Microarray-Testsystems .......................... 47
4.6.1 Lagerbedingungen bedruckter Microarrays und verwendeter
Proteine .................................................................................... 47
4.6.2 Einfluss der Position des Fluoreszenzfarbstoffes am ATP
auf die Bindungsfähigkeit an Hsp90 ........................................ 50
4.6.3 Geräteeinfluss vom Scanner .................................................... 51
5 Diskussion ............................................................................... 53
5.1 Kompetitive Verdrängungstests von Naturstoffen gegen Hsp70 ........ 53
5.2 Interaktionsanalysen von HsHsp70 mit Hsp90α ................................. 54
5.3 Einfluss der Farbstoffposition am ATP auf die Bindungsfähigkeit .... 55
6 Zusammenfassung und Ausblick ......................................... 57
Literaturverzeichnis ..................................................................... 61
Anhang .......................................................................................... 65
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Übersicht der Aufgaben dieser Masterarbeit. .............................. 2
Abbildung 2: Struktur von Hsp70 in verschiedenen Zuständen ........................ 5
Abbildung 3: Mechanismus der Rückfaltung fehlgefalteter Proteine in ihre
native Form beim Hsp70 ............................................................. 7
Abbildung 4: Struktur von Hsp90 in verschiedenen Zuständen ...................... 10
Abbildung 5: Der Hsp90-Faltungsmechanismus unter ATP-Verbrauch ......... 11
Abbildung 6: Strukturen von Hsp70 und Hsp90 mit ihren möglichen
Bindestellen für Inhibitoren ...................................................... 13
Abbildung 7: Strukturen der Wirkstoffe, die an diverse Bindestellen der
Hitzeschockproteine angreifen .................................................. 14
Abbildung 8: Die Strukturen der aus dem Pilz Strobilurus tenacellus
gewonnenen Sekundärmetaboite Strobilurin A und das darauf
basierende Pflanzenschutzmittel Kresoxim-Methyl .................. 16
Abbildung 9: Grundgerüste verschiedener Sesquiterpene aus H. rickii mit
antibakterieller und antimykotischer Wirkung .......................... 17
Abbildung 10: Strukturen der Rickenyle A-E ................................................... 18
Abbildung 11: Gegenüberstellung der schematischen Darstellung mit
dem gescannten und realen Microarray .................................... 19
Abbildung 12: Struktur des Cyanin-Farbstoffes Cy5 und von ATP,
das an verschiedenen Positionen markiert ist ............................ 20
Abbildung 13: Funktionsweise des Microarray-Testsystems............................ 21
Abbildung 14: Aufbau des Genkonstruktes mit dem ChampionTM pET
SUMO Vektor (Invitrogen Life Technologies) ......................... 22
Abbildung 15: Interaktions-Netzwerke von HsHsp70 und HsHsp90 ............... 24
Abbildung 16: 3D-Strukturmodelle der NBD von HsHsp70 (PDB: 3ATU)
und HsHsp90 (PDB: 1BYQ) mittels PyMol. ............................ 26
Abbildung 17: Der Weg von der Transformation in E. coli bis zur
Kultivierung. ............................................................................. 27
Abbildung 18: Vorgang eines Microarray-Tests ............................................... 31
Abbildung 19: Reinheitsüberprüfung der Proteine mittels der SDS-Page. ....... 33
Abbildung 20: Fluoreszenzintensität der beiden getesteten Proteine ................ 34
Abbildung 21: Schematische Darstellung des kompetitiven
Verdrängungstests zwischen dem fluoreszenz-markiertem
ATP und einem potentiellen Wirkstoff. .................................... 35
Abbildung 22: Bindungsaffinitätstest von verschiedenen Multiforminen in
den Konzentrationen von 0,5 μg/mL und 5 μg/mL auf die
ATP-Bindestelle des Hsp70. ..................................................... 36
X Abbildungsverzeichnis

Abbildung 23: Bindungsaffinitätstest von den bereits getesteten
Multiforminen in der Konzentration von 50 μg/mL auf die
ATP-Bindestelle des Hsp70s .................................................... 37
Abbildung 24: Bindungsaffinitätstest weiterer isolierter Verbindungen aus
H. rickii in einer Konzentration von 50 μg/mL. ....................... 37
Abbildung 25: Histogramm als Grundlage für die Auswertung der
Dosis-Wirkungs-Beziehung vom Multiformin G-003 für
einen Konzentrationsbereich von 100 μg/mL bis 0,01 μg/mL . 38
Abbildung 26: Kompetitiver ATP-Verdrängungstest vom Rickenyl D und
E in verschiedenen Konzentrationen......................................... 39
Abbildung 27: Gegenüberstellung der konzentrationsabhängigen
Fluoreszenzintensitäten als Dosis-Wirkungs-Kurve
von Rickenyl D und E im Konzentrationsbereich
von 100 μg/mL bis 0,01 μg/mL. ............................................... 40
Abbildung 28: Kompetitiver Verdrängungstest zwischen des Rohextrakts
AM 5.1 in mehreren Konzentrationen um die
ATP-Bindestelle im Hsp70 und Hsp90. .................................... 41
Abbildung 29: Vergleich der Dosis-Wirkungs-Kurven vom Rohextrakt
AM 5.1 gegenüber Hsp70 und Hsp90. ...................................... 42
Abbildung 30: Vergleich der Fraktionen (der getesteten Proben) mit
dem Chromatogramm des HPLC-Laufs ................................... 43
Abbildung 31: Cy5-Fluoreszenzintensitäten vom ATP, das mit den
einzelnen Fraktionen um die Bindestelle im Hsp70
konkurriert ................................................................................ 44
Abbildung 32: Schematische Darstellung der beiden Methoden der
Interaktionsanalyse ................................................................... 45
Abbildung 33: Vergleich der Signalintensitäten vom Cy5-markiertem
ATP der normalen Kontrollen zu den verschiedenen
Konzentrationen vom Cy5-markiertem Hsp90α. ...................... 46
Abbildung 34: Fluoreszenzintensitäten des Cy5-markiertem ATP
(NK und PK) im Vergleich zum Cy5-markiertem Hsp90α ...... 47
Abbildung 35: Vergleich der Cy5-ATP-Bindungsaffinität bei einer
Lagerung von einer Woche bei 4 °C und von vier Wochen
bei –25 °C. ................................................................................ 48
Abbildung 36: Dosis-Wirkungs-Beziehung des Inhibitors VER155008
zum Hsp70 unter verschiedenen Lagerbedingungen. ............... 49
Abbildung 37: Cy5-ATP-Fluoreszenzsignal für verschiedene
Lagerungszeiten von Proteinen auf der Multiwellplatte
bei 4 °C. .................................................................................... 50