Prokaryotic Expression and Bioinformatics Analysis of Cytosolic Malate Dehydrogenase from Camellia sinensis(Theaceae)

2010·4.1 MB·

by  Chen Lulu

云 南 植 物 研 究 , ():
暋2010 321 32~40
ActaBotanicaYunnanica : /
暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI10灡3724SP灡J灡1143灡2010灡09182
茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析
*
陈露露 ,翟羽佳 ,王 鹏 ,王 晖 ,,
1 1 1 12
暋 暋
郝家胜 ,,朱国萍 ,
12 12**
安徽师范大学生命科学学院分子进化与生物多样性重点实验室 安徽 芜湖
(1 , 暋241000;
生物环境与生态安全安徽省高校重点实验室 安徽 芜湖
2 , 暋241000)
摘要:利用 及 末端快速扩增法 获得了完整的茶树细胞质苹果酸脱氢酶 基因
RT灢PCR cDNA , (cMDH)
登录号为 该基因全长 编码 个氨基酸 分子量约为
Cs灢cMDH (GenBank GQ845406)。 1235bp, 332 , 35灡5
含重组质粒 的 经 于 诱导 后可以获得大量可
kD。 pGEX灢MDH E灡coliRosetta 0灡5mmol·L灢1IPTG 32曟 3h
溶性的 融合蛋白 的 结果显示 与高等植物 的氨基酸序列一致性
61灡5kD 。NCBI BLAST ,Cs灢cMDH cMDH
高达 通过基于蛋白质结构的多序列比对 预测 为二聚体 每个亚基包含 个
88%~93%。 , Cs灢cMDH , 13 毬灢
折叠及 个 螺旋 包含典型的 指纹 序列 其氨基酸残
13 毩灢 。Cs灢cMDH MDH “ 暠(fingerprint) G12AAGQIG18,
基 在所有 中都很保守 还包含一些与其它 同源的保守序列单元
D43 NAD灢MDH 。Cs灢cMDH NAD灢MDHs ,
如 结合位点 催化模体及底物结合位点 而且 还包含在所有植物 中都相当
NAD+ 、 。 Cs灢cMDH NAD灢cMDHs
保守的 个 因此我们推断 为茶树细胞质 茶树基础代谢相关基因 的克
6 Cys, Cs灢cMDH NAD灢MDH。 cMDH
隆和原核表达为 的功能研究奠定了基础
Cs灢cMDH 。
关键词:茶树 胞质型苹果酸脱氢酶 末端快速扩增法 序列分析 二级结构
; ;RT灢PCR;cDNA ; ; ;
中图分类号: 文献标识码: 文章编号:
Q78,Q943暋暋暋暋暋 A暋暋暋暋暋暋 0253灢2700(2010)01灢032灢09
ProkaryoticExpressionandBioinformaticsAnalysisofCytosolic
MalateDehydrogenasefromCamelliasinensis Theaceae
( )
1 1 1 1,2
CHENLu灢Lu,ZHAIYu灢Jia,WANGPeng ,WangHui ,
1,2 1,2**
HAOJia灢Sheng ,ZHUGuo灢Ping
(1TheKeyLaboratoryofMolecularEvolutionandBiodiversity,CollegeofLifeSciences,AnhuiNormalUniversity,
Wuhu241000,China;2AnhuiKeyLaboratoryofBioticEnvironmentandEcologicalSecurity,Wuhu241000,China)
Abstract
:Thecompletegeneofcytosolicmalatedehydrogenase(cMDH)fromCamelliasinensis,calledCs灢
cMDH,wasobtainedbyRT灢PCRandrapidamplificationofcDNAends(GenBankaccessionnumber
GQ845406).Thisgenewas1235bpinlength,encodingaproteinof332aminoacidswiththeputativemo灢
lecularweightof35灡5kD.TheE灡coliRosetta(DE3)harboringpGEX灢MDHwasinducedby0灡5mmol·L灢1
IPTGat32曟for3hours,anda61灡5kDglutathioneStransferase(GST)灢fusedMDHwasobtainedinsolu灢
bleform.TheresultsofNCBI灢BLASTrevealedthatCs灢cMDHshared88%-93%ofaminoacidsequencei灢
dentitywithothercMDHfromdifferenthigherplants.Accordingtothemultiplesequencealignmentbased
onthethree灢dimensionalstructureofprotein,Cs灢cMDHwaspredictedtobeadimerwiththirteen毬灢sheetand
thirteen毩灢helixofeachsubunit.Cs灢cMDHcontainstypicalfingerprintsequence(G12AAGQIG18)asall
基金项目 国家自然科学基金 教育部新世纪优秀人才支持计划 教育部留学回国人员启动
* : (30500300;30870062); (NCET灢06灢0558);
基金 安徽省优秀青年科技基金 重要生物资源保护与利用研究安徽省重点实验室资助
; (06043089;08040106811);
通讯作者
** :Authorforcorrespondence;E灢mail:gpz1996@yahoo灡com
收稿日期 接受发表
:2009灢09灢14,2009灢12灢07
作者简介 陈露露 女 在读硕士研究生 主要从事植物分子系统学与分子生物学的研究
: (1986-) , , 。
期 陈露露等 茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析
1 暋暋暋暋暋暋暋暋暋 : 暋暋暋暋暋暋暋暋暋3暋3
43
MDHs.TheaminoacidD inCs灢cMDHisconservedinallNAD灢MDHs.Cs灢cMDHalsohassomeconserved
sequenceunitshomologoustootherNAD灢MDHs,suchasNAD+bindingsites,catalyticmotifandsubstrate
bindingsites.Moreover,Cs灢cMDHcontainssixCyswhicharehighlyconservedinallplantNAD灢cMDHs.
Therefore,Cs灢cMDHwasinferredtobeNAD灢dependentcMDH.Thepresentstudymayprovidethefunda灢
mentforthefurtherfunctionalcharacterizationofCs灢cMDH.
Keywords:Camelliasinensis;Cytosolicmalatedehydrogenase;RT灢PCR;RapidamplificationofcDNA
ends;Sequenceanalysis;Secondarystructure
苹 果 酸 脱 氢 酶 茶树 为多年生常绿木
暋 (malatedehydrogenase, (Camelliasinensis)
广泛存在于生物体内 主要催化草酰乙 本植物 是一种世界范围内的广泛流行饮品 具
MDH) , , ,
酸和苹果酸之间的可逆转化 参与调节三羧酸循 有重大的经济价值 它的次生代谢物更是有着极
, ,
环 乙醛酸通路 氨基酸合成 葡萄糖异生 氧 大的医学价值 等 目前茶树次生
、 、 、 、 (Singh ,2009)。
化还原平衡的维持以及细胞质基质和细胞器之间 代谢物的研究比较广泛 但关于茶树基础代谢酶
,
的物质交换 已知的 是由相同或相似亚基 类的研究不多 迄今茶树 的研究尚未见报
。 MDH , MDH
组成的二聚体或四聚体酶 等 道 本文中我们采用 快速末端扩增法
(Musrati ,1998), 。 cDNA
在大多数生物体内 以同源二聚体形式存 获
MDH (rapidamplificationofcDNAends,RACE)
在 依 赖 型 和 得茶树细胞质苹果酸脱氢酶基因
。NAD灢 MDH (NAD灢MDH) (Cs灢cMDH ),
依赖型 的亚基分 实现了其在大肠杆菌中的异源表达 并通过生物
NADP灢 MDH (NADP灢MDH) ,
子量 分 别 为 和 信息学手段 对 的氨基酸序列进行了
32灡5~37 kD 42~43 kD , Cs灢cMDH
根据辅酶特异 分析 二级结构预测及三维结构的同源建模
(OcheretinaandScheibe,1997)。 、 。
性 亚细胞定位以及生物学功能 植物 主
、 , MDH
要分为 种形式 细胞质 材料和方法
5 : NAD灢MDH (cMDH
1暋
或 线粒体 叶 材料来源
cyMDH)、 NAD灢MDH(mMDH)、 1灡1暋
绿体 叶绿体 供试茶树品种为安徽农业大学茶园苗圃的春季龙井
NADP灢MDH (chMDH)、 NAD灢
以 及 乙 醛 酸 体 一芽二叶新梢 取样后迅速用液氮冷冻 立即保存于
MDH (cnMDH) NAD灢MDH 43 , ,
冰箱中备用
(gMDH)(OcheretinaandScheibe,1997;Gi灢 -80曟 。
总RNA的提取与cDNA的获得
1灡2暋
etl,1992)。 采用 提
目前植物的 和 SVTotalRNAIsolationSystem(Promega)
mMDH、chMDH cnMDH 取茶叶总 实验操作按说明书进行 通过紫外分光
已经被广泛研究 而关于 RNA, 。
(Gietl,1992), cMDH 光度法鉴定总 的纯度 并通过 琼脂糖凝胶电泳
的研 究 报 道 不 多 RNA , 1%
(Ocheretinaand Scheibe, 检测总 的质量 以提取的总 为模板 利用
等 作为苹果酸代 RNA 。 RNA ,
1997;Miller ,1998)。cMDH PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit(TaKaRa)
谢的关键酶之一 在细胞质基质中和磷酸烯醇式 进行逆转录 获得茶树总
, , cDNA。
丙酮酸羧化酶 一起催化合成苹果酸 Cs灢cMDH基因保守片段的扩增
(PEPC) 1灡3暋
等 同时为细胞质基质和细胞 根据 内已有的胞质型苹果酸脱氢酶
(Chollet ,1996), NCBIGenBank
器之间的多种穿梭系统提供底物和还原力 基因序列设计简并性引物 和 表
(He灢 cMDH灢P1 cMDH灢P2(
等 以茶树总 为模板 利用
ber,1974),如细胞质和线粒体之间的苹果酸/ 1)(Timothy ,1998)。 聚合酶cDNA ,以
天冬氨酸和苹果酸 草酰乙酸穿梭系统 Go灢TaqGreenMasterMix (Promega), cM灢
/ 。cMDH 和 为引物进行 扩增 反应程序
还对核酸选择性通道和糖异生作用有一定的影响 DH灢P1 cMDH灢P2 PCR ,
为 预变性 变性 退火
等 :95曟 3min;95曟 30s,55曟 30s,
(Hanss另,外2转002基;因G研ibs究on发a现ndM在cA苜li蓿ste中r灢超He量nn表, 72曟延伸1min,35个循环;72曟终止延伸10min。将
2003)。 , 纯化的 产物与 载体连接并转化
PCR pMD19灢T E灡coli
达 基因后 提高了苜蓿对酸性土壤和铝毒 感受态细胞 平板进行蓝白斑筛选
MDH , DH5毩 ,X灢Gal/IPTG ,
的耐受性 罗小英和崔衍波 将阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序
( ,2004)。 。
云 南 植 物 研 究 第 卷
3暋4暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
表 本研究所用引物序列
1暋
Table1暋Primersequencesusedinthisstudy
引物 序列
(5曚~3曚)
Primers Sequences(5曚-3曚)
cMDH灢P1 GCTACGCCCTGGTGccnatgathgc
cMDH灢P2 CGTAGGAGCCGTCGGAGtanacncccat
3曚RACE灢1 TTTGGGGTAATCATTCCTCAACTCA
3曚RACE灢2 CTTGGGTTTCTATGGGTGTCTACTC
5曚RACE灢1 ACGCATTGGTGTTGGCAGGGTTA
5曚RACE灢2 AGCCGTCGGAGTAGACACCCATAGA
cMDH灢F1 GAGATCGCGGATCCATGGCGAAAGAACCAGTTCG
cMDH灢F2 GTACGCCGCTCGAGAGAAAGGCAAGAGTATGCCAGA
Cs灢cMDH基因的曚RACE和曚RACE Cs灢cMDH的氨基酸序列分析及结构预测
1灡4暋 5 3 1灡8暋
根据已获得的 基因保守片段设计 个基 利用 数据库的 程序对 进行
Cs灢cMDH 4 NCBI BLAST Cs灢cMDH
因特异性引物 分别为 和 以及 氨基酸序列一致性分析 利用软件
, 5曚RACE灢1 5曚RACE灢2 3曚 。 ESPript2灡2(ht灢
和 表 以茶树总 为模板 对
RACE灢1 3曚RACE灢2( 1)。 cDNA , tp://espript灡ibcp灡fr/ESPript/ESPript/) Cs灢cMDH
利用 获得基因的 和 序 进行二级结构的预测 利用软件
GeneRacerTMKit(Invitrogen) 3曚 5曚 。 Swiss灢Model(http://
列 具体操作详见说明书 将获得的 个片段纯化后克 对 进行三维结构的
, 。 2 swissmodel灡expasy灡org/) Cs灢cMDH
隆入 载体 将筛选的阳性克隆送上海英骏生 同源建模
pMD19灢T , 。
物技术有限公司测序
。
Cs灢cMDH基因全长cDNA的获得 结果
1灡5暋 2暋
利用 软件将以上获得的三段序列进行拼
DNAMAN 茶树总RNA的提取
接 获得全长 序列 设计引物 和 2灡1暋
, cDNA 。 cMDH灢F1 cM灢 茶树总 经琼脂糖凝胶电泳检测呈现出
表 以茶树总 为模板 使用高保真 RNA
DH灢F2( 1), cDNA , 条清晰的条带 图 分别为 和
酶PrimeSTARTM HSDNAPolymerase(TaKaRa)PCR 2 (的亮1度),约是 28S 亮18度S
扩增 基因的 将获得的 片段纯化后 rRNA。28SrRNA 18SrRNA
Cs灢cMDH ORF, PCR 的两倍 表明总 基本无降解
克隆送入上pM海D英19骏灢T生载物体技,术将有筛限选公的司测阳序性克隆pMD19灢cM灢 全,长Cs灢cMRDNHA基因的获得 。
DH 。 2灡2暋
Cs灢cMDH基因的异源表达 利用简并引物 和 进行
1灡6暋 cMDH灢P1 cMDH灢P2
设计分别包含 和 酶切位点的引物 扩增获得 的片段 图 在
BamHI XhoI cM灢 PCR 779bp ( 2a), Gen灢
和 表 以 为模板 进行 比对 结果显示为植物
DH灢F1 cMDH灢F2( 1), pMD19灢cMDH Bank BLASTn , cMDH
进行 将纯化的 产物经 和 双酶 的保守片段 然后利用 和 技术
PCR。 PCR BamHI XhoI 。 3曚RACE 5曚RACE
切后 与 质粒连接 转化 感受
, pGEX灢4T灢1 , E灡coliDH5毩
态细胞 获得重组质粒 经测序鉴定后
, pGEX灢MDH。 ,
将 转入 挑单菌落 培养
pGEX灢MDH E灡coliRosetta, 37曟
过夜 次日按照 的接种量接入 液体培
, 1暶100 50mlLB
养基中 振荡培养至 为 时 加入终浓度为
, A600 0灡6 , 0灡5
的 诱导 离心收集菌体
mmol·L灢1 IPTG,32曟 3h,4曟 。
将菌体悬浮于破碎缓冲液中 超声波破碎细胞 破碎
, ( 12
间隔 共破碎 细胞裂解液于
s, 28s, 6min)。 12000r/
离心 取上清进行 电泳鉴定
min 20min, SDS灢PAGE 。
Cs灢cMDH的氨基酸序列及理化性质分析
1灡7暋
利 用 软 件
ProtParam (http://au灡expasy灡org/ 图 茶树总 电泳图
计算 的氨基酸序列组 1暋 RNA
tools/protparam灡html) Cs灢cMDH
成 相对分子量 理论等电点等理化性质 应用 Fig灡1暋ElectrophoresisofthetotalRNA
、 、 ; Bioedit
软件分析蛋白质的疏水性 fromCamelliasinensis
。
期 陈露露等 茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析
1 暋暋暋暋暋暋暋暋暋 : 暋暋暋暋暋暋暋暋暋3暋5
图 基因的 扩增
2暋Cs灢cMDH PCR
基因保守片段的 扩增 标准分子量 保守片段
(a)Cs灢cMDH PCR (M:DNA DL2000;1:Cs灢cMDH );(b)3曚RACE
和 扩增产物 标准分子量 端 产物 端 产物
5曚RACE (M:DNA DL2000;1:3曚 RACE ;2:5曚 RACE );
基因编码区的扩增产物 标准分子量 基因编码区
(c)Cs灢cMDH (M:DNA DL2000;1:Cs灢cMDH )
Fig灡2暋PCRamplificationofCs灢cMDHgenefromCamelliasinensis
(a)TheconservedfragmentofCs灢cMDHgenebyPCR(M:MarkerDL2000;Lane1:theconservedfragmentofCs灢cMDHgene);
(b)5曚and3曚RACEfragments(M:MarkerDL2000;Lane1:3曚RACEfragment;Lane2:5曚RACEfragment);
(c)Full灢lengthCs灢cMDHgene(M:MarkerDL2000;Lane1:CodingsequenceofCs灢cMDHgene)
分别获得 和 的片段 图 用 Cs灢cMDH的异源表达
378bp 477bp ( 2b)。 2灡4暋
将 个片段拼接获得 的完整 以 为模板 扩增
DNAMAN 3 1235bp pMD19灢cMDH PCR Cs灢cM灢
序列 编码 个氨基酸 应用 的 基因的 克隆入原核表达载体
cDNA , 332 。 NCBI DH ORF, pGEX灢
程序显示 基因包含 长的 测序鉴定正确 将重组质粒 转
ORF Cs灢cMDH 62bp 5曚 4T灢1, 。 pGEX灢MDH
非编码区 起始密码子 的基因编 入 中 进行 诱导表达
、ATG 、999bp E灡coliRosetta ,32曟 IPTG 。
码区 图 终止密码子及 的 的 结果显示 重组菌 和
( 2c)、TAG 22bp poly 12% SDS灢PAGE , 45kD 66灡2
尾巴和 的 非编码区 此基因已登 之间有明显的表达产物 分子量约 如
(A) 174bp 3曚 。 kD , 61灡5kD,
录 登录号为 图 所示 载体 带有谷胱甘肽 转移
GenBank, GQ845406。 3 。 pGEX灢4T灢1 S
Cs灢cMDH的氨基酸序列及理化性质分析 酶 融 合 标 签
2灡3暋 (glutathioneS灢transferase,GST) ,
用 软件预测 的理化性 大小约为 因此茶树细胞质苹果酸脱氢
ProtParam Cs灢cMDH GST 26kD,
质得出其亚基理论分子量为 理论等 酶的亚基分子量约为 与理论计算值相近
35灡557kD, 35灡5kD, 。
电点为 此蛋白中含量比较多的氨基酸是 Cs灢cMDH的氨基酸序列分析
5灡91, 2灡5暋
和 含量比较少的氨基酸是 利用 程序对 与其它物种
Ala、Val Leu, Phe、 BLAST Cs灢cMDH
和 不稳定系数为 属于稳定蛋 的苹果酸脱氢酶进行氨基酸序列一致性分析 结
His Trp, 33灡93, ,
白 利用 软件来检测 蛋白的 果见表 序列比对显示 与其它高
。 Bioedit Cs灢cMDH 1。 ,Cs灢cMDH
疏水性 分析发现 等植物的 具有很高的同源性 它与杨树
(KyteandDoolittle,1982)。 , cMDH 。
的 端存在明显的疏水区 这一结构 的序列一致性 达 与拟
Cs灢cMDH N , cMDH (identity) 93%,
同样存在于动植物以及细菌的 当中 南芥 葡萄 大豆 烟草 玉米 苹果
cMDH 、 、 、 、 、 cMDH
蛋白的平均亲 的同源性均 与水稻 小麦 的同源
(DingandMa,2004)。Cs灢cMDH 曒90%, 、 cMDH
水 性 值 性均为 与低等植物 的同源
(Grand average of hydropathicity, 88%。Cs灢cMDH cMDH
为 预测该蛋白质为疏水性蛋 性略低 与植物叶绿体 的
GRAVY) 0灡133, 。Cs灢cMDH NADP灢MDH
白质 这很可能与其含有较多的 和 序列一致性为 与植物 和
, Ala、Val 40%~41%, mMDH gM灢
有关 的同源性较低 一般不高于
Leu 。 DH , 30%。Cs灢cMDH
云 南 植 物 研 究 第 卷
3暋6暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
与动物 也具有较高的同源性 如它与猪心
cMDH ,
的序列一致性达 与猪
cMDH 60%。Cs灢cMDH mM灢
及古菌的序列一致性较低 小于
DH , 30%。
基于结构的Cs灢cMDH二级结构及 D预测
2灡6暋 3
根据蛋白质数据库 猪心
暋暋 (PDB) cMDH (Pig灢
的蛋白质结构
cMDH) (PDB5mdh)(Chapman
等 对推导的 氨基酸序列进行
,1999), Cs灢cMDH
基于蛋白质结构的 多序列比对 图
图 粗酶液的 分析 cMDH ( 4)。
3暋 SDS灢PAGE 预测 为类似猪心 的二聚
蛋白质标准分子量 诱导的空载体对照
M: ;1:0灡5mMIPTG ; Cs灢cMDH cMDH
诱导的粗酶液 体 每个亚基包含 个 折叠及 个 螺旋
2,3:0灡5mMIPTG , 13 毬灢 13 毩灢 。
根据猪心 的蛋白质三维结构
Fig灡3暋AnalysisofcrudeextractsbySDS灢PAGE cMDH (2灡4痄)
M:proteinmolecularweightstandard;Lane1wascrudeextract 等 利 用
(PDB 5mdh) (Chapman ,1999),
ofstraincarryingpGEX灢4T灢1with0灡5mMITPGinduction: 建立的 亚基三维结
SWISS灢MODEL Cs灢cMDH
Lanes2and3werecrudeextractsofstraincarrying 构的同源模型如图 所示
pGEX灢MDHwith0灡5mMITPGinduction 5 。
表 推导的Cs灢cMDH氨基酸序列与不同物种MDH的同源性比较
2暋
Table2暋HomologyofdeducedaminoacidsequenceofCs灢cMDHwithMDHsfromvariousspecies
Species Protein Identity(%) GenBankaccessionnumber
Plant
Populustrichocarpa cMDHa 93 XP_002312583
Arabidopsisthaliana cMDH 92 NP_199147
Vitisvinifera(grape) cMDH 92 XP_002278712
Glycinemax(soybean) cMDH 90 AAS18241
Nicotianatabacum(tobacco) cMDH 90 CAC12826
Zeamays(maize) cMDH 90 NP_001105603
Malusxdomestica(apple) cMDH 90 ABB36659
Oryzasativa(rice) cMDH 88 NP_001064860
Triticumaestivum(wheat) cMDH 88 AAP70009
Charavulgaris cMDH 74 CAC79550
Mantoniellasquamata cMDH 73 CAC80840暋
Micromonaspusilla cMDH 69 EEH56495
FlaveriaBidentis chMDHb栙 41 P46489
Spinaciaoleracea(spinach) chMDH 41 P52426
Medicagosativa(alfalfa) chMDH 40 O48902
Pisumsativum(pea) chMDH 40 P21528
Sorghumbicolor chMDH栙 40 P17606
Zeamays(maize) chMDH 40 P15719
Arabidopsisthaliana cnMDHc 30 Q9SN86
Arabidopsisthaliana mMDHd 30 CAA10320
Citrulluslanatus(watermelon) mMDH 30 P17783
Citrulluslanatus(watermelon) gMDHe栙 26 P19446
Oryzasativa(rice) gMDH 22 Q42972
Animal
Susscrofa(pig) cMDH栙 60 P11708
Susscrofa(pig) mMDH栙 24 P00346
Bacteria
Thermusflavus MDH栙 53 CAA38008
Escherichiacoli暋 MDH栙 27 BAB37532
Archaea
HaloarculaMarismortui MDH栙 28 AAA73368
Salinibacterruber MDH 25 Q2S289
cMDHa:cytoplasticMDH.chMDHb:chloroplasticNADP灢MDH.cnMDHc:chloroplasticNAD灢MDH.mMDHd:mitochondrialMDH.
gMDHe:glyoxysomalMDH.栙:Thecrystalstructureofproteinhasbeensolvedtohighresolutionbyx灢raycrystallography
期 陈露露等 茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析
1 暋暋暋暋暋暋暋暋暋 : 暋暋暋暋暋暋暋暋暋3暋7
图 基于结构信息的 与其它 的多序列比对
4暋 Cs灢cMDH cMDHs
来自猪心的 登录号为 来自茶树的
Pig灢cMDH: cMDH暋 (GenBank P11708);Camellia灢cMDH: cMDH(GQ845406);Apple灢
来自苹果的 来自水稻的 来自大豆的
cMDH: cMDH(ABB36659);Rice灢cMDH: cMDH(AAG13573);Soybean灢cMDH: cM灢
来自烟草的 图中以猪心 三维结构 为基础 猪心
DH(AAS18241);Tobacco灢cMDH: cMDH(CAC12826)。 cMDH (5mdh) ,
的二级结构元件标注在序列顶端 完全保守的氨基酸残基以阴影表示 辅酶 的结合位点用三角形 表示
cMDH , , NAD+ (書) ;
指纹序列用星号 表示 底物结合位点用方块 表示 决定辅酶特异性的关键位点用五角星 表示 催化
MDH (*) ; (曵) ; (曪) ;
模体用井号 表示 半胱氨酸残基用 表示
(#) ; C 。
Fig灡4暋Structure灢basedmultiplesequencealignmentofCs灢cMDHandcMDHsfromothersources
Pig灢cMDH:cMDHfromporcineheart(GenBankaccessionnumberP11708);Camellia灢cMDH:cMDHfromCamelliasinensis
(GQ845406);Apple灢cMDH:cMDHfromMalusdomestica(ABB36659);Rice灢cMDH:cMDHfromOryzasativa(AAG13573);
Soybean灢cMDH:cMDHfromGlycinemax(AAS18241);Tobacco灢cMDH:cMDHfromNicotianatabacum(CAC12826).The
sequencealignmentwasbasedonthethree灢dimensionstructureofpigheartcMDH(5mdh).Thesecondarystructuralelementsof
Pig灢cMDH(PDB5mdh)areplacedabovethealignment.Thecompletelyconservedaminoacidresiduesareshaded.Thebinding
siteofcoenzymeNAD+wasrepresentedastriangles(書);thefingerprintsequenceofMDHwasrepresentedasasterisk(*);the
bindingsiteofsubstratewasrepresentedassquares(曵);thecriticalsiteofcofactorspecificitywasrepresentedasstars(曪);the
catalyticmotifwasrepresentedashashs(#);thecysteinewasrepresentedasC
云 南 植 物 研 究 第 卷
3暋8暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
图 亚基预测的三维结构立体视图
5暋Cs灢cMDH
图中 的 端和 端用相应的字母表示 螺旋用紫色螺旋表示 折叠用黄色箭头表示 转折和卷曲用青色绳索表示
Cs灢cMDH N C ,毩灢 ,毬灢 , ,
参与辅酶 结合的 指纹序列氨基酸用蓝色表示 参与底物结合的催化残基用红色表示
NAD+ MDH ,
Fig灡5暋Steoreoviewofpredictedthree灢dimensionstructureofCs灢cMDHsubunit
TheN灢andC灢terminiofCs灢cMDHwererepresentedincapitallettersNandC,respectively.The毩灢helixwasrepresentedinpurplehelix.
The毬灢sheetwasrepresentedinyellowarrow.Theturnandcoilwererepresentedincyanrope.ThefingerprintsequenceofMDH
involvedinthebindingsiteofcoenzymeNAD+wasrepresentedblue.Thebindingsitesofsubstratewererepresentedinred
讨论 氨基酸序列一致性分析显示 与
3暋 ,Cs灢cMDH
我国是茶树的原产地 是最早发现和利用茶 其它高等植物 的同源性很高 如与大豆
, cMDH , 、
树的国家 并把茶叶发展成为我国和东方乃至整 烟草 玉米 苹果 的序列一致性均为
, 、 、 cMDH
个世界的一种灿烂独特的茶文化 由于茶是一种 与动物 也具有较高的同
。 90%。Cs灢cMDH cMDH
重要的饮料并具有医学价值 茶树新基因的克 源性 如它与猪心 的序列一致性达
, , cMDH
隆 表达及功能鉴定工作也一直是分子生物学研 与植物叶绿体 的
、 60%。Cs灢cMDH NADP灢MDH
究的热点 包括茶树儿茶素类代谢相关基因克 序列一致性为 与植物 和
, 40%~41%, mMDH
隆 茶树咖啡碱合成相关基因克隆 茶树基础代 的同源性更低 一般不高于 因此
、 、 gMDH , 30%。
谢相关基因克隆 茶树抗逆性相关基因克隆等 初步推断我们获得了茶树细胞质
、 MDH。
陆建良等 在真核生物中 在细胞质和细胞器
( ,2007)。 ,cMDH
本研究进行了茶树基础代谢相关基因的克隆 之间底物和还原当量交换的多种穿梭系统中起重
和表达 我们利用 中已报道的植物细 要作用 如细胞质 是苹果酸 天冬氨酸穿
。 GenBank 。 MDH -
胞质 序列 设计简并性引物扩增得到茶树 梭系统中的关键酶之一 而这种穿梭系统对于调
MDH , ,
的保守片段 再采用 技术成功获 节和维持细胞质和线粒体中 比例
cMDH , RACE NAD/NADH
得 完 整 的 登 录 号 为 的平衡至关重要 等
Cs灢cMDH (Genbank (L湲pez灢Calcagno ,2009;
由于原核和真核基因在胞内环境存 等 最新的
GQ845406)。 Easlon ,2008;DingandMa,2004)。
在许多差异 以及被诱导的蛋白常常在短时间内 研究发现 苹果酸 天冬氨酸穿梭系统和甘油磷
, , -
大量产生以至于来不及正确折叠 所以真核基因 酸穿梭系统是酵母卡路里限制
, (caloriesrestric灢
在原核表达体系中往往形成包涵体而得不到可溶 介导的生命寿限延长的新调节因子 并
tions) ,
性的活性蛋白 实验中采取降低诱导温度 且在卡路里限制条件下 苹果酸 天冬氨酸穿梭
。 、 , -
梯度诱导 缩短诱导时间的方法 最终经 系统在 和 跨越线粒体膜的穿梭中
+
IPTG 、 , NAD NADH
于 诱导表达 后可 扮演着重要角色 等 研究还发
0灡5mmol·L灢1IPTG 32曟 3h (Easlon ,2008)。
以获得大量可溶性融合蛋白 图 生物信息 现 当葡萄糖缺乏时 细胞核质 可以调节
( 3)。 , , MDH
学分析显示该基因长 编码 个氨基 依赖的细胞周期捕捉和凋亡 暗示细胞核质
1235bp, 332 p53灢 ,
酸 蛋白质含有大量疏水性氨基酸 是 依赖性代谢检查点的转录调节因子
。Cs灢cMDH , MDH p53灢
数目高于其它植物 为疏水性蛋白 等 另外 对核酸选择性通
cMDH, 。 (Lee ,2009)。 ,cMDH
期 陈露露等 茶树胞质型苹果酸脱氢酶的原核表达及生物信息学分析
1 暋暋暋暋暋暋暋暋暋 : 暋暋暋暋暋暋暋暋暋3暋9
道 等 和糖异生功能 后 突变体酶对 的亲和性明显降低
41 +
(Hanss ,2002) (Gibson G , NAD ,
也有影响 而对 的催化效率明显提高
+
andMcAlister灢Henn,2003) 。 NADP (Nishiyama
目前植物中线粒体 叶绿体 等 因此我们推断 为茶树细
NAD灢MDH、 ,1993)。 Cs灢cMDH
以及微体 的研究已经 胞质 依赖型苹果酸脱氢酶
NADP灢MDH NAD灢MDH NAD灢 。
很广泛 但是其它类型的 研究得较少 尤 近几年茶树基因分离研究已取得了较大进
, MDH ,
其对 的研究甚少 植物 已经获得 展 但已经登录的茶树基因序列数与其它草本及
cMDH 。 MDH 。
高分辨率 衍射晶体结构的有黄顶菊 木本经济植物相比仍有较大差距 今后的研究主
X灢 (Flaveria 。
和高粱 的叶绿体 要包括茶树基因组计划研究 原创性基因的发
bidentis) (Sorghumbicolor) 、
西瓜 的乙 掘 充分利用已分离获得的大量模式植物的基因
NADP灢MDH、 (Citrulluslanatus) 、
醛酸体 等 信息等来加快茶树基因的分离工作等 陆建良
NAD灢MDH (Johansson ,1999;Carr (
等 等 但是植物细胞质 等 我们对茶树细胞质苹果酸脱氢酶的
,1999;Bryan ,2005), ,2007)。
和线粒体 至今缺乏晶体 研究为植物 的研究提供了更多信息 也
NAD灢MDH NAD灢MDH cMDH ,
结构数据 尤其是 中仅有猪心 为 的功能研究 晶体学研究及转基因
。 cMDH,PDB Cs灢cMDH 、
的晶体结构数据 等 植物研究奠定了基础
cMDH (Chapman ,1999)。 。
基于猪心 蛋白质结构
cMDH (PDBID
的多重氨基酸序列比对 预测 暡参 考 文 献暢
5mdh) , Cs灢cMDH 暋 暋 暋
为类似猪心 的二聚体 每个亚基包含
cMDH , 13
个 折叠及 个 螺旋 图
毬灢 13 毩灢 ( 4,5):Cs灢cMDH BirktoftJJ,FernleyRT,BradshawRAetal灡,1982,Aminoacid
包含典型的 指纹 序列
sequencehomologyamongthe2灢hydroxyaciddehydrogenase
MDH “ 暠 (fingerprint)
12 18 它在所有 中都相当保守 sequenceshomologyamongthe2灢hydroxyaciddehydrogena灢
G AAGQIG , MDH
等 等 等 ses:mitochondrialandcytoplasmicmalatedehydrogenases
(Johansson ,1999;Carr ,1999;Bryan , fromahomologoussystemwithlactatedehydrogenase[J].
和 是 结
12 18 130 132 +
2005)。G AAGQIG V AN NAD ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnit灢
合区 和 是 结合位
,D43、N106、Q113、 S242 NAD+ edStatesofAmerica,79:6166—6170
点 催化模体 184 188中的 188是 BryanC,MaMC,ToddWetal灡,2005.Organelleandtranslo灢
; (motif)I WGNH H
活性部位即质子受体 该位点在 中高度 catableformsofglyoxysomalmalatedehydrogenase:The
, cMDH
保守 等 和 是底 effectoftheN灢terminalpresequence[J].FEBSJournal,
93 99 163
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物结合位点 等 和所有植物
(Chapman ,1999); CarrPD.,VergerD,AshtonARetal灡,1999.Chloroplast
一样包含 个保守的 和 形
cMDH 6 Cys,C252 C293 NADP灢malatedehydrogenase:structuralbasisoflight灢de灢
成分子内部二硫键 参与形成分子间二硫键
331 pendentregulationofactivitybythioloxidationandreduc灢
,C
等 等 tion[J].Structure,7:461—475
(Satoshi ,2006;Dong ,1994)。
包含的 序列在所有 ChapmanAD,Cort湨sA,DaffornTRetal灡,1999.Structural
43 49
Cs灢cMDH D IPPAAE basisofsubstratespecificityinmalatedehydrogenases:crys灢
中都很保守 在一些细菌
NAD灢MDH , NAD灢MDH talstructureofaternarycomplexofporcinecytoplasmic
中为 氨基酸编号以嗜热菌
E41IPQAMK47 ( Ther灢 malate dehydrogenase,alpha灢ketomalonate and tetra灢
的 为准 但是在所有叶绿体 hydoNAD[J].JournalofMolecularBiology,285:703—
musflavus MDH ),
中均为 氨基 712
148 154
NADP灢MDH G SERSFQ (A) (
酸编号以黄顶菊 叶绿体 CholletR,VidalJ,O曚LearyMH,1996.Phosphoenolpyruvate
Flaveriabidentis NADP灢 carboxylase:aubiquitous,highlyregulatedenzymeinplants
为准 尤其是 中的 结构
43
MDH )。 Cs灢cMDH D , [J].AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecu灢
生物学分析认为 带负电荷的侧链占据了
Asp larBiology,47:273—298
NADP (H)的2曚灢磷酸基团需要的结构空间, DingY,MaQH,2004.Characterizationofacytosolicmalatede灢
所以导致所有的 只能以 +为辅 hydrogenasecDNAwhichencodesanisozymetowardoxalo灢
NAD灢MDH NAD
酶 等 等 实验证 acetatereductioninwheat[J].Biochimie,86(8):509—
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实 将 的 中的 突变为
41
, Thermusflavus MDH E DongL,FredJS,MarianneSetal灡,1994.Mechanismoflight
云 南 植 物 研 究 第 卷
4暋0暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋 暋 暋 暋 暋 暋 暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 32
modulation:identificationofpotentialredox灢sensitivecyste灢 L湲pez灢CalcagnoPE,MorenoJ,Cede昸oLetal灡,2009.Cloning,
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